袁敏，邢繼紅，王莉，葛偉娜，郭棣，張嵐

（1華北理工大學生命科學學院基因組學與計算生物學研究中心，河北唐山 063000；2河北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院真菌毒素與植物分子病理學實驗室，河北保定 071001）

擬南芥開花抑制因子TFL1與GRFs蛋白的相互作用

袁敏1，邢繼紅2，王莉1，葛偉娜1，郭棣1，張嵐1

（1華北理工大學生命科學學院基因組學與計算生物學研究中心，河北唐山 063000；2河北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院真菌毒素與植物分子病理學實驗室，河北保定 071001）

【目的】研究擬南芥開花抑制因子TFL1與2個GRFs家族成員GRF4和GRF7之間的互作關(guān)系，為進一步解析TFL1抑制植物開花的分子機制奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā恳詳M南芥cDNA作為模板，利用基因特異性引物，克隆TFL1、GRF4和GRF7，分別連接入門載體pCR8，經(jīng)菌落PCR擴增和測序鑒定分別獲得這3個基因的入門載體 TFL1-pCR8、GRF4-pCR8和 GRF7-pCR8。利用 LR重組的方法將上述 3個入門載體分別與目標載體pGADT7和 pGBKT7重組獲得酵母雙雜交試驗載體 TFL1-BD、GRF4-AD和 GRF7-AD。將 TFL1-BD載體分別與GRF4-AD或GRF7-AD載體共同轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細胞，于雙缺（-Leu/-Trp）培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)2—3 d直至長出酵母克隆，選取合適大小的酵母菌落轉(zhuǎn)移到雙缺（-Leu/-Trp）和四缺（-Leu/-Trp/-His/-Ade）缺陷培養(yǎng)基上，通過觀察酵母菌落的生長情況判斷TFL1與GRFs之間的互作關(guān)系。利用LR重組的方法將上述3個入門載體分別與目標載體px-nYFP和px-cYFP重組獲得TFL1-nYFP、TFL1-cYFP、GRFs-nYFP、GRFs-cYFP雙分子熒光互補試驗載體，并分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞。將轉(zhuǎn)化TFL1-nYFP或TFL1-cYFP載體的農(nóng)桿菌分別與轉(zhuǎn)化GRFs-nYFP或GRFs-cYFP載體的農(nóng)桿菌共注射煙草葉片，培養(yǎng)48 h后在熒光共聚焦顯微鏡下觀察煙草細胞中YFP熒光的表達情況。通過YFP熒光信號的有無來判斷TFL1與GRFs之間的互作關(guān)系?！窘Y(jié)果】成功克隆到擬南芥中的3個基因，分別是534 bp的TFL1、888 bp的GRF4和798 bp的GRF7，并分別獲得其入門載體（TFL1-pCR8、GRF4-pCR8和GRF7-pCR8）、酵母雙雜交試驗載體（TFL1-BD、GRF4-AD和GRF7-AD）和雙分子熒光互補試驗載體（TFL1-nYFP、TFL1-cYFP、GRFs-nYFP和GRFs-cYFP）。在酵母雙雜交試驗中，相較于陰性對照組，共同轉(zhuǎn)化TFL1-BD與GRFs載體的酵母菌落在雙缺（-Leu/-Trp）和四缺（-Leu/-Trp/-His/-Ade）培養(yǎng)基上都生長較好，結(jié)果表明TFL1與GRF4、GRF7在酵母中直接相互作用。在雙分子熒光互補試驗中，相較于陰性對照組，將轉(zhuǎn)化TFL1-cYFP載體的農(nóng)桿菌與轉(zhuǎn)化GRFs-nYFP載體的農(nóng)桿菌共注射煙草細胞之后均在煙草細胞核內(nèi)產(chǎn)生較強的YFP熒光信號；與此同時，將轉(zhuǎn)化TFL1-nYFP載體的農(nóng)桿菌與轉(zhuǎn)化GRFs-cYFP載體的農(nóng)桿菌共注射煙草細胞之后同樣在煙草細胞核內(nèi)產(chǎn)生較強的YFP熒光信號。結(jié)果表明，TFL1與GRF4、GRF7在煙草中直接相互作用。【結(jié)論】擬南芥開花抑制因子TFL1與GRFs家族的2個成員GRF4和GRF7均直接相互作用。

