楊敏敏，劉紅艷，周婷，瞿洪浩，楊遠霄，魏鑫，左陽，趙應忠

（中國農(nóng)業(yè)科學院油料作物研究所/農(nóng)業(yè)部油料作物生物學與遺傳育種重點實驗室，武漢 430062）

芝麻栽培種與野生種（Sesamum indicatum）雜種F1的獲得及特性鑒定

楊敏敏，劉紅艷，周婷，瞿洪浩，楊遠霄，魏鑫，左陽，趙應忠

（中國農(nóng)業(yè)科學院油料作物研究所/農(nóng)業(yè)部油料作物生物學與遺傳育種重點實驗室，武漢 430062）

【目的】通過遠緣雜交獲得芝麻栽培種與野生種的雜交后代，改良芝麻栽培種對莖點枯病的抗性?！痉椒ā繉σ爸?號（S. indicatum）（P3）和芝麻栽培種中芝14（P1）、中芝14同源四倍體（P2）進行正反種間雜交，通過幼胚培養(yǎng)技術獲得雜種F1植株。首先利用SSR分子標記、細胞學、形態(tài)學方法進行后代真實性鑒定，篩選出真雜種。后對種間雜交的3個親本（野芝3號、中芝14及其同源四倍體）以及雜種后代F1株系進行莖點枯病人工接種鑒定?！窘Y果】種間正反交組合后代的幼胚成苗率有明顯差異，在接種的773個幼胚中，有155個幼胚發(fā)育成苗，平均幼胚成苗率為20.05%。種間正交組合（P3×P1、P3×P2分別為32.75%和21.11%），高于反交組合（P1×P3、P2×P3分別為 8.84%和 13.41%）。說明親本的基因型在很大程度上影響遠緣雜交的成苗率。P3×P1、P1×P3組合 F1植株染色體數(shù)目為42條；P3×P2、P2×P3組合F1染色體數(shù)目為55條，正反交雜種F1株系大部分花粉粒形態(tài)獨特，形狀規(guī)則但多無內(nèi)含物，為高度不育類型；部分F1株系有少量的可育花粉，為部分不育型。選用多態(tài)性較好的HS142引物在親本中芝14中能清晰的擴增出2條特異性條帶（約460和500 bp），在野芝3號則擴增出1條特異性條帶（約380 bp）。然后對12個后代進行鑒定，其中有10個雜種F1植株同時具有3條父、母本特異條帶，另2株僅出現(xiàn)母本或父本帶為假雜種。以高抗種質野芝3號為母本的種間雜交P3×P1、P3×P2后代染病的病斑長度分別為9.35和6.65 cm，反交組合后代的病斑長度分別為9.90和8.90 cm；所有雜交組合的后代對莖點枯病抗性均高于其栽培種親本（P114.30 cm和P211.46 cm），但低于野生種親本（P34.80 cm）?！窘Y論】通過種間雜交結合幼胚培養(yǎng)可以篩選出莖點枯病抗性明顯高于芝麻栽培親本的新種質。

