金梅，康琳，孫東禹，樸君，樸敬愛，趙鳳琴

（遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/遼寧省生物技術(shù)與分子藥物研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連 116081）

慢病毒介導(dǎo)小鼠 K26/KAP26.1 基因過表達(dá)對(duì)相關(guān)基因的調(diào)控作用

金梅，康琳，孫東禹，樸君，樸敬愛，趙鳳琴

（遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/遼寧省生物技術(shù)與分子藥物研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連 116081）

【目的】利用慢病毒介導(dǎo)過表達(dá)技術(shù)，明確小鼠 K26 和 KAP26.1 基因過表達(dá)后對(duì)角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白基因 KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2、KAP11.1 和對(duì)骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因 BMP-4、BMPR-IB 的影響，探究小鼠絨毛細(xì)度變化的影響機(jī)制，達(dá)到人為調(diào)控（如慢病毒載體技術(shù)）使相關(guān)基因過表達(dá)，改善動(dòng)物絨毛品質(zhì)的目的，為哺乳動(dòng)物絨毛細(xì)度調(diào)控的研究奠定理論基礎(chǔ)，【方法】試驗(yàn)在遼寧省生物技術(shù)與分子藥物研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，小白鼠采自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，選取出生后 5 周齡昆明種雄鼠。在 Genebank 查找到小鼠基因 K26（Gene ID：NM_001033397）及 KAP26.1（Gene ID：NM_027105.2）序列，根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入生長(zhǎng)狀態(tài)良好的 293T 細(xì)胞，構(gòu)建小鼠 K26 和 KAP26.1 基因慢病毒過表達(dá)載體，將含有目的基因 K26 及 KAP26.1 的慢病毒表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染小鼠皮膚成纖維細(xì)胞，用熒光顯微鏡觀察其轉(zhuǎn)染情況，確定慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染成功后，從病毒感染后的細(xì)胞中抽提總 RNA，將 RNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA后放入 Eppendorf Realplex 熒光定量 PCR 儀，檢測(cè) K26 和 KAP26.1 基因過表達(dá)對(duì) KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2、KAP11.1、BMP-4和BMPR-IB 基因表達(dá)的影響。【結(jié)果】經(jīng) RT-PCR 檢測(cè)，證明小鼠慢病毒載體 pLenti6.3-K26-IRES-EGFP 和 pLenti6.3-K26.1-IRES-EGFP 構(gòu)建成功。經(jīng)熒光場(chǎng)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)目的慢病毒載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞 72h 時(shí)轉(zhuǎn)染率最高。經(jīng) PCR 檢測(cè)，證實(shí)包裝好的目的慢病毒 K26 及 KAP26.1 轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細(xì)胞 72 h 后轉(zhuǎn)染成功。經(jīng) RT-PCR 檢測(cè) 與 SPSS Statistics 19 軟件分析目的基因表達(dá)量與陽性對(duì)照組（空載體質(zhì)粒組，BLACK）、陰性對(duì)照組（小鼠表皮成纖維細(xì)胞，NC）表達(dá)量之間的顯著性差異，發(fā)現(xiàn) K26 基因過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致 KAP26.1 基因上調(diào)，反之亦然，說明 K26 和 KAP26.1 基因之間存在一定的協(xié)同作用；K26 和 KAP26.1 基因過表達(dá)后，均能導(dǎo)致 KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2、KAP11.1 基因下調(diào)；K26 基因過表達(dá)能使 BMP-4 基因表現(xiàn)為上調(diào)，而 BMPR-IB 基因表現(xiàn)為下調(diào)；KAP26.1 基因過表達(dá)時(shí)，BMP-4 和BMPR-IB 基因均表現(xiàn)為上調(diào)。【結(jié)論】K26 與 KAP26.1 基因在毛囊的內(nèi)根鞘中起到協(xié)同作用，K26和KAP26.1 基因的高表達(dá)會(huì)抑制 KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2、KAP11.1 基因的表達(dá)，影響 mTOR 下游蛋白合成信號(hào)，進(jìn)而起到調(diào)節(jié)絨毛粗細(xì)的作用；K26 和 KAP26.1 基因過表達(dá)均能使 BMP-4 基因表現(xiàn)為上調(diào)，BMP-4 是 BMP 信號(hào)通路的激活劑，能夠激活 BMP 信號(hào)通路向下游轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而影響到毛囊的發(fā)育周期； K26 基因過表達(dá)下調(diào) BMPR-IB 基因的表達(dá)，而 KAP26.1 基因過表達(dá)上調(diào) BMPR-IB 基因的表達(dá)，BMPR-IB 基因是 BMP 信號(hào)的Ⅰ型受體，當(dāng) BMPR-IB 受體減少時(shí)，會(huì)抑制 BMP 信號(hào)向下游轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而使絨毛生長(zhǎng)周期重新開始；當(dāng) BMPR-IB 受體增加時(shí)，會(huì)促進(jìn)下游信號(hào)分子轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響毛囊發(fā)育周期。說明 K26 和 KAP26.1 基因過表達(dá)均能激活 BMP 信號(hào)通路，并由 BMP 和mTOR 信號(hào)調(diào)節(jié) KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2、KAP11.1、BMP-4和BMPR-IB 基因的表達(dá)，但 K26 與 KAP26.1 基因?qū)MPR-IB 基因的相反調(diào)節(jié)作用有待深入研究。