擬南芥；TFL1；GRFs；酵母雙雜交；雙分子熒光互補

0 引言

【研究意義】開花是高等植物生長發(fā)育進程中一個非常關(guān)鍵的階段，受多種因素的共同調(diào)控。絕大多數(shù)的植物在開花之前會持續(xù)一定時間的營養(yǎng)生長，不斷長出新的葉片。但是，當內(nèi)外因素變化時，尤其是光照時間長短的變化會導致植物結(jié)束營養(yǎng)生長階段進入生殖生長階段，繼而開花、結(jié)果、繁衍后代[1-6]。研究植物開花的分子機理、調(diào)控模式以及控制開花重要基因的功能，最終實現(xiàn)人為干預植物的開花時間以及花期長短將對園藝園林具有十分重要的意義。此外，人為調(diào)節(jié)農(nóng)作物的開花結(jié)果時間也將為農(nóng)業(yè)增產(chǎn)增收提供保障?！厩叭搜芯窟M展】在植物從營養(yǎng)生長到生殖生長這一成花轉(zhuǎn)化過程中，2個控制植物開花的同源基因 TERMINAL FLOWER 1 （TFL1）和FLOWERING LOCUS T（FT）扮演非常重要的角色[7-9]。二者同屬于磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白家族（phosphatidylethanolamine-binding protein，PEBP）[10]，盡管它們的氨基酸序列具有60%的同源性，但是發(fā)揮的生理功能截然相反，TFL1抑制開花，而FT促進植物開花[11-15]。近年來，關(guān)于這對同源基因發(fā)揮相反功能的分子機制研究已經(jīng)取得了一些突破性的進展。FT蛋白被稱作開花素，在植物葉片中合成，經(jīng)過韌皮部的運輸?shù)竭_植物的頂端分生組織處[7,16-18]。在頂端分生組織，F(xiàn)T蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族成員FD蛋白形成復合體調(diào)控下游基因AP1的表達[19-20]。在水稻中，過表達OsFD1與Hd3a（FT的同源基因）能夠上調(diào) OsMADS15的表達[21]。目前，在一些物種中研究者們進一步證實FD與FT蛋白之間并不直接互作，而是由GRFs蛋白作為媒介介導形成復合體發(fā)揮作用[22-24]。番茄中GRFs的同源基因GRF/74與番茄中FT的同源基因SP相互作用。在水稻中，已經(jīng)有4個GRFs的亞型被報道與FT的同源基因Hd3a相互作用[25-26]。GRFs蛋白是一類調(diào)節(jié)因子（general regulatory factors，GRFs），也被稱作14-3-3蛋白，擬南芥中存在從GRF1—GRF15共15個成員，廣泛參與調(diào)控生物體內(nèi)的多種生理、生化，以及信號轉(zhuǎn)導過程。比如，在 BR信號轉(zhuǎn)導過程中，轉(zhuǎn)錄因子BZR1存在磷酸化與脫磷酸化2種狀態(tài)。脫磷酸化狀態(tài)的BZR1能夠與下游基因的啟動子結(jié)合，調(diào)控基因表達。而磷酸化狀態(tài)的 BZR1會被 GRFs蛋白結(jié)合而滯留在胞質(zhì)內(nèi)，不能進入細胞核內(nèi)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的功能[27-28]。在擬南芥中，fd-2突變體植株晚花，tfl1-1突變體植株早花，而tfl1-1/fd-2雙重突變體植株并沒沒有表現(xiàn)出明顯的早花表型。由此說明，TFL1抑制開花可能也是依賴于FD的，TFL1也與FD形成蛋白復合體發(fā)揮功能[29-30]。【本研究切入點】擬南芥中TFL1與FD的作用是否同樣需要GRFs作為媒介介導？擬南芥中TFL1是否也像FT一樣與GRFs直接相互作用？關(guān)于這些問題目前還不十分清楚。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究擬采用酵母雙雜交和雙分子熒光互補（BiFC）2種技術(shù)研究擬南芥開花抑制因子TFL1與調(diào)節(jié)因子GRFs是否直接相互作用，分析擬南芥TFL1與FD之間的作用是否同樣需要GRFs作為媒介介導，為進一步解答FT與TFL1如何協(xié)調(diào)控制植物開花時間提供新的證據(jù)和見解。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2016年進行，載體PGBKT7和PGADT7，酵母菌株AH109由華北理工大學生命科學學院保存；酵母培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)化試劑購于美國 Clontech公司；LR克隆試劑盒（11791020）和 pCR8克隆試劑盒（K2520-20）購于美國Invitrogen公司；擬南芥Col-0種子購于ABRC。

