李小杰，馬建強(qiáng)，姚明哲，陳亮

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所 國(guó)家茶樹(shù)改良中心，浙江 杭州 310008

茶氨酸合成酶基因的SNP挖掘和遺傳定位

李小杰，馬建強(qiáng)，姚明哲*，陳亮*

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所 國(guó)家茶樹(shù)改良中心，浙江 杭州 310008

茶氨酸合成酶（Theanine synthetase, TS）基因是茶樹(shù)茶氨酸代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶基因。本研究以氨基酸含量差異明顯的親本及其雜交所得F1子代為研究材料，克隆TS基因的cDNA序列，挖掘其SNPs位點(diǎn)，并成功將雜合SNP位點(diǎn)定位在遺傳連鎖群上。研究結(jié)果顯示，通過(guò)序列比對(duì)在親本間檢測(cè)到3個(gè)SNPs，驗(yàn)證得到1個(gè)雜合的位點(diǎn)SNP735。將此位點(diǎn)成功轉(zhuǎn)化為dCAPS標(biāo)記，該標(biāo)記在子代中的基因型分離比為1∶1，利用該群體已構(gòu)建的茶樹(shù)遺傳圖譜進(jìn)行遺傳定位，將dCAPS標(biāo)記定位在連鎖群LG03上，相鄰標(biāo)記為T(mén)M299和TM517。聯(lián)合此標(biāo)記及其相鄰標(biāo)記與游離氨基酸總含量和茶氨酸含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，表明具有顯著的相關(guān)性。

茶樹(shù)；TS；SNP；dCAPS標(biāo)記；定位；茶氨酸

游離氨基酸是影響茶葉品質(zhì)的主要功能成分之一，其中茶氨酸是茶葉的標(biāo)志性物質(zhì)，占游離氨基酸總量的50%～70%[1-3]，具有降血壓與安神等特殊的生理功能[4]，是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。

茶氨酸合成酶（Theanine synthetase, TS）是茶樹(shù)茶氨酸合成代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一。Yukitaka等[5]最先從茶樹(shù)嫩梢中克隆出兩條茶氨酸合成酶基因序列TS1和TS2，并通過(guò)原核表達(dá)方法證實(shí)它們具有茶氨酸合成酶的活性，其登錄號(hào)分別為DD410895和DD410896。李娟等[6]克隆了TS1的cDNA全長(zhǎng)序列（JN226569）。在NCBI已經(jīng)收錄的茶樹(shù)基因序列中，TS基因與部分谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase, GS）基因（AB115183、JQ925873）序列相似性較高，推測(cè)TS基因可能是GS基因家族成員。陳琪等[7]利用原核表達(dá)和生物信息學(xué)方法對(duì)TS1（DD410895）和GS（AB115184）進(jìn)行功能驗(yàn)證與結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析，認(rèn)為兩個(gè)基因開(kāi)放閱讀框（Open read frame, ORF）序列內(nèi)3個(gè)堿基的差異，造成了二者功能的不同，并初步推斷TS基因?qū)儆贕S基因家族成員。由于目前茶樹(shù)尚無(wú)參考基因組序列，TS基因的功能與其來(lái)源問(wèn)題仍需要深入研究。

本研究以茶樹(shù)品種迎霜（YS）與北躍單株（BD）及其雜交所得F1代為材料，通過(guò)克隆TS基因的cDNA序列，進(jìn)行SNPs挖掘與分析，將檢測(cè)到的SNP位點(diǎn)轉(zhuǎn)化為dCAPS標(biāo)記，對(duì)F1群體進(jìn)行基因型鑒定，實(shí)現(xiàn)TS基因在遺傳圖譜上的定位，并驗(yàn)證了dCAPS標(biāo)記與游離氨基酸總含量和茶氨酸含量變異的相關(guān)性，以期為茶樹(shù)分子標(biāo)記輔助育種提供一定的理論基礎(chǔ)[8-10]。

1 材料與方法

1.1 材料

以茶樹(shù)品種迎霜與北躍單株及其雜交所得F1代為試驗(yàn)材料，采摘長(zhǎng)勢(shì)一致的茶樹(shù)葉片，用液氮冷凍處理，保存在－80℃中備用[11]。

1.2 方法

1.2.1 目標(biāo)基因的擴(kuò)增

采用RNA提取試劑盒RNApure Plant Kit (DNase I)（康為），按說(shuō)明書(shū)操作提取親本及F1代葉片的RNA。用微量紫外檢測(cè)儀ND-1000UV-Vis測(cè)定其濃度和純度，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。采用cDNA合成試劑盒 PrimeScript?II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Takara)，將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并稀釋到200 ng·μL-1待用。