慢病毒介導(dǎo)；K26/KAP26.1 基因；角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白基因；BMP信號(hào)通路

0 引言

【研究意義】利用慢病毒介導(dǎo)過表達(dá)技術(shù)，明確小鼠 K26 和 KAP26.1 基因過表達(dá)后對(duì)角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白基因 KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2、KAP11.1 和骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因 BMP-4、BMPR-IB 的影響，探究小鼠絨毛細(xì)度變化的影響機(jī)制。角蛋白（keratin）與角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白（KAPs）是哺乳動(dòng)物毛發(fā)纖維的主要組成成分，能夠維持毛囊的結(jié)構(gòu)，同時(shí)也是毛囊中表達(dá)最豐富的蛋白質(zhì)[1]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic proteins, BMPs）是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β （transforming growth factor-β, TGF-β）超家族中最大的分泌信號(hào)傳導(dǎo)分子家族[2]，其作用廣泛，不僅能影響動(dòng)物不同時(shí)期的生長(zhǎng)發(fā)育以及骨骼的形成，也是毛囊發(fā)育所涉及的信號(hào)分子之一[3-5]。角蛋白、角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白及骨形態(tài)發(fā)生蛋白在哺乳動(dòng)物皮膚細(xì)胞中的表達(dá)情況對(duì)哺乳動(dòng)物絨毛品質(zhì)有重要影響，可以通過人為調(diào)控（如慢病毒載體技術(shù)）使其中部分基因過表達(dá)，實(shí)現(xiàn)提高動(dòng)物絨毛品質(zhì)的目的，本研究對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)具有重要的理論和實(shí)踐意義。【前人研究進(jìn)展】NANASHIMA等證明了角蛋白基因 K2-K25 參與鼠的毛發(fā)生長(zhǎng)過程[6]。王杰等發(fā)現(xiàn)，角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白基因 KAP6.2 與羊毛細(xì)度存在相關(guān)性[7]；MICHAEL 等發(fā)現(xiàn)角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白基因 KAP7.1，KAP8.2 特異表達(dá)于人皮膚毛囊中，可能與毛發(fā)結(jié)構(gòu)的分化有關(guān)[8]；金梅等研究發(fā)現(xiàn)角蛋白基因 K26 在遼寧絨山羊毛囊內(nèi)根鞘上表達(dá)[9]，并在絨山羊皮膚細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了 K26，KAP26.1，KAP6.2，KAP7.1，KAP8.2 、KAP11.1 等基因的表達(dá)，經(jīng)生物信息學(xué)分析證實(shí)，這些基因?qū)q毛纖維直徑具有重要的調(diào)節(jié)作用[10]。SHUNSUKE 等發(fā)現(xiàn)角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白基因 KAP11.1 可能影響鼠的毛發(fā)結(jié)構(gòu)[11]；ROGERS等研究發(fā)現(xiàn)，K26.1 基因與人的毛囊生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)[12]。田月珍等應(yīng)用基因多態(tài)性技術(shù)分析內(nèi)蒙古細(xì)毛羊發(fā)現(xiàn)，K26 基因是調(diào)節(jié)羊絨細(xì)度性狀的分子標(biāo)記[13]。然而，上述角蛋白及角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白基因間相互作用關(guān)系的報(bào)道卻不多。BMP-4 和BMPR-IB 基因?qū)儆?TGF-β 超家族成員，與毛囊形態(tài)發(fā)生、發(fā)育和分化密切相關(guān)[14-15]；毛青青等以皮膚組織中構(gòu)建 BMP-4 基因的 siRNA 轉(zhuǎn)基因小鼠為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn) BMP-4 基因下調(diào)，小鼠毛囊數(shù)量增加，表明 BMP-4 基因抑制了毛囊形成[16]；樊振華等的研究證實(shí)BMP-4和BMPR-IB為羊和小鼠保守基因[17-18]。BMP 信號(hào)通路在毛囊生長(zhǎng)發(fā)育方面應(yīng)用較為經(jīng)典，其路徑為 BMP 與絲氨酸/蘇氨酸受體磷酸化位點(diǎn)結(jié)合，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到核內(nèi)與 Smad1、Smad5 和 Smad8 結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)下游信號(hào)分子轉(zhuǎn)錄。BMP-4 與 Wnt 信號(hào)通路中的 LRP-6 特異性結(jié)合能夠促進(jìn) DKK3 高表達(dá)，從而激活毛發(fā)的生長(zhǎng)周期，促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)[19]。DENG 等對(duì)人的毛囊再生研究中發(fā)現(xiàn)，mTOR complex 1（mTORC1）信號(hào)通路在毛囊干細(xì)胞中被激活，mTORC1 多個(gè)下游信號(hào)使毛囊發(fā)育自發(fā)進(jìn)入生長(zhǎng)期，如果將 mTORC1 信號(hào)抑制，毛囊將始終保持休止期[20]；相反，BMP 信號(hào)通路從休止期開始到休止期后期由強(qiáng)變?nèi)酰竭_(dá)臨界值后，能夠維持毛囊干細(xì)胞靜止，為毛發(fā)再生做準(zhǔn)備[21-22]。因此可以得知，mTOR 信號(hào)通過抑制 BMP 信號(hào)，使毛囊干細(xì)胞激活，進(jìn)入毛囊生長(zhǎng)期，實(shí)現(xiàn)毛發(fā)再生，說明毛囊生長(zhǎng)發(fā)育是多方信號(hào)相互作用產(chǎn)生的結(jié)果。慢病毒載體和其它病毒載體相比具有免疫原性弱，同時(shí)又能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂相的細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)，并能在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。慢病毒載體技術(shù)應(yīng)用廣泛，已經(jīng)成為生物及醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域較為重要的實(shí)驗(yàn)方法。YAMAGUCHI等通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證慢病毒載體比逆轉(zhuǎn)錄載體具有更高的轉(zhuǎn)染效率[23]。ZHANG 等研究了慢病毒載體干擾 TNF-α 上調(diào)PRDX6，其中 PRDX6 可以提高大鼠雙側(cè)后肢的運(yùn)動(dòng)功能，為臨床治療脊椎損傷疾病提供新的方法[24]。還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)通過制作含缺陷整合酶慢病毒載體的疫苗能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，并能將小鼠體內(nèi)的腫瘤消除，為人類治療腫瘤提供了新的途徑[25]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】大量的研究證明，角蛋白和角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白家族基因，以及 BMPs 及其所介導(dǎo)的信號(hào)通路都與毛囊的發(fā)育過程以及毛發(fā)的生長(zhǎng)情況密切相關(guān)，但是其間的相互影響及作用結(jié)果卻還未知?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究分別構(gòu)建小鼠 K26 和 KAP26.1基因的慢病毒表達(dá)載體，將含有目的基因 K26 及KAP26.1 的慢病毒表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染小鼠皮膚成纖維細(xì)胞，檢測(cè) K26 和 KAP26.1 基因過表達(dá)對(duì)KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2、KAP11.1、BMP-4和BMPR-IB 基因表達(dá)的影響，為角蛋白及角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白、骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因間相互聯(lián)系的研究奠定基礎(chǔ)，并對(duì)畜牧養(yǎng)殖過程中提高動(dòng)物絨毛品質(zhì)的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