1.2 TFL1與GRFs酵母雙雜交載體的構(gòu)建

從擬南芥葉片中提取總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄獲得其cDNA。使用TFL1特異性上下游引物擴增TFL1（表1），與載體pCR8連接，轉(zhuǎn)化DH5α，對長出的菌落進行菌落PCR檢測及測序，鑒定獲得TFL1入門載體（TFL1-pCR8）。利用 LR重組試劑盒，將TFL1-pCR8與目標載體PGBKT7進行LR重組獲得酵母雙雜交載體TFL1/PGBKT7（TFL1-BD）。利用同樣的方法分別將GRFs入門載體與酵母雙雜交載體PGADT7重組。

1.3 酵母雙雜交

將1 μg TFL1-BD和1 μg GRFs-AD質(zhì)粒加入200 μL酵母感受態(tài)細胞AH109中，室溫孵育1—2 h，42℃熱激30 min后，冰浴1—2 min。將酵母細胞涂布在-LT雙缺固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2—3 d直至長出酵母克隆。利用同樣的方法進行對照組TFL1-BD與AD、BD與AD、BD與GRFs-AD的轉(zhuǎn)化。選取雙缺培養(yǎng)基上生長較好的酵母單克隆于加有100 μL無菌水的EP管中混勻，吸取10 μL置于-LTHA四缺培養(yǎng)基，30℃繼續(xù)培養(yǎng)2—3 d觀察酵母生長情況。每個組合各選取3個酵母菌落作為3個重復。

表1 本研究所用引物Table 1 The primers used in this study

1.4 BiFC系統(tǒng)載體構(gòu)建

將入門載體TFL1-pCR8、GRFs-pCR8分別與目標載體px-cYFP和px-nYFP進行LR重組，獲得BiFC試驗載體 TFL1-cYFP、TFL1-nYFP、GRFs-cYFP、GRFs-nYFP，并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。

1.5 煙草葉片注射與YFP熒光信號觀察

室溫離心過夜培養(yǎng)的農(nóng)桿菌收集菌體，利用注射緩沖液（10 mmol·L-1MES，pH5.6；150 μmol·L-1acetosyringone；10 mmol·L-1MgCl2）洗滌菌體沉淀2—3次后重懸至菌液的OD600為0.6—0.8，室溫孵育4—6 h。將煙草從培養(yǎng)室取出，在試驗臺弱光條件下事先放置1—2 h，將要共同注射的2種農(nóng)桿菌菌液等體積混勻，然后用不帶針頭的注射器注射入煙草葉片下表皮，并做好標記。將注射好的煙草在試驗臺繼續(xù)弱光培養(yǎng) 1—2 h后放回正常光照條件下培養(yǎng)36—48 h。在注射過的煙草葉片上距離針孔周圍2—3 mm處剪下約1 cm見方的葉片，平放于載玻片上，然后熒光顯微鏡下觀察有無 YFP熒光信號。