TS基因參考序列登錄號(hào)為JN226569。采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增所用的特異引物，其中TS-10引物參考李娟等[6]發(fā)表的序列，引物序列詳見(jiàn)表1，由上海華津生物技術(shù)公司合成。PCR擴(kuò)增體系為50 μL，其中10×PCR Buffer 5 μL，dNTP（2 mmol·L-1）5 μL，MgSO4（1.5 mmol·L-1）3 μL，模板cDNA 2 μL，上、下游引物（10 mmol·L-1）各1.5 μL，KOD-Plus-Neo酶（1 U·μL-1）1 μL，加水至終體積50 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 2 min；98℃ 10 s，55℃ 30 s，68℃ 30 s，68℃ 7 min，30個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，120 V電壓電泳30 min后進(jìn)行鑒定[12-13]。將具有目標(biāo)單一條帶的PCR產(chǎn)物送交上海華津生物公司測(cè)序。

1.2.2 SNPs挖掘與dCAPS標(biāo)記的轉(zhuǎn)化

利用序列比對(duì)軟件Seqman比較親本及子代PCR產(chǎn)物測(cè)序峰圖，進(jìn)行SNPs挖掘。當(dāng)同一位置的測(cè)序峰圖出現(xiàn)差異，即視為SNP位點(diǎn)；當(dāng)同一位點(diǎn)呈大小相近的雙峰，即視為雜合SNP位點(diǎn)[14-15]。對(duì)篩選出的SNP雜合位點(diǎn)（表2），利用dCAPS Finder 2.0（http://helix. wustl.edu/dcaps/dcaps.html）和Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行錯(cuò)配引物和序列另一側(cè)引物的設(shè)計(jì)[16-17]。共設(shè)計(jì)了5對(duì)引物，詳見(jiàn)表3。PCR反應(yīng)體系50 μL，其中10×PCR Buffer (Mg2+plus) 5 μL，dNTP Mixture (2.5 mmol·L-1each) 4 μL，模板cDNA 2 μL，上、下游引物（10 mmol·L-1）各1 μL，Taq酶（5 U·μL-1）0.25 μL，加水至終體積50 μL。PCR反應(yīng)程序：98℃ 2 min；98℃ 10 s，61℃ 30 s，72℃30 s，72℃ 7 min，30個(gè)循環(huán)。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定，反應(yīng)體系20 μL，其中PCR產(chǎn)物10 μL，Buffer 2 μL，限制性內(nèi)切酶Eco47 III (Takara) 1 μL，ddH2O 7 μL。酶切反應(yīng)溫度37℃，反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)5 h。酶切產(chǎn)物用2.2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

表1 引物信息Table 1 The information of primers

表2 SNPs位點(diǎn)信息Table 2 The information of SNPs locus

表3 dCAPS標(biāo)記引物信息Table 3 The information of dCAPS marker primers

1.2.3 酶切帶型分析與基因定位

為了驗(yàn)證酶切結(jié)果的準(zhǔn)確性，將F1子代酶切前的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。通過(guò)序列峰圖比對(duì)，檢測(cè)每個(gè)子代的測(cè)序峰圖與酶切結(jié)果是否一致。統(tǒng)計(jì)子代基因型數(shù)據(jù)，結(jié)合該群體構(gòu)建的遺傳圖譜[18]，利用JoinMap軟件將雜合SNP位點(diǎn)轉(zhuǎn)化的dCAPS標(biāo)記定位到圖譜上。

1.2.4 dCAPS標(biāo)記與氨基酸含量的相關(guān)性分析

按照《茶樹(shù)種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》中描述的方法采制茶樣[19]，采摘春季一芽二葉。用烘干機(jī)120℃熱風(fēng)殺青5 min，80℃烘干至恒重，制成生化茶樣。樣品提取與測(cè)定參考GB/T 30987—2014[20]，儀器為賽卡姆全自動(dòng)氨基酸分析儀（s433D）；所用試劑購(gòu)自賽卡姆（北京）科學(xué)儀器有限公司。

利用MapQTL6軟件，分析dCAPS標(biāo)記及其在連鎖群上的相鄰標(biāo)記與茶氨酸含量及游離氨基酸總含量的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNPs挖掘

