李建晨，白偉紅，黑 靜，槐紅微

(河北科技大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河北石家莊 050018)

豬殃殃藥材質(zhì)量控制方法研究

李建晨，白偉紅，黑 靜，槐紅微

(河北科技大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河北石家莊 050018)

為了修訂豬殃殃原有標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于性狀方面的內(nèi)容，有效反映和控制藥材的內(nèi)在質(zhì)量，收集了10批豬殃殃藥材，對(duì)其性狀、專(zhuān)屬性鑒別、檢查項(xiàng)、指標(biāo)成分含量進(jìn)行了研究。采用薄層色譜進(jìn)行定性鑒別，高效液相色譜法測(cè)定綠原酸的含量。研究發(fā)現(xiàn)：TLC斑點(diǎn)清晰，分離度好；10批樣品中水分小于13.0%，總灰分小于16.0%，酸不溶性灰分小于3.5%，醇溶性浸出物小于7.0%，綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于0.1%。結(jié)果表明：所制定的豬殃殃藥材質(zhì)量控制方法，操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性良好，可為豬殃殃藥材的全面質(zhì)量控制提供依據(jù)。

中藥化學(xué)；豬殃殃；質(zhì)量控制方法；綠原酸；含量測(cè)定；高效液相色譜法

豬殃殃為茜草科植物豬殃殃Galium aparine L.var.tenerum(Gren.et Godr.)Rchb.的干燥全草，味辛，微寒，具有清熱解毒、利尿消腫、止血的功效，用于治療水腫、尿路感染、痢疾、便血尿血、跌撲損傷、癰腫疔瘡、蟲(chóng)蛇咬傷等。豬殃殃為常用中藥，也為藏族習(xí)用藥材，資源豐富，全國(guó)各地均產(chǎn)。有關(guān)豬殃殃的內(nèi)容收載于《中華人民共和國(guó)藥典》(1977年版)和《上海市中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(1994年版)，但標(biāo)準(zhǔn)中涉及的內(nèi)容較少，僅規(guī)定了其性狀特征，沒(méi)有藥材的專(zhuān)屬性鑒別、檢查項(xiàng)與含量測(cè)定項(xiàng)，不能有效地反映和控制藥材的內(nèi)在質(zhì)量[1-4]。

本文擬修訂豬殃殃原有標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于性狀方面的內(nèi)容，制定藥材的顯微鑒別、薄層鑒別以及含量測(cè)定方法，同時(shí)增加檢查項(xiàng)(水分、總灰分、酸不溶性灰分)及浸出物的測(cè)定，制定完善的豬殃殃藥材質(zhì)量控制方法，更好地對(duì)豬殃殃藥材進(jìn)行質(zhì)量控制[5-12]。豬殃殃藥材中主要含苯丙素類(lèi)、黃酮類(lèi)和環(huán)烯醚萜類(lèi)成分，其中的苯丙素類(lèi)化合物綠原酸具有抗菌、抗病毒、清除自由基和令中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮的作用[13]，為豬殃殃藥材的主要活性成分[14-19]。本文選取綠原酸作為定量控制的指標(biāo)成分。

1 主要儀器與藥品

Agilent 1200液相色譜儀，OLYMPUS CX22LED 顯微鏡，XP-205十萬(wàn)分之一電子分析天平，AL 204 分析天平，梅特勒-托利多公司提供。

豬殃殃對(duì)照藥材，由中國(guó)食品藥品檢定研究院購(gòu)得，批號(hào)為121513-200501；綠原酸對(duì)照品，由中國(guó)食品藥品檢定研究院購(gòu)得，批號(hào)為110753-201415；水，廣州屈臣氏食品飲料有限公司提供；乙腈，色譜純，德國(guó)MERCK公司提供；薄層板為硅膠GF254(MERCK)。

共收集10批藥材樣品，經(jīng)河北省藥品檢驗(yàn)研究院段吉平研究員鑒定為豬殃殃Galium aparine L.var.tenerum (Gren.et Godr.) Rchb.的全草。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀

本品莖細(xì)長(zhǎng)，呈方柱形，多分枝，直徑約1 mm，表面呈深褐色或綠褐色，四棱上生有倒生小刺；質(zhì)脆，易折斷，斷面中空；葉6～8枚輪生，無(wú)柄，葉片多為卷縮狀，易破碎，完整葉片展平后呈現(xiàn)為披針形或條狀倒披針形，長(zhǎng)1～2 cm，寬0.2～0.4 cm，兩面常有刺狀毛；聚傘花序腋生或頂生，花小，易脫落；果小，常呈二半球形，深褐色或綠褐色，密生白色鉤毛；氣微，味淡。

2.2 顯微鑒別

本品粉末呈灰褐色，葉上表皮細(xì)胞壁較平直，下表皮細(xì)胞壁呈波狀彎曲，氣孔不定式；莖表皮細(xì)胞類(lèi)長(zhǎng)方形，氣孔平軸式；纖維呈束或散在，直徑13～32 μm；導(dǎo)管多為螺紋和環(huán)紋導(dǎo)管，直徑5～27 μm；非腺毛，尖端彎曲如鉤狀或形似鳥(niǎo)嘴，長(zhǎng)70～440 μm，基部直徑26～110 μm。草酸鈣針晶呈束或散在，長(zhǎng)約100 μm。詳見(jiàn)圖1。

圖1 豬殃殃顯微鑒別Fig.1 Powder microscopic of Galii Aparinis Herba

2.3 薄層色譜鑒別

取豬殃殃藥材粉末1 g，加入甲醇30 mL，加熱回流提取30 min，過(guò)濾，將濾液蒸干。在殘?jiān)屑尤?0 mL水使之溶解，用10 mL石油醚(60～90 ℃)振搖提取，棄去石油醚層。將水層繼續(xù)用10 mL乙酸乙酯進(jìn)行振搖提取，分取乙酸乙酯層(水層備用)。將乙酸乙酯層蒸干，在殘?jiān)屑尤? mL甲醇使之溶解，作為供試品溶液。另取豬殃殃對(duì)照藥材粉末1 g，同法制得對(duì)照藥材溶液。依照薄層色譜法(《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則0502)試驗(yàn)，分別吸取上述2種溶液各3 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(三者體積比為8∶1∶0.1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，在紫外光(365 nm)下進(jìn)行檢視，供試品色譜與對(duì)照藥材色譜相對(duì)應(yīng)的位置顯示相同顏色的熒光斑點(diǎn)(見(jiàn)圖2 a))。

取上述備用水層溶液，加入正丁醇10 mL振搖提取，分取正丁醇層，蒸干，在殘?jiān)屑尤? mL甲醇使之溶解，作為供試品溶液。取對(duì)照藥材備用水層溶液，同法制備對(duì)照藥材溶液。依照薄層色譜法(《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則0502)試驗(yàn)，分別吸取上述2種溶液各2 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水(三者體積比為12∶3∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%(體積分?jǐn)?shù)，下同)硫酸乙醇溶液，于105 ℃加熱到斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色斑點(diǎn)(見(jiàn)圖2 b))。

圖2 豬殃殃藥材的薄層色譜圖Fig.2 TLC of Galii Aparinis Herba samples

2.4 檢查項(xiàng)及浸出物測(cè)定

以《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版四部通則為參照，進(jìn)行檢查項(xiàng)(水分、總灰分、酸不溶性灰分)和醇溶性浸出物(熱浸法)的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 10批樣品水分、總灰分等的測(cè)定結(jié)果

2.5 含量測(cè)定

2.5.1 色譜條件

Kromasil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸(二者體積比為13∶87)，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為 327 nm，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。在上述色譜條件下，各成分分離度良好，結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.5.2 對(duì)照品溶液的制備

取綠原酸對(duì)照品約10 mg，精密稱(chēng)定，置于25 mL的容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，制成每1 mL約含40 μg綠原酸的對(duì)照品溶液。

2.5.3 供試品溶液的制備

將豬殃殃藥材粉碎(過(guò)3號(hào)篩)，精密稱(chēng)取約1 g粉末，加入60%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲醇25 mL使之溶解，稱(chēng)重，浸泡30 min，超聲處理(200 W，40 kHz)30 min，放冷。用60%甲醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，將續(xù)濾液作為供試品溶液。

圖3 對(duì)照品和樣品HPLC圖Fig.3 HPLC chromatograms of standard solution and sample solution