2 結(jié)果

2.1 TFL1與GRFs酵母雙雜交載體的構(gòu)建

利用TFL1特異性引物擴增得到534 bp的基因片段（圖1-A），與入門載體pCR8連接，獲得TFL1的入門載體TFL1-pCR8（圖1-B）。將入門載體TFL1-pCR8與目標載體PGBKT7經(jīng)過LR重組反應獲得酵母雙雜交載體TFL1/PGBKT7（TFL1-BD）。

利用基因特異性引物擴增得到888 bp的GRF4 和798 bp的GRF7全長基因片段（圖2-A），分別連接入門載體pCR8，經(jīng)菌落PCR擴增檢測（圖2-B）和測序驗證獲得正確的入門載體 GRF4-pCR8和GRF7-pCR8。將這兩個入門載體分別與目標載體PGADT7重組，獲得酵母雙雜交載體GRF4-AD和GRF7-AD。

2.2 酵母雙雜交驗證TFL1與GRFs的相互作用情況

當所有酵母菌落在-LT雙缺培養(yǎng)基上生長較好時，通過觀察-LTHA四缺培養(yǎng)基上試驗組與對照組的酵母菌落生長情況判斷 TFL1是否與 GRFs直接互作。共同轉(zhuǎn)化陰性對照組 TFL1-BD與 AD、BD與GRFs-AD、BD與AD質(zhì)粒的酵母菌落在-LTHA四缺培養(yǎng)基上都不生長，而共同轉(zhuǎn)化 TFL1-BD與GRF4-AD或GRF7-AD質(zhì)粒的酵母菌落在LTHA上正常生長（圖3）。結(jié)果表明，在酵母中TFL1與GRF4、GRF7直接互作。

2.3 BiFC驗證TFL1與GRFs的相互作用情況

圖1 入門載體TFL1-pCR8的構(gòu)建Fig.1 Construction of TFL1-pCR8 entry vector

圖2 入門載體GRF7-pCR8和GRF4-pCR8的構(gòu)建Fig.2 Construction of GRF7-pCR8 and GRF4-pCR8 entry vectors

利用BiFC試驗驗證煙草中TFL1與GRFs是否直接相互作用。將轉(zhuǎn)化TFL1-cYFP質(zhì)粒的農(nóng)桿菌分別與轉(zhuǎn)化 GRFs-nYFP質(zhì)粒的農(nóng)桿菌共同注射煙草葉片下表皮，培養(yǎng)48 h后均在煙草細胞核內(nèi)有較強的YFP熒光信號（圖4-A）。所有的陰性對照組，即轉(zhuǎn)化 px-cYFP空載體的農(nóng)桿菌分別與轉(zhuǎn)化 GRF4-nYFP或GRF7-nYFP質(zhì)粒的農(nóng)桿菌共同注射煙草后沒有出現(xiàn)YFP熒光信號；轉(zhuǎn)化px-nYFP空載體與轉(zhuǎn)化TFL1-cYFP質(zhì)粒的農(nóng)桿菌共同注射煙草后也未出現(xiàn)YFP熒光信號（圖4-B）。

圖3 在酵母中TFL1與GRF4、GRF7直接互作Fig.3 TFL1 directly interacts with GRF4 and GRF7 in yeast two hybrid assays

為排除標簽造成假陽性結(jié)果的可能，試驗中交換標簽后重新利用BiFC試驗驗證了TFL1與GRFs的互作情況。將轉(zhuǎn)化TFL1-nYFP質(zhì)粒的農(nóng)桿菌分別與轉(zhuǎn)化GRF4-cYFP或GRF7-cYFP質(zhì)粒的農(nóng)桿菌共同注射煙草后仍然在細胞核內(nèi)出現(xiàn)較強的YFP熒光信號（圖 5-A）。所有的陰性對照組，即轉(zhuǎn)化 px-nYFP空載體的農(nóng)桿菌分別與轉(zhuǎn)化 GRF4-cYFP或 GRF7-cYFP質(zhì)粒的農(nóng)桿菌共同注射煙草后沒有出現(xiàn) YFP熒光信號；轉(zhuǎn)化px-cYFP空載體與轉(zhuǎn)化TFL1-nYFP質(zhì)粒的農(nóng)桿菌共同注射煙草后也未出現(xiàn)YFP熒光信號（圖5-B）。由此證實，在煙草中TFL1與GRF4、GRF7直接相互作用。