芝麻；野生種；種間雜交；分子標記；莖點枯病抗性

0 引言

【研究意義】芝麻（Sesamum indicum L.）是中國重要的優(yōu)質油料作物，分布廣，但主要集中在江淮、黃淮地區(qū)，雨熱同季，易受到多種真菌、細菌病害的侵染，其中最嚴重的病害是莖點枯病（Macrophomina phaseolina Ashby）[1]。莖點枯病的病原菌主要通過種子、土壤及病殘體越冬傳播，能以菌核或分生孢子形式存活 10個月以上，侵染玉米、大豆、芝麻等 100多個屬的500多種作物[2-3]，一般造成減產(chǎn)10%—20%，嚴重時達到 80%以上[4]。因此，迫切需要選育高抗病或高耐病的芝麻品種。但是，現(xiàn)有芝麻栽培品種均來自于同一個種（S. indicum），遺傳基礎相對狹窄[5-6]?，F(xiàn)有的芝麻種質資源里缺少免疫類型，而高抗類型也很少，導致芝麻莖點枯病的遺傳改良無法取得突破性進展[4, 7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，芝麻屬中部分野生種具有高抗病抗逆等優(yōu)良特性[9-10]，因此，發(fā)掘、利用芝麻野生種的抗莖點枯病優(yōu)良基因，豐富芝麻栽培種的基因庫，是芝麻莖點枯病遺傳改良的重要途徑[3]。【前人研究進展】近30年來，國內(nèi)外的專家學者先后開展了大量的芝麻遠緣雜交研究，以期利用野生芝麻的優(yōu)良性狀。已有研究表明，芝麻種間雜交存在一定的雜交不親和性或雜種發(fā)育障礙，利用常規(guī)雜交方法很難獲得雜種后代[11-12]。借助胚胎培養(yǎng)拯救技術是獲得種間雜交后代的有效方法，已在野生種S. schinzianum、S. radiatum、S. alatum等與栽培種的雜交上取得成功[9, 12-15]。在雜交種真實性的鑒定上，除形態(tài)學觀察外，也普遍使用細胞學、分子標記等方法[9,13-15]。RAJESWARI等[13]以S. alatum和栽培種雜交，獲得抗變?nèi)~病材料?！颈狙芯壳腥朦c】盡管前人在一些芝麻野生種與栽培種的雜交上取得成功，但關于野芝3號（S. indicatum）莖點枯病的抗性轉移研究未見報道。【擬解決的關鍵問題】本研究通過對野芝3號與栽培種中芝14、中芝14同源四倍體進行種間雜交，借助幼胚培養(yǎng)技術及細胞學、分子標記、莖點枯病人工接種鑒定技術，獲得高抗莖點枯病新種質，為芝麻莖點枯病抗病育種提供基礎遺傳材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料親本為P1：中芝14（2n=26）、P2：中芝14同源四倍體（2n=52）、P3：野芝3號（2n=58 S. indicatum）。

莖點枯病抗性鑒定的對照材料：芝麻育種課題組經(jīng)過多年在湖北武漢病害鑒定圃鑒定出的穩(wěn)定新株系，包括抗病對照BJ2236、中抗對照BJ2018和感病對照BJ2002。

菌種：由河南省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所劉紅彥研究員提供。

1.2 種間雜交以及F1植株的獲得

種間雜交試驗于 2014年夏在中國農(nóng)業(yè)科學院油料作物研究所武昌基地進行。于開花前一天下午摘掉母本的花冠和雄蕊，第二天上午用父本花粉授粉。取雜交授粉后16 d的幼蒴，進行表面消毒，切開幼蒴，剝?nèi)∮着?，接種到幼胚誘導培養(yǎng)基上（MS+30 g·L-1蔗糖+8 g·L-1瓊脂粉+0.5 g·L-1GA3+1 g·L-16-BA，pH=5.8）。14 d后轉入分化培養(yǎng)基（MS+30 g·L-1蔗糖+8 g·L-1瓊脂粉+0.3 g·L-1IBA，pH=5.8）繼續(xù)培養(yǎng)，20 d后在生根培養(yǎng)基（MS +30 g·L-1蔗糖+8 g·L-1瓊脂粉+0.5 g·L-1NAA，pH=5.8）上壯苗生根，直至發(fā)育成幼苗，控制溫度28—30℃、光周期8—16 h·d-1、光照強度1 500—2 000 lx。將雜種F1植株在室內(nèi)自然光下開瓶煉苗2—3 d，洗凈附著在其表面的培養(yǎng)基，將其移栽到裝有營養(yǎng)土（泥炭﹕珍珠巖﹕蛭石＝1﹕1﹕1）的穴盤中，在27—30℃、60%—70%相對濕度條件下培養(yǎng)5 d后帶土移栽大田。幼胚萌發(fā)并形成健壯小苗時統(tǒng)計幼胚成苗率。