2.5.4 線性關(guān)系考察

選取80 μg/mL綠原酸對(duì)照品溶液作為儲(chǔ)備液，分別精密吸取綠原酸儲(chǔ)備液1，2，4，5，6，8 mL，加入甲醇定容至10 mL，搖勻。進(jìn)樣量為20 μL，測(cè)定峰面積，繪制關(guān)于綠原酸質(zhì)量濃度與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為Y=163.44X-104.02，r=0.999 5。結(jié)果表明，綠原酸在8.01～64.08 μg/mL內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.5.5 精密度試驗(yàn)

取綠原酸對(duì)照品溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果表明，其精密度良好，峰面積的RSD值為0.45%。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液(編號(hào)為Ⅷ)，室溫放置，于0，4，8，12，16，24 h依次進(jìn)樣。結(jié)果表明，供試品溶液穩(wěn)定性良好，峰面積RSD值為1.38%。

2.5.7 重復(fù)性試驗(yàn)

平行取編號(hào)為Ⅷ的藥材粉末6份，每份約1 g，精密稱(chēng)定，按“2.5.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，配制成供試品溶液，按建立的色譜條件分別進(jìn)樣。結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好，峰面積RSD值為1.21%。

2.5.8 回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取編號(hào)為Ⅷ的豬殃殃藥材粉末9份，每份約0.5 g，精密稱(chēng)定，分為3組，分別加入低(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%)、中(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%)、高(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為120%)3種不同濃度的綠原酸對(duì)照品溶液，混勻，進(jìn)樣，計(jì)算回收率，結(jié)果如表2所示，得到的RSD值為1.24%，回收率為97.71%～101.33%，符合要求。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.5.9 樣品含量測(cè)定

精密稱(chēng)取各批次樣品1 g，按“2.5.3”項(xiàng)下的方法制備各批次藥材的供試品溶液，按建立的色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，樣品含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 豬殃殃含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討 論

在《中華人民共和國(guó)藥典》(1977年版)中豬殃殃藥材的原植物記載為豬殃殃Galium aparine L，而在《上海市中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(1994年版)以及《江西省中藥飲片炮制規(guī)范》(2008年版)中，原植物均記載為豬殃殃Galium aparine L. var. tenerum(Gren.et Godr.)Rchb.。參照《上海市中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(1994年版)，將原植物拉丁名定為豬殃殃Galium aparine L.var.tenerum(Gren.et Godr.)Rchb.。

本文修訂了藥材的性狀特征，結(jié)合對(duì)藥材的實(shí)際觀察，對(duì)《中華人民共和國(guó)藥典》(1977年版)豬殃殃性狀鑒別中葉片的刺狀毛以及果實(shí)的顏色進(jìn)行了修改：由原來(lái)的“邊緣及下表面中脈有倒生小刺”修改為“兩面常有刺狀毛”；將原來(lái)的果實(shí)顏色“綠褐色”修改為“深褐色或綠褐色”，使性狀描述更加準(zhǔn)確。制定了檢查項(xiàng)、浸出物、綠原酸含量的限度，利用各測(cè)定項(xiàng)限度，對(duì)藥材內(nèi)在質(zhì)量進(jìn)行更好的評(píng)價(jià)。

薄層鑒別是中藥材進(jìn)行定性鑒別的重要方法之一。本文薄層鑒別中對(duì)提取的溶劑、方法以及提取液的純化方法分別進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)甲醇作為提取溶劑時(shí)，采用加熱回流的方法能使藥材的提取更加完全。通過(guò)比較，發(fā)現(xiàn)萃取方法能夠有效除去低極性的雜質(zhì)，利用所含成分的差異，對(duì)乙酸乙酯提取部位和正丁醇提取部位分別進(jìn)行鑒別。通過(guò)2個(gè)薄層鑒別方法的建立，能夠?qū)λ幉倪M(jìn)行更多層次和比較全面的質(zhì)量控制。

參考菊花中綠原酸的含量測(cè)定方法[20]，對(duì)豬殃殃藥材中的綠原酸進(jìn)行含量測(cè)定，流動(dòng)相曾采用不同比例的乙腈-磷酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.1%磷酸(二者體積比為13∶87)為流動(dòng)相時(shí)，得到的綠原酸色譜峰的峰形與分離度較好，同時(shí)出峰時(shí)間亦較理想，故最終選其作為流動(dòng)相。通過(guò)對(duì)提取溶劑、提取方法及提取時(shí)間的考察，確定提取溶劑采用體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇，提取方法為超聲波提取，超聲時(shí)間為30 min。

本文所制定的豬殃殃藥材的質(zhì)量控制方法操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性良好，能夠?yàn)樨i殃殃藥材進(jìn)行全面質(zhì)量控制提供依據(jù)。

/References：

[1] 蔡小梅．豬殃殃化學(xué)成分的研究[D]．貴陽(yáng)：貴州大學(xué)，2009． CAI Xiaomei. Studies on Chemical Constituents of Galium Aparine[D]. Guiyang: Guizhou University, 2009.