3 討論

蛋白質(zhì)互作是生命體一項基本的生命活動，幾乎發(fā)生在細胞中的每一個生理生化過程中，諸如 DNA的包裝、基因表達調(diào)控、細胞信號轉(zhuǎn)導等。確定蛋白質(zhì)間的相互作用在何時何處發(fā)生以及如何形成蛋白質(zhì)復合體將為闡明蛋白質(zhì)的生物學功能及其作用機制提供至關(guān)重要的線索。證實和闡明功能蛋白質(zhì)間的互作關(guān)系對于研究蛋白質(zhì)發(fā)揮的生物學功能，參與調(diào)控的生物學過程具有十分重要的意義。

目前，研究蛋白質(zhì)間互作的方法很多，如酵母雙雜交、雙分子熒光互補（BiFC）、免疫共沉淀和凝膠孵育等。其中，酵母雙雜交技術(shù)是研究蛋白質(zhì)間互作比較簡便和靈敏的一種方法，并且可以精確地測定蛋白質(zhì)之間微弱的相互作用，因其操作是在核酸水平上，不需要純化大量的蛋白質(zhì)，操作簡單容易[31]。研究者們已經(jīng)利用酵母雙雜交技術(shù)在蛋白質(zhì)組學、基因組學、細胞周期調(diào)控、細胞信號轉(zhuǎn)導等眾多領(lǐng)域取得了很重要的研究成果。但是，酵母雙雜交技術(shù)存在一些自身缺陷，很明顯的一個缺陷就是存在假陽性。所謂假陽性，即通過酵母雙雜交觀察到的蛋白質(zhì)間的相互作用在其他互作系統(tǒng)驗證中并不是陽性結(jié)果，在真實情況下不一定發(fā)生。因此，酵母雙雜交驗證的蛋白質(zhì)相互作用往往還需要其他的試驗證據(jù)進一步的支持。

雙分子熒光互補技術(shù)是近些年發(fā)展起來的一項新技術(shù)，該方法較直觀，利用熒光顯微鏡在最接近活細胞生理狀態(tài)的條件下直接觀察熒光信號的有無來判別目標蛋白質(zhì)間是否存在直接相互作用，該方法已逐漸成為研究活細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的動態(tài)關(guān)系和功能的一個強有力的工具[32]。但該技術(shù)存在的一個明顯缺陷也是假陽性的存在，熒光片段在沒有連接目標蛋白質(zhì)時也可能發(fā)生自發(fā)互補互作，這也是該技術(shù)中背景信號的主要來源。因此需要通過連接不發(fā)生互作的蛋白以及各種合適的陰性對照來排除這種假陽性結(jié)果。

圖4 在煙草中TFL1-cYFP與GRF4-nYFP、GRF7-nYFP直接互作Fig.4 TFL1-cYFP directly interacts with GRF4-nYFP and GRF7-nYFP in tobacco

本研究中，利用酵母雙雜交和雙分子熒光互補2種技術(shù)互為補充，互相印證，更加確定了結(jié)果的真實性和可靠性。研究結(jié)果為進一步解析 TFL1抑制植物開花的分子機制提供了新的證據(jù)，也為在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上人為控制農(nóng)作物的開花時間以及花期提供理論基礎(chǔ)。

圖5 在煙草中TFL1-nYFP與GRF4-cYFP、GRF7-cYFP直接互作Fig.5 TFL1-nYFP directly interacts with GRF4-cYFP and GRF7-cYFP in tobacco

4 結(jié)論

酵母雙雜交和雙分子熒光互補2個試驗共同證實了擬南芥開花抑制因子TFL1與調(diào)節(jié)因子蛋白GRFs家族的2個成員GRF4和GRF7直接相互作用，擬南芥中TFL1與FD之間的作用同樣需要GRFs作為媒介介導。