293T 細(xì)胞（吉瑪生物技術(shù)有限公司，上海），PLenti6.3-MCS 質(zhì)粒（銳賽生物技術(shù)有限公司，上海），DH5α感受態(tài)細(xì)胞（全式金生物技術(shù)有限公司，大連），培養(yǎng)基 DMEM + 10% FBS + 1% P/S + 1% Glutamax（銳賽生物技術(shù)有限公司，上海），慢病毒包裝質(zhì)粒Mix（Invitrogen，美國(guó)），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（takara公司，大連）。

1.2 皮膚樣品采集及細(xì)胞培養(yǎng)

試驗(yàn)于2015年10月，在遼寧省生物技術(shù)與分子藥物研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。樣品采自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，于秋季選取出生后 5 周齡昆明種雄性小白鼠 5 只。初步滅菌后分別在其頸部（多毛區(qū)）剪取約 2 cm2的皮膚組織，用手術(shù)剪把皮膚塊剪至 1mm3。用組織塊貼附法原代培養(yǎng)小鼠細(xì)胞，接種皮膚塊 20 瓶。而后將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞在瓶?jī)?nèi)長(zhǎng)到 70%—80% 左右，進(jìn)行傳代，待傳到第三代細(xì)胞穩(wěn)定后用于試驗(yàn)。