[2] 倪志誠(chéng)．西藏經(jīng)濟(jì)植物[M]．北京：科學(xué)出版社，1990．

[3] 上海市衛(wèi)生局．上海市中藥材標(biāo)準(zhǔn)[M]．上海：上海市衛(wèi)生局，1994．

[4] 許亮，竇德強(qiáng)，康廷國(guó)，等．炒牛蒡子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J]．中成藥，2010, 32(4)：622-624． XU Liang, DOU Deqiang, KANG Tingguo, et.al. Study on quality standard of arctll fructus[J]. Chinese Traditional Patent Medicine, 2010, 32(4): 622-624.

[5] 徐國(guó)芳．中藥顯微鑒定的操作方法及顯微特征[J]．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2000, 11(7):631． XU Guofang. Operation method and microscopic characteristics of microscopic identification of traditional chinese medicine[J]. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research, 2000, 11(7): 631.

[6] 趙希賢，尤立華，楊秉呼，等．中藥薄層色譜鑒別檢驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題探討[J]．中國(guó)藥業(yè)，2013, 22(6): 2-4． ZHAO Xixian, YOU Lihua, YANG Binghu, et al. Discussion on common problems in identification of thin-layer chromatography of traditional Chinese medicine[J]. China Pharmaceticals, 2013, 22(6): 2-4.

[7] 李向軍，王超，王永，等．中藥薄層色譜影響因素分析及應(yīng)用[J]．中國(guó)藥業(yè)，2011, 20(14):13-15． LI Xiangjun, WANG Chao, WANG Yong, et al. Thin layer chromatography application in medicine and its influence factor analysis[J]. China Pharmaceticals, 2011, 20(14):13-15.

[8] 王麗萍，郭棟，王果，等．中藥綠原酸的研究進(jìn)展[J]．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011, 22(4):961-963． WANG Liping, GUO Dong, WANG Guo, et al. Advancement of chlorogenic acid in traditional chinese medicine[J]. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research, 2011, 22(4): 961-963.

[9] 李建晨，廖明麗，賈玉捷，等．雙黃連口服液中綠原酸含量的影響因素研究[J]．河北科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2015, 36(5):499-503． LI Jianchen, LIAO Mingli, JIA Yujie, et al. Study on the influence factors for chlorogenic acid content in Shuanghuang-lian oral liquid[J]. Journal of Hebei University of Science and Technology, 2015, 36(5): 499-503.

[10]柴江，王欣，楊芳，等．延齡草藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)方法的研究[J]．中國(guó)藥學(xué)雜志，2014, 49(24):2150-2154． CHAI Jiang, WANG Xin, YANG Fang, et al. Quantitative evaluation methodTrilliumtschonoskii[J]. Chinese Pharmaceutical Journal, 2014, 49(24): 2150-2154.

[11]嚴(yán)倩茹，郭偉魁．白芍飲片的質(zhì)量現(xiàn)狀與質(zhì)量控制方法研究進(jìn)展[J]．藥物評(píng)價(jià)研究，2015, 38(2):229-232． YAN Qianru, GUO Weikui. Advances in study on quality status and quality control of Paeoniae Alba Radix[J]. Drug Evaluation Research, 2015,38(2): 229-232.

[12]郝哲．河南蒲公英質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究[D]．鄭州：河南中醫(yī)學(xué)院，2010． HAO Zhe. Study on Quality Standard of Henan Dandelion[D]. Zhengzhou: Henan University of TCM, 2010.

[13]邢麗娜，周明眉，李云，等．綠原酸及其腸道代謝產(chǎn)物對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的作用和機(jī)制研究進(jìn)展[J]．中國(guó)中藥雜志，2015, 40(6): 641-643． XING Lina, ZHOU Mingmei, LI Yun, et al. Recent progress of potential effects and mechanisms of chlorogenic acid and its intestinal[J]. China Journal of Chinese Materia Medica[J]. 2015, 40(6): 641-643.