1.3 細胞學觀察

以植株花期的子房為材料，進行細胞有絲分裂觀察。子房的大小為2 mm左右，在解剖鏡下除去花藥，常溫下用0.002 mol·L-18-羥基喹啉混合液避光處理4 h，加入新鮮卡諾固定液（冰乙酸﹕無水乙醇=1﹕3）在 4℃冰箱中固定 18—24 h。清水沖洗后，轉入 1 mol·L-1HCl 60℃恒溫解離8 min，用蒸餾水漂洗，卡寶品紅染色，蒸餾水壓片，敲片，鏡檢時取30個分裂相良好的細胞觀察染色體的形態(tài)，統(tǒng)計染色體數(shù)目，用OLYMPUS顯微鏡（BX-51）拍照。

1.4 DNA提取、檢測和SSR分析

選取健康無病害供試材料的幼嫩葉片50 mg，參照 PATERSON等[16]改良的 CTAB法提取基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩ｋS機從已合成的EST-SSR引物中挑選265對引物[17]進行雙親之間的多態(tài)性篩選。通過選用與雙親有特異性標記的引物對雜種 F1進行分子鑒定。PCR擴增反應體系和擴增程序參考WU等[17]。擴增產(chǎn)物在 6%聚丙烯酰胺凝膠中電泳，銀染，檢測，同時具有父母本特異性帶的即為真雜種。

1.5 形態(tài)學觀察

2015年夏分別在現(xiàn)蕾期、花期和成熟期調(diào)查后代植株及親本形態(tài)性狀，主要包括植株生長習性、株型、莖稈顏色、花冠長唇緣顏色、每葉腋花數(shù)、花粉粒育性、蒴果形狀、單株蒴果數(shù)、種皮顏色、全生育期等。

1.6 莖點枯病抗性鑒定

2016年對抗病、中抗、感病等3個穩(wěn)定的對照材料、種間雜交的3個親本（野芝3號、中芝14及其同源四倍體）以及雜種后代F1株系進行莖點枯病菌的接種抗性鑒定。參考王建方[18]的接菌方法，在盛花期進行，每個材料接種5株，重復3次，掛牌記錄。選取滅菌后的棉花，在菌絲液中浸泡待用，取滅菌后的鑷子在芝麻莖桿中下部戳一個3 mm左右的小孔，用棉花蘸取菌液對小孔周圍進行均勻涂抹，高度為2 cm。對照：只涂抹無菌水。在7 d后進行植株發(fā)病情況調(diào)查記錄，參照江詩洋等[19]的方法測量發(fā)病植株的病斑長度，結果取平均值。在SPSS軟件上進行差異顯著性方差分析，用Origin軟件繪圖。

2 結果

2.1 種間雜交

野芝3號（P3）與栽培種（P1和P2）共配制4個正、反雜交組合，授粉511朵花，獲得277個蒴果。在田間自然條件下，雖然能獲得蒴果但是蒴果成熟后多數(shù)癟而小，內(nèi)無籽或僅有一兩粒種子，多數(shù)無發(fā)芽能力。而采用胚胎拯救技術對授粉后16 d的幼胚進行組織培養(yǎng)，在接種的773個幼胚中，有155個幼胚發(fā)育成苗，平均幼胚成苗率為20.05%（表1）。發(fā)現(xiàn)正反交組合的幼胚成苗率存在明顯差異，以野芝3號為母本組合（P3×P1、P3×P2）的幼胚成苗率均高于其反交組合（P1×P3、P2×P3），其中，P3×P1組合成苗率高達32.75%。以野芝3號為父本的反交組合的幼胚成苗率均低于平均值，其中較高的P2×P3組合成苗率為13.41%。結果表明，親本的基因型在很大程度上影響遠緣雜交的成苗率。