1.3 小鼠目的基因的過表達(dá)慢病毒包裝及測(cè)定

1.3.1 質(zhì)粒準(zhǔn)備 將測(cè)序正確的 pLenti-K26-IRESEGFP（pLenti-KAP26.1-IRES-EGFP）和菌液劃線培養(yǎng)，挑單克隆接入含 Amp 的 LB，30℃ 搖菌過夜。用AXYGEN 質(zhì)粒中抽提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒抽提。測(cè)定質(zhì)粒濃度。

1.3.2 細(xì)胞準(zhǔn)備 轉(zhuǎn)染前一天，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的293T 細(xì)胞，棄舊培養(yǎng)液，加入 PBS 溶液洗滌細(xì)胞生長(zhǎng)面，棄去 PBS 溶液。每皿加入 1 mL 胰酶消化液，消化約 1 min 直到細(xì)胞收縮變圓，吸棄胰酶，加入 3 mL DMEM + 10% FBS 培養(yǎng)基，吹打數(shù)次，將皿底的細(xì)胞沖洗下來，重懸均勻。5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)約 24 h。

1.3.3 慢病毒包裝 在 GenBank 查找到小鼠基因K26（Gene ID：NM_001033397）及 KAP26.1（Gene ID：NM_027105.2）序列，根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物，并在引物片段上下游分別添加酶切位點(diǎn) PacI 和AscI，序列見表1。以PUC57-K26 及 PUC57-KAP26.1分別為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增目的片段，在目的片段兩端添加酶切位點(diǎn) PacI 和 AscI，PCR 擴(kuò)增其序列。37℃ 酶切 4—5 h 后，電泳分離酶切片段，切膠回收目的片段。T4 DNA ligase 連接上述酶切后的 PCR 產(chǎn)物及目的載體。將 10 μL 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐（Amp）抗性的 LB 平皿，37oC培養(yǎng)過夜。次日，挑取單菌落進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。將 PCR鑒定呈陽性的克隆接到 LB 液體培養(yǎng)基中，搖菌過夜，次日抽提質(zhì)粒。將菌落 PCR 呈陽性的質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，將菌落 PCR 和酶切鑒定均呈陽性的克隆測(cè)序并進(jìn)行序列比對(duì)。

1.3.4 病毒收獲與濃縮 轉(zhuǎn)染后 48 h，收集 293T細(xì)胞上清液，4°C 暫存。細(xì)胞更換新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至 72—80 h，收集病毒上清液，與第一次收集的混合，共 300 mL，于 4°C 3 000 r/min 離心10 min，除去細(xì)胞碎片。以醋酸纖維素膜的濾器過濾上清液于離心管中，4°C 22 000 r/min 離心 2 h。離心完畢后，小心取出離心管，棄上清液，每管用預(yù)冷的DMEM 基本培養(yǎng)基溶解沉淀。待病毒沉淀溶解完全后收集至 EP 管后分裝，-80°C 保存。

1.3.5 慢病毒滴度測(cè)定（qPCR 法） 感染前一天，用胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，準(zhǔn)備 5×105細(xì)胞/mL 的293T 細(xì)胞接種 24 孔板，每孔 0.5 mL。細(xì)胞接種后第二天，根據(jù)病毒的預(yù)期滴度，準(zhǔn)備 3 個(gè)無菌的 EP管，10 倍倍比稀釋慢病毒濃縮液。13 μL 慢病毒原液+ 117 μL DMEM → 10-1病毒液 13 μL 10-1病毒液+ 117 μL DMEM → 10-2病毒液 13 μL 10-2病毒液+ 117 μL DMEM → 10-3病毒液 13 μL 10-3病毒液+ 117 μL DMEM → 10-4病毒液 細(xì)胞換液，每孔內(nèi)加入 400 μL 無抗生素的 DMEM + 10 % FBS 培養(yǎng)液，除對(duì)照組外其余各孔均加入 polybrene 至終濃度為 8 μg·mL-1。各感染孔內(nèi)分別加入相應(yīng)稀釋度的病毒液及病毒原液 100 μL，放入 37℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)。感染 24 h后，換液，每孔內(nèi)加入 500 μL DMEM + 10% FBS + 1% P/S + 1% Glutamax，繼續(xù)放回培養(yǎng)箱內(nèi)。感染 72 h 后，每孔加 500 μL Trizol 裂解細(xì)胞，抽提RNA，經(jīng) DNase I 處理后將 RNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，qPCR 檢測(cè) WPRE 基因表達(dá)。