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（責任編輯 李莉）

Interaction Between TFL1 and GRFs in Arabidopsis thaliana

YUAN Min1, XING JiHong2, WANG Li1, GE WeiNa1, GUO Di1, ZHANG Lan1
(1Center for Genomics and Computational Biology, College of Life Sciences, North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, Hebei;2Mycotoxin and Molecular Plant Pathology Laboratory, College of Life Sciences, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, Hebei)

Arabidopsis thaliana; TFL1; GRFs; yeast two hybrid; BiFC

2016-11-25；接受日期：2017-02-13

國家自然科學基金（31401212）、河北省自然科學基金（C2014209134）、唐山市科技局項目（14130274a）

聯(lián)系方式：袁敏，E-mail：yuanmin308@163.com。邢繼紅，E-mail：13323221155@126.com。袁敏和邢繼紅為同等貢獻作者

Abstract:【Objective】The objective of this study is to identify whether the flowering repressor TFL1 interacts with the two GRFs family members GRF4 and GRF7, and to provide a basis for illustrating the mechanism of TFL1 repressing flowering. 【Method】The TFL1, GRF4 and GRF7 genes were cloned by specific primers using the Arabidopsis cDNA as the templates. These three genes were linked into pCR8 vector to get the entry vectors. The correct entry vectors TFL1-pCR8, GRF4-pCR8 and GRF7-pCR8 were obtained by colony PCR screening and sequencing. The yeast two hybrid assay vectors, including TFL1-BD, GRF4-AD and GRF7-AD, were obtained by LR reaction between these three entry vectors and the destination vectors pGADT7 or pGBKT7. The yeast competent cells which were co-transformed with TFL1-BD plus GRF4-AD or GRF7-AD vectors were incubated on –Leu/-Trp growth medium under 30℃ for 2-3 days until the yeast colonies show up. The yeast colonies in proper size were chosen and transferred to both –Leu/-Trp and -Leu/-Trp/-His/-Ade growth medium. The interaction between TFL1 and GRFs was determined through observing the growth conditions of those yeast colonies on -Leu/-Trp/-His/-Ade growth medium. The BiFC assay vectors, including TFL1-nYFP, TFL1-cYFP, GRFs-nYFP and GRFs-cYFP, were also obtained by LR reaction between these three entry vectors and the destination vectors px-nYFP or px-cYFP, and were transformed into Agrobacterium competent cells. The tobaccos, which were co-transformed by the Agrobacterium harboring TFL1-nYFP or TFL1-cYFP vector and the Agrobacterium harboring GRFs-nYFP or GRFs-cYFP vector, were grown for more 48 hours before observing YFP fluorescence signals under confocal microscopy. The interaction between TFL1 and GRFs was determined if the fluorescence signals in tobacco cells were observed under confocal microscopy.【Result】The three genes, including 534 bp TFL1, 888 bp GRF4 and 798 bp GRF7, were cloned successfully. The entry vectors (TFL1-pCR8, GRF4-pCR8 and GRF7-pCR8), yeast two hybrid assay vectors (TFL1-BD, GRF4-AD and GRF7-AD), and BiFC assay vectors (TFL1-nYFP, TFL1-cYFP, GRFs-nYFP and GRFs-cYFP) of the three genes were obtained successfully. Compared with the negative controls, the yeast colonies which were co-transformed with TFL1-BD plus GRFs-AD vectors grew well in both -Leu/-Trp and -Leu/-Trp/-His/-Ade media in yeast two hybrid assay. Compared with the negative controls, the obvious nuclear YFP fluorescence signals were observed in the tobacco cells which were co-transformed with the Agrobacterium harboring TFL1-cYFP vector or GRFs-nYFP vector. Meanwhile, the obvious nuclear YFP fluorescence signals were also observed in the tobacco cells which were co-transformed with the Agrobacterium harboring TFL1-nYFP vector or GRFs-cYFP vector.【Conclusion】The flowering repressor TFL1 directly interacts with the two GRFs family members GRF4 and GRF7 in Arabidopsis.