[14]中國(guó)科學(xué)院植物研究所．中國(guó)高等植物圖鑒[M]．北京：科學(xué)出版社，1975．

[15]GUVENALP Z,KAZAZ C, KAYA Y, et al. Phytochemical investigation on galium humifusum growing in Turkey[J]. Biochemical Systematics and Ecology, 2006,34: 894-896.

[16]李娟，陳春霞，皮慧芳，等．豬殃殃的生藥學(xué)研究[J]．中國(guó)藥業(yè)，2009, 18(20):65-66． LI Juan, CHEN Chunxia, PI Huifang, et al. Pharmacognostical study on Galium aparine L.[J]. China Pharmaceuticals, 2009,18(20): 65-66.

[17]楊娟，蔡小梅，穆淑珍，等．豬殃殃酚性成分研究[J]．中國(guó)中藥雜志，2009, 34(14)：1802-1803． YANG Juan, CAI Xiaomei, MU Shuzhen, et al. Phenolic compounds from Galium aparine var.tenerum[J]. China Journal of Chinese Materia Medica, 2009, 34(14): 1802-1803.

[18]蔡小梅，楊娟，饒瓊娟．豬殃殃黃酮類(lèi)成分研究[J]．中國(guó)藥學(xué)雜志，2009, 44(19):1475-1477． CAI Xiaomei, YANG Juan, RAO Qiongjuan. Studies on flavonoids from Galium aparine[J]. Chinese Pharmaceutical Journal, 2009,44(19): 1475-1477.

[19]喬衛(wèi)，張彥文，吳壽金，等．天然環(huán)烯醚萜類(lèi)化合物的生物活性[J]．國(guó)外醫(yī)藥·植物藥分冊(cè)，2001,16(2)：65-67．

[20]孫英英，崔永霞，劉偉．HPLC對(duì)不同品種菊花中綠原酸含量的測(cè)定[J]．中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011, 17(24)：83-84． SUN Yingying, CUI Yongxia, LIU Wei. Determination of chlorogenic acid from various species of chrysanthemum morifolium by HPLC[J]. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae, 2011, 17(24): 83-84.

Research on quality control method of Galii Aparinis Herba

LI Jianchen， BAI Weihong， HEI Jing， HUAI Hongwei

(School of Chemical and Pharmaceutical Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang， Hebei 050018， China)

In order to revise the original Galii Aparinis Herba standard on the nature of the content, and effectively reflect and control the inherent quality of herbs，ten batches of Galii Aparinis Herba are collected. The morphology, identification, inspection and the content of target components in these crude drugs are studied. TLC method is used to identify this crude drug. The contents of chlorogenic acid in these samples are determined by HPLC. The spot of TLC is clear and well-separated. According to the measurement results of the ten samples, moisture is not more than 13.0%, total ash is not more than 16.0%, acid-insolubal ash content is not more than 3.5%, and alcohol extracts content is not less than 7.0%. The content of chlorogenic acid is above 0.1%. The results show that the set of medicinal materials quality control has the characteristics of simple operation and good repeatability, and can provide the basis for the comprehensive quality control of Galii Aparinis Herba.

Chinese medicine chemistry； Galii Aparinis Herba； quality control method； chlorogenic acid； content determination； HPLC

1008-1534(2017)03-0162-05

2017-03-07;

2017-04-24；責(zé)任編輯：張士瑩

國(guó)家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專(zhuān)項(xiàng)(2014ZX09304307-002)；河北省中藥材標(biāo)準(zhǔn)研究項(xiàng)目

李建晨(1964—)，男，河北肅寧人，副教授，博士，主要從事天然藥物方面的研究。

E-mail:lijianchen152@hotmail.com

TQ46；R932

A

10.7535/hbgykj.2017yx03002

李建晨，白偉紅，黑 靜，等.豬殃殃藥材質(zhì)量控制方法研究[J].河北工業(yè)科技,2017,34(3):162-166. LI Jianchen，BAI Weihong，HEI Jing，et al.Research on quality control method of Galii Aparinis Herba[J].Hebei Journal of Industrial Science and Technology,2017,34(3):162-166.