表1 目的基因引物Table 1 Primers of target gene

1.4 目的病毒及陰性對(duì)照慢病毒感染目的細(xì)胞

將細(xì)胞懸液接種于 6 孔培養(yǎng)板中（20 W 個(gè)/孔），37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。根據(jù)病毒滴度向細(xì)胞中分別加入適量的目的病毒和陰性對(duì)照病毒（MOI=30），同時(shí)加入終濃度為 8μg·mL-1的polybrene 增強(qiáng)感染 。感染 24 h 后更換無慢病毒的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。感染 72 h 后觀察慢病毒。

1.5 從病毒感染后的細(xì)胞中抽提總 RNA

將培養(yǎng)液去除后，用 PBS 潤(rùn)洗細(xì)胞；向培養(yǎng)板中加入 Trizol，使裂解液均勻分布于細(xì)胞表面，然后用移液槍吹打細(xì)胞使細(xì)胞脫落；將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，并用槍頭反復(fù)吹打直至裂解液中無明顯沉淀，在室溫下放置 5 min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離；每管加入 200 μL 氯仿，上下顛倒 EP 管 15 s，然后室溫靜置 15 min；4℃ 12 000 r/min離心 15 min；吸取上清液移至新的 1.5 mL lep 管，加入等體積 -20℃ 預(yù)冷的異丙醇，混勻后 -20℃ 沉淀 10 min；4℃ 12 000 r/min 離心 10 min；去上清液，加入1 mL 4℃ 預(yù)冷的 75% 乙醇，洗滌沉淀；4℃ 10 000 r/min 離心 5 min，棄上清液，室溫干燥；加入 20 μL RNase-free 水，至完全溶解，紫外分析測(cè)定所抽提RNA 的濃度。

1.6 RNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA

使用Trizol（takara公司）試劑提取提取目的基因總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。按照RT-PCR（寶生物公司）試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.7 Real-time PCR 檢測(cè)目的基因

使用Trizol試劑盒（Takara公司）提取目的基因總RNA 并 DNAse I處理，再按照RT-PCR試劑盒說明書（Takara公司）將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，每個(gè)樣本均做3個(gè)重復(fù)，引物序列如表2所述，試驗(yàn)前在普通PCR上進(jìn)行試驗(yàn)條件的優(yōu)化，包括退火溫度和引物濃度等。

2 結(jié)果

2.1 小鼠目的基因載體構(gòu)建

通過 RT-PCR 檢測(cè)小鼠 K26 及 KAP26.1 基因慢病毒載體構(gòu)建情況，發(fā)現(xiàn)目的基因的 PCR 擴(kuò)增位置（圖 1）與 PacI 和 AscI 對(duì)重組載體質(zhì)粒雙酶切后的擴(kuò)增位置一致（圖 2），即 K26 目的條帶的位置在 1 421 bp，K26.1 目的條帶的位置在 647 bp，結(jié)果表明小鼠慢病毒載體 pLenti6.3-K26-IRES-EGFP 和 pLenti6.3-K26.1-IRES-EGFP 構(gòu)建成功。

表2 目的基因引物Table 2 Primers of target gene

2.2 小鼠目的基因的過表達(dá)慢病毒包裝

轉(zhuǎn)染前 293T 細(xì)胞在顯微鏡明場(chǎng)下呈扁平形（圖3-A）；在熒光場(chǎng)下無熒光，（圖3-B）。以 Lenti-IRESEGFP NC 轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞為對(duì)照組（圖 3-C 和D），對(duì)比熒光場(chǎng)對(duì)照組細(xì)胞，K26 及 KAP26.1 慢病毒載體分別成功轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞熒光場(chǎng)出現(xiàn)熒光，結(jié)果表明小鼠 K26 及 KAP26.1 慢病毒包裝成功（圖3-H 和 L）。本試驗(yàn)對(duì)轉(zhuǎn)染慢病毒載體感染時(shí)間進(jìn)行驗(yàn)證，目的慢病毒轉(zhuǎn)染 72 h 的轉(zhuǎn)染率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于 48 h的轉(zhuǎn)染率，說明目的慢病毒載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞72 h轉(zhuǎn)染最好（圖3-E—L）。

將包裝好的目的慢病毒 K26 及 KAP26.1 轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細(xì)胞 72 h 后（圖 4），分別提取其總的RNA，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA 后，PCR 證實(shí) K26 病毒及KAP26.1 病毒轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細(xì)胞成功（圖 5）。