2.2 種間雜種F1的細胞學和分子標記鑒定

對野芝3號與中芝14、中芝14同源四倍體以及種間雜交后代的子房有絲分裂中期染色體數(shù)目進行統(tǒng)計，結果表明，P3×P1、P1×P3組合F1植株染色體數(shù)目為42（圖1-A4）。P3×P2、P2×P3組合F1染色體數(shù)目為55（圖1-A5）。正反交雜種F1株系大部分花粉粒形態(tài)獨特，形狀規(guī)則但多無內(nèi)含物，為高度不育類型；部分F1株系有少量的可育花粉，為部分不育型（圖1-B4—圖1-B5）。調(diào)查發(fā)現(xiàn)F1植株在田間有自交結實現(xiàn)象，F(xiàn)1植株自交所得籽粒顏色分離，體積較大，部分飽滿，有一定的萌發(fā)率。

從265對SSR引物[17]進行的雙親多態(tài)性篩選中，檢測出12對標記在親本間具有多態(tài)性。選用其中部分多態(tài)性較好的SSR標記對種間正反交F1株系進行分子鑒定。圖 2中所用的引物為 HS142（F：5′-ATT GTCGTTGTCGTTGTCGT-3′，R：5′-AACTCCATCAA CCTATGCCC-3′）。

表1 野芝3號與2個栽培種種間雜交后代成苗率比較Table 1 Comparison of the seedling ratios among the reciprocal crosses between No.3 wild sesame and the two cultivated accessions

圖1 親本及種間雜交后代的染色體和花粉粒比較Fig. 1 Chromosome and pollen comparison between parents and interspecific hybrids

圖2 種間雜種F1的SSR標記擴增圖譜（HS142）Fig. 2 Detection of F1interspecific hybrids by SSR marker (HS142)

如圖2所示，HS142引物在親本中芝14中能清晰地擴增出2條特異性條帶（約460 bp、500 bp），在野芝3號則擴增出1條特異性條帶（約380 bp）。12個后代中，有10個雜種F1植株同時具有3條父、母本特異條帶，另2株僅出現(xiàn)母本或父本帶。結合其他引物PCR結果，判定該10株為真雜種，另外2株為假雜種。田間觀察發(fā)現(xiàn)，假雜種表型性狀與父本或母本無差異，證實了PCR結果。

2.3 雜種F1形態(tài)學特征

隨機選取20個正反雜交組合的F1植株，分別在現(xiàn)蕾期、花期和成熟期觀察其形態(tài)特征（表 2），正反交雜種F1的蒴果形狀、葉片基部邊緣鋸齒狀、每葉腋花數(shù)為單花等都趨向于親本野芝3號；花冠長唇緣顏色淺紫、莖稈顏色淺紫等則介于雙親之間（圖3）。不同正反雜交組合的雜種F1植株生長習性、株型、全生育期、種皮顏色等性狀均存在差異，如以野芝3號為母本的組合P3×P1、P3×P2雜種F1植株形態(tài)上表現(xiàn)為匍匐型、分枝，種皮顏色均為黑色，與野生種親本相似；反交組合P1×P3的雜種F1種皮顏色為白色，與栽培種親本相似；植株形態(tài)則大部分為半直立，株型也多為單稈或少分枝，性狀居于兩親本之間（表2）。

2.4 親本及雜種F1莖點枯病抗性鑒定

芝麻莖稈在傷口處涂抹菌液后，傷口附近會形成棕黑色病斑并逐漸擴大，接菌3 d后感病材料BJ2002開始出現(xiàn)侵染癥狀，病斑迅速擴大；抗病材料BJ2236病斑擴大比較緩慢，而野芝3號（P3）以及其種間雜交后代傷口的棕黑色病斑無明顯變化；接菌7 d后，不同對照材料的病斑長度差異非常明顯，因此，作為品種抗性評價的依據(jù)。由圖 4可見，抗病對照材料BJ2236的病斑長度為11.41 cm；中抗對照材料BJ2018的病斑長度為15.03 cm；感病對照材料BJ2002的病斑長度為19.52 cm，3個對照材料的染病結果與之前多年的人工病圃鑒定結果表現(xiàn)基本一致，說明此試驗準確性較好，用于芝麻莖點枯病抗性鑒定是合適的。