從慢病毒感染后小鼠皮膚成纖維細(xì)胞中 K26 和KAP26.1 基因的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果來看，小鼠 K26 和KAP26.1 基因過表達(dá)效果明顯，說明兩個(gè)基因的慢病毒質(zhì)量合格，感染細(xì)胞效果正常。

圖1 目的片段的 PCR 擴(kuò)增Fig. 1 PCR Amplification of target gene

圖2 重組克隆的酶切鑒定Fig. 2 Identification of recombinant clones by restriction enzyme digestion

2.3 小鼠目的基因過表達(dá)后對(duì)其他相關(guān)基因的影響

通過實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 測(cè)得目的基因的 Ct值，根據(jù) 2-ΔΔCt 法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，并計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)差，用 SPSS Statistics 19 軟件分析目的基因表達(dá)量與陽性對(duì)照組（空載體質(zhì)粒組，BLACK）、陰性對(duì)照組（小鼠表皮成纖維細(xì)胞，NC）表達(dá)量之間的顯著性差異（圖 6和7）。

如圖6結(jié)果所示，當(dāng)K26基因過表達(dá)后，KAP26.1基因與陽性對(duì)照組（空載體質(zhì)粒組，BLACK）、陰性對(duì)照組（小鼠表皮成纖維細(xì)胞，NC）相比，表達(dá)量顯著升高（P＜0.01）；BMPR-IB、KAP7.1、KAP8.2和KAP11.1 基因的表達(dá)與對(duì)陽性和陰性對(duì)照組相比明顯降低；BMP4 基因的表達(dá)與陽性對(duì)照組相比差異不大，但是與陰性對(duì)照組相比明顯升高；KAP6.2 基因的表達(dá)與陽性對(duì)照組相比無差異，但是與陰性對(duì)照組相比明顯降低。總體看來，當(dāng) K26 基因過表達(dá)后，BMPR-IB、KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2和KAP11.1 基因的表達(dá)下調(diào)，BMP4 基因的表達(dá)上調(diào)。如圖 7 結(jié)果所示，當(dāng) KAP26.1 基因過表達(dá)后，K26基因表達(dá)量明顯升高 （0.01＜P＜0.05），KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2和KAP11.1 基因的表達(dá)明顯下調(diào)，BMP4 和BMPR-IB 基因的表達(dá)明顯上調(diào)。

圖3 慢病毒載體轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞Fig. 3 Lentiviral vector was transfected into 293T cells ( ×100 )

圖4 慢病毒 K26 及 KAP26.1 轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細(xì)胞 72 hFig. 4 Lentivirus K26 and KAP26.1 were transfected into mice fibroblasts for 72 h

圖5 PCR 電泳圖Fig. 5 PCR electrophoresis

圖6 K26基因過表達(dá)對(duì)其它相關(guān)基因表達(dá)量的影響Fig. 6 Effects of K26 gene overexpression on the other related genes

3 討論

3.1 K26 和 KAP26.1 基因過表達(dá)

角蛋白和角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白兩類家族基因定位在同一物種不同的染色體上，經(jīng)過基因序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)它們基因排序的相似度極高，說明這兩類基因是同源性較高的保守基因[26-30]。結(jié)果表明，角蛋白基因 K26及角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白基因 KAP26.1 均在小鼠皮膚成纖維細(xì)胞中表達(dá)，K26 過表達(dá)后，KAP26.1 表達(dá)量相對(duì)上調(diào)；相應(yīng)地，KAP26.1 過表達(dá)后，K26 表達(dá)量也相對(duì)上調(diào)，說明 K26 及 KAP26.1 基因在小鼠皮膚成纖維細(xì)胞中存在協(xié)同關(guān)系。

圖7 KAP26.1 基因過表達(dá)對(duì)其它相關(guān)基因表達(dá)量的影響Fig. 7 Effects of KAP26.1 gene overexpression on the other related genes

有研究表明，Ⅰ 型角蛋白（如 K17）和 Ⅱ 型角蛋白集群（如 K1、K2、K5、K6a、K6b、K7、K8、K18、K71-K74和K76-K84）的減少，均能影響mTOR下游蛋白合成信號(hào)，導(dǎo)致角質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的總蛋白合成減少[31-32]。因此可以推測(cè)，K26與KAP26.1基因過表達(dá)會(huì)促進(jìn)mTOR下游合成蛋白信號(hào)，從而增加細(xì)胞內(nèi)蛋白合成。還有研究表明，K26與KAP26.1基因均在毛囊內(nèi)根鞘表達(dá)，參與調(diào)控不同種羊毛纖維細(xì)度[9,12-13]。由此可以通過生物技術(shù)調(diào)控動(dòng)物皮膚細(xì)胞中 K26和KAP26.1基因的表達(dá)量，達(dá)到人為調(diào)控哺乳動(dòng)物毛發(fā)直徑的目的。

3.2 K26 和 KAP26.1 基因過表達(dá)對(duì)其它角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白的影響

K26和 KAP26.1基因過表達(dá)后，均能導(dǎo)致KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2和KAP11.1基因表達(dá)下調(diào)，說明在小鼠皮膚成纖維細(xì)胞中，K26、KAP26.1、KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2和KAP11.1基因存在動(dòng)態(tài)的平衡關(guān)系，K26 和KAP26.1基因的高表達(dá)會(huì)抑制KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2和KAP11.1基因的表達(dá)，以恢復(fù)平衡狀態(tài)，這種變化的機(jī)制由特定的信號(hào)通路調(diào)節(jié)。

前人研究結(jié)果表明，KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2 和KAP11.1 參與了絨毛的形成，對(duì)絨毛細(xì)度有調(diào)控作用，K26 及 KAP26.1 基因在毛囊生長(zhǎng)不同時(shí)期的表達(dá)差異極其顯著，對(duì)毛囊的周期性變化具有十分重要的調(diào)節(jié)作用。因此，可以通過外源干擾，在毛囊發(fā)育的不同時(shí)期利用 K26 及 KAP26.1 基因過表達(dá)對(duì)其它基因的影響調(diào)控絨毛細(xì)度。

3.3 K26 和 KAP26.1 基因過表達(dá)對(duì) BMP 信號(hào)通路的影響

K26 和 KAP26.1 基因過表達(dá)均能使 BMP-4 基因表現(xiàn)為上調(diào)。BMP-4 是 BMP 信號(hào)通路的激活劑，激活 BMP 信號(hào)通路向下游轉(zhuǎn)導(dǎo)，因此 K26 和KAP26.1 基因過表達(dá)均能激活 BMP 信號(hào)通路。可以推斷，K26 和 KAP26.1 位于 BMP 信號(hào)通路的上游。KULESSA等研究發(fā)現(xiàn)，BMP 信號(hào)在毛囊休止期起主要作用[33]。因此，K26 或 KAP26.1 基因通過上調(diào) BMP-4 基因，激活 BMP 信號(hào)通路，進(jìn)一步影響到毛囊的發(fā)育周期。

K26 與 KAP26.1 基因?qū)?BMPR-IB 基因的表達(dá)產(chǎn)生不同作用，K26 基因過表達(dá)會(huì)下調(diào) BMPR-IB基因的表達(dá)，而 KAP26.1 基因過表達(dá)會(huì)上調(diào)BMPR-IB 基因的表達(dá)。BMPR-IB 基因是 BMP 信號(hào)的Ⅰ型受體，當(dāng) BMPR-IB 受體減少時(shí)，會(huì)抑制 BMP信號(hào)向下游轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而使絨毛生長(zhǎng)周期從新開始；當(dāng)BMPR-IB 受體增加時(shí)，會(huì)促進(jìn)下游信號(hào)分子轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響毛囊發(fā)育周期。K26 與 KAP26.1 基因?qū)MPR-IB 作用影響的機(jī)制有待深入研究，期望通過揭示這一機(jī)制為研究哺乳動(dòng)物毛囊生長(zhǎng)周期調(diào)節(jié)機(jī)制提供新的證據(jù)。

4 結(jié)論

K26和KAP26.1基因位于角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2、KAP11.1 基因和骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP-4、BMPR-IB 基因的上游，間接參與 mTOR 與BMP 信號(hào)通路。 K26 與 KAP26.1 之間存在一定的協(xié)同作用，K26 與 KAP26.1 過表達(dá)均可間接抑制mTOR 信號(hào)通路，從而影響小鼠絨毛粗細(xì)程度；K26 與 KAP26.1 過表達(dá)均可間接激活 BMP 信號(hào)通路，從而調(diào)控小鼠毛囊發(fā)育周期。所以，可以通過人為調(diào)控哺乳動(dòng)物皮膚細(xì)胞中 K26 和 KAP26.1 基因的表達(dá)，達(dá)到改善絨毛質(zhì)量的目的。

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（責(zé)任編輯 林鑒非）

Regulation of Related Genes by Lentivirus-Mediated K26/KAP26.1 Gene Overexpression in Mice

JIN Mei, KANG Lin, SUN DongYu, PIAO Jun, PIAO JingAi, ZHAO FengQin
(Liaoning Provincial Key Laboratory of Biotechnology and Drug Discovery, College of Life Science, Liaoning Normal University, Dalian 116029, Liaoning)