本研究結果顯示，抗病、中抗、感病對照材料、3個親本以及雜種 F1對莖點枯病菌的抗性存在顯著差異。親本野芝3號（P3）的抗性與抗病對照材料BJ2236有顯著差異，抗性最強；中芝14（P1）與中抗對照材料BJ2018無顯著差異；同源四倍體（P2）與抗病對照材料BJ2236無顯著差異。中芝14（P1）的病斑長度顯著高于同源四倍體（P2）的病斑長度（14.30 cm＞11.46 cm），說明同源四倍體的抗性要顯著強于中芝14。后代中，P3×P2的雜種F1病斑最短為6.65，顯著低于其他雜交組合后代和抗病對照材料的病斑長度；其他雜交組合F1的病斑長度為8.90—9.90 cm，顯著低于抗病對照材料BJ2236。野芝3號與同源四倍體的后代在莖點枯抗性上均強于與中芝14雜交的后代。同樣的親本，以野芝3號為母本的正交組合在后代莖點枯抗性上均強于其反交組合。所有正反雜交的雜種 F1抗病性均超過其栽培種親本。

3 討論

芝麻野生種中具有很多栽培種缺乏的優(yōu)異性狀，尤其是抗病抗逆性，通過遠緣雜交的方式將其優(yōu)異基因轉移到栽培種中，是創(chuàng)造種間遺傳變異、豐富種質資源、改良芝麻抗性最有效的途徑[5,14, 20-21]。由于芝麻種間雜交存在嚴重的生殖隔離、雜種胚敗育等問題[14, 22]，對種間雜種后代性狀改良及利用研究的報道不多。本研究結果顯示，在自然狀態(tài)下野芝3號（S. indicatum）與栽培種雜交存在受精后的幼胚發(fā)育障礙，雜種幼胚發(fā)生敗育。利用幼胚培養(yǎng)拯救技術顯著提高獲得種間雜交后代成功率，這也是開展遠緣雜交普遍采用的方法[23-24]。

在幼胚培養(yǎng)條件下，種間雜交組合正反交雜種胚的發(fā)育程度也存在很大的差異。染色體多的野生種作母本與栽培品種雜交其雜種胚更容易成苗。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，將染色體少的栽培種預先加倍，使得染色體數(shù)目接近野生種的染色體數(shù)目，也可以提高F1幼胚成苗率，這與張海洋等[15]的研究報道一致。由SSR分子鑒定結果可知，種間雜種F1都有野芝3號的特異性帶型，說明后代存在野芝3號的遺傳物質，為芝麻遠緣雜交后代鑒定提供了依據(jù)。

本文所用親本野芝3號（S. indicatum，2n=58）植株匍匐，分布于印度，S. prostratum是野生種，分布于印度、非洲，植株匍匐，不易受病蟲害影響，抗旱性也強，系栽培種（n=13）×S. prostratum（n=16）后代加倍獲得的雙二倍體[25]。已有研究表明，多倍體可通過表觀遺傳變異產(chǎn)生新的表現(xiàn)型，且能夠將這種改變通過有性生殖傳遞給后代，從而提高基因表達的多樣性，且多倍體物種比其二倍體祖先更能適應環(huán)境的變化[26]。本研究中芝 14同源四倍體對莖點枯病的抗性要強于中芝14，且與野芝3號雜交的后代植株在莖點枯病抗性上也要強于其他雜交組合。

本研究通過野芝3號分別與中芝14、中芝14同源四倍體正反雜交，利用幼胚培養(yǎng)技術獲得了真雜種F1株系，通過人工接菌，鑒定出了高抗莖點枯病的雜種F1株系，正反雜種F1的莖點枯病抗性均介于兩親本之間且高于其栽培種親本，說明芝麻莖點枯病抗性可能由多基因控制，野芝3號是抗性提高的重要供體。研究發(fā)現(xiàn)雜交后代的抗性水平受到雙親抗性的影響，選擇抗性較好的雙親在培育抗莖點枯病中起著重要的作用。