【Objective】Using the lentivirus-mediated overexpression technique, the aims of this study were at determining the effects of K26 and KAP26.1 gene overexpression on keratin-associated protein genes KAP6.2, KAP7.1, KAP8.2, and KAP11.1, and bone morphogenetic protein genes BMP4 and BMPR1B, and exploring the mechanism by which these genes influence hair fineness in mice, to achieve the goal of improving the quality of animal hair, to realize artificial regulation (such as lentivirus-mediated technology) of overexpression of some genes, and to lay a theoretical foundation for investigating the artificial regulation of mammalian hair fineness.【Method】In October, the experiment was conducted in Liaoning Provincial Key Laboratory of Biotechnology and Drug Discovery. The Kunming species mice aged five weeks were obtained from Experimental Animal Center of Dalian Medical University. The mice gene sequences of K26 (Gene ID: NM_001033397) and KAP26.1 (Gene ID: NM_027105. 2) were retrieved from Genbank, and the primers were designed according to the sequences of target genes. The healthy 293T cells were transfected with the plasmid to establish the vectors of mice K26 and KAP26.1 gene lentivirus overexpression, respectively, which were transfected into mice skin fibroblasts. Transfection efficiency was observed by quantitative fluorescence microscopy. After determining the success of lentivirus overexpression, the total RNA was extracted from the transfected cells, and after reverse transcription, the obtained cDNA was measured with the Eppendorf Realplex florescent quantitative PCR to detect the influence of K26 and KAP26.1 genes overexpression on KAP6.2, KAP7.1, KAP8.2, KAP11.1, BMP-4 and BMPR-IB gene expression 【Result】Proved by RT-PCR detection, mice lentivirus vectors pLenti6.3-K26-IRES-EGFP and pLenti6.3-K26.1-IRES-EGFP were established successfully. Compared by fluorescent field, the highest transfection rate of 293T cell transfected lentivirus vectors was reached after 72hr. Confirmed by PCR detection, packaged K26 and KAP26.1 lentivirus vectors transfected into mice fibroblast successfully after 72hr.Through RT-PCR detection and analyzed by SPSS 19 software, expression levels showed significant difference among the target genes, positive control group (empty plasmid, BLACK) and negative control group (mice skin fibroblasts, NC), indicating that after K26 overexpression, the expression level of KAP26.1 was up-regulated, and vice versa. This finding suggested synergy between K26 and KAP26.1. After K26 and KAP26.1 overexpression, the expression levels of KAP6.2, KAP7.1, KAP8.2, and KAP11.1 were down-regulated. After K26 overexpression, BMP4 gene expression increased, while BMPR1B gene expression decreased. After KAP26.1 overexpression, expression levels ofBMP4 and BMPR1B both were up-regulated. 【Conclusion】 K26 and KAP26.1 genes had a synergistic effect on the inner root sheath of the hair follicle by influencing the downstream protein synthesis signal of mTOR pathway. The high expression of K26 and KAP26.1 genes could inhibit the expression of KAP6.2, KAP7.1, KAP8.2, and KAP11.1 genes and thereby regulated hair fineness. Both K26 and KAP26.1 overexpression could up-regulate the expression level of BMP-4 gene which is the activator of BMP signaling pathway and could activate the BMP signaling pathway and then affected the growth of hair follicle cycle. K26 gene overexpression could down-regulate BMPR-IB gene expression, while KAP26.1 gene overexpression up-regulate BMPR-IB gene expression. BMPR-IB gene is the receptor I of the BMP signal. When BMPR-IB receptors decreased, the BMP downstream signal transduction will be inhibited, and then restarted hair growth cycle. When BMPR-IB receptors increased, the downstream signaling molecules transcription will be promoted, and then affected hair follicle growth cycle. Both K26 and KAP26.1 overexpression could activate BMP signaling pathway, and the expressions of KAP6.2, KAP7.1, KAP8.2, KAP11.1,BMP-4 and BMPR-IB genes were in turn regulated by the mTOR and BMP signaling pathways. But the opposite regulation effects of K26 and KAP26.1 genes on BMPR-IB gene still need to be further explored.

lentivirus-mediated; K26/KAP26.1 gene; keratin-associated protein gene; BMP signaling pathway

2016-04-28；接受日期：2016-11-03

國(guó)家自然科學(xué)基金（31172188）、大連市科技計(jì)劃（2013B12NC090）、遼寧省教育廳科研項(xiàng)目(L201683652)聯(lián)系方式：金梅，E-mail：jm6688210@163.com。通信作者趙鳳琴，E-mail：eco-env@163.com