表2 種間雜種后代及親本特征比較Table 2 Morphological comparison between the parents and hybrids

圖3 種間雜交F1與親本的生物學性狀比較Fig. 3 Morphological comparison between the F1interspecific hybrids and the parents

圖4 基于3個對照、3個親本、4個雜交后代的莖點枯病病情指數(shù)Fig. 4 Disease index of charcoal rot on 3 control materials, 3 parents and 4 hybrids

4 結論

通過幼胚培養(yǎng)技術成功獲得芝麻栽培種與野生種的種間雜交F1株系，并通過形態(tài)學、細胞學和分子標記等方法得到證實。雜種F1的莖點枯病抗性介于雙親之間，但明顯強于其栽培種親本。

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（責任編輯 李莉）

Production and Identification of F1Interspecific Hybrid Between Sesamum indicum and Wild Relative S. Indicatum

YANG MinMin, LIU HongYan, ZHOU Ting, QU HongHao, YANG YuanXiao, WEI Xin, ZUO Yang, ZHAO YingZhong
(Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Oil Crops, Ministry of Agriculture, Wuhan 430062)

【Objective】 The progenies of Sesamum indicum and wild species were obtained by interspecific hybridization in order to improve charcoal rot disease (Macrophomina phaseolina) resistance of sesame cultivars. 【Method】 No.3 wild sesame (S. indicatum) (P3), Zhongzhi 14 (P1) and autotetraploid of Zhongzhi 14 (P2) were used as reciprocal cross parents, the F1plants of interspecific hybrids were obtained using the immature embryo culture technique. First, the authenticity of F1progenies were confirmed by using phenotypic, cytological and SSR marker methods in order to screen out the true hybrids . Then the three parents of the interspecific hybrids (No.3 wild sesame, Zhongzhi 14 and autotetraploid of Zhongzhi 14 )and hybrids of F1lines resistance toMacrophomina phaseolina was identified by artificial inoculations. 【Result】The seedling ratios of immature embryos between reciprocal combinations existed significant difference. The 773 immature embryos were inoculated of which 155 embryos developed into seedlings and the average seedling rate was 20.05%. The seedling ratios of combinations (P3×P132.75%, P3×P221.11%) were higher than those of reciprocal combinations (P1×P38.84%, P2×P313.41%). This indicates that the genotype of the parent affects the seedling rate of distant hybridization to a large extent. The number of chromosomes in the F1plants of (P3× P1, P1× P3) was 42 and in the F1plants of (P3× P2, P2× P3) was 55. The majority of the pollen grains of the F1hybrids were regular but no inclusions, all of which were highly sterile. HS142 primer with a better polymorphism could be clearly amplified two specific types in Zhongzhi14 (about 460 bp and 500 bp) and the one in No.3 wild sesame(about 380 bp) .Then, it could be used to identify twelve hybrid progenies and their parents. There are ten of F1progenies with three male and female-specific markers of the parents, the other two plants only appeared in the female parent or male parent type which was the fake hybrids. The infected lesion length of progenies from interspecific hybridization P3×P1, P3×P2, using No.3 wild sesame with high charcoal rot resistance as female parent, was 9.35 cm and 6.65 cm, respectively, while 9.90 cm and 8.90 cm from reciprocal combinations. The resistance to Macrophomina phaseolina of progenies from all combinations was higher than their cultivated parents (P114.30 cm and P211.46 cm), but weaker than wild relative (P34.80 cm). 【Conclusion】 New germplasms with high charcoal rot resistance can be created through interspecific hybridization combined with immature embryo culture, which provides important materials for genetic improvement of sesame with charcoal rot resistance.

sesame; wild species; interspecific hybridization; molecular marker; charcoal rot resistance

2016-12-16；接受日期：2017-02-17

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項（CARS-15）、中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP-2013-OCRI）

聯(lián)系方式：楊敏敏，E-mail：hbyangmm@163.com。通信作者趙應忠，E-mail：zhaoyz63@163.com