在11對(duì)PCR特異引物中，篩選出5對(duì)引物（表1）能擴(kuò)增出目標(biāo)序列單一條帶。最終選擇能擴(kuò)出單一條帶，且測(cè)序峰圖質(zhì)量好的TS-10引物對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物測(cè)序長(zhǎng)度約980 bp，位于TS基因的開(kāi)放閱讀框中（TS基因的開(kāi)放閱讀框?yàn)? 071 bp）。對(duì)親本測(cè)序峰圖進(jìn)行比對(duì)，共檢測(cè)到3個(gè)SNPs位點(diǎn)，其中在ORF序列第735和947位發(fā)生了轉(zhuǎn)換（C/T），第516位發(fā)生了顛換（C/G）（表2）。第735位的SNP確認(rèn)為雜合位點(diǎn)，其中“YS”基因型為雜合（C/T），“BD”基因型為純合（CC），子代基因型表現(xiàn)為雜合（C/T）或者純合（CC）（圖1）。

圖1 SNP735雜合位點(diǎn)的驗(yàn)證Fig. 1 Testing for the heterozygous SNP735

2.2 dCAPS標(biāo)記的轉(zhuǎn)化與在F1中的分離

經(jīng)過(guò)電泳鑒定，5對(duì)dCAPS引物均能獲得目標(biāo)序列單一條帶。經(jīng)過(guò)酶切實(shí)驗(yàn)篩選，選擇條帶最清晰、最易鑒定帶型的MY1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖2），相應(yīng)的Eco47Ⅲ作為反應(yīng)時(shí)的限制性內(nèi)切酶，成功將TS基因的SNP雜合位點(diǎn)轉(zhuǎn)化為dCAPS標(biāo)記。

對(duì)親本和148個(gè)子代的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切分析，發(fā)現(xiàn)與測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果一致。對(duì)F1子代個(gè)體基因型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)在群體中的分離比接近于1∶1，驗(yàn)證了該SNP雜合位點(diǎn)的可靠性。

2.3 基因定位及dCAPS標(biāo)記與茶氨酸的相關(guān)性

利用JoinMap軟件進(jìn)行連鎖分析，結(jié)果顯示基于雜合位點(diǎn)SNP735轉(zhuǎn)化的dCAPS標(biāo)記被定位在連鎖群LG03[18]上（圖3）。由圖3可以看出，TS基因位于3號(hào)連鎖群上約40 cm的位置，相鄰的兩個(gè)標(biāo)記分別是TM299和TM517。

MapQTL6軟件檢驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)1群體茶氨酸、游離氨基酸含量變異與該dCAPS標(biāo)記及其相鄰的TM299和TM517標(biāo)記存在顯著相關(guān)性。但由于茶氨酸、游離氨基酸含量易受環(huán)境影響，不同年份間性狀與標(biāo)記的關(guān)聯(lián)表現(xiàn)不穩(wěn)定（表4）。

圖2 F1子代PCR產(chǎn)物和Eco47Ⅲ酶切結(jié)果Fig. 2 The PCR products and the results of restriction endonuclease digestion byEco47Ⅲ in the F1generation

圖3 TS基因在遺傳圖譜第3號(hào)連鎖群上的定位Fig. 3 Mapping ofTSgene on LG03 linkage group

表4 Kruskal-Wallis檢驗(yàn)Table 4 Kruskal-Wallis test

3 討論

本研究通過(guò)對(duì)一個(gè)F1群體進(jìn)行TS基因的cDNA序列分析，開(kāi)發(fā)SNPs位點(diǎn)，在基因的編碼區(qū)第735位核苷酸位點(diǎn)發(fā)掘到1個(gè)SNP雜合位點(diǎn)，成功地轉(zhuǎn)化為dCAPS標(biāo)記。結(jié)合該群體的茶樹(shù)遺傳圖譜，將此標(biāo)記定位到了第3號(hào)連鎖群上；聯(lián)合氨基酸表型數(shù)據(jù)與該標(biāo)記及其在連鎖群上的相鄰標(biāo)記進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，表明具有顯著的相關(guān)性。為茶樹(shù)分子標(biāo)記輔助育種奠定了一定的理論基礎(chǔ)[21-22]。

茶氨酸含量是典型的數(shù)量性狀，前人研究表明茶氨酸的合成是以谷氨酸和乙胺為底物，在茶氨酸合成酶的催化下生成茶氨酸[23-24]。NCBI收錄的茶氨酸合成酶基因序列已有3條，均為cDNA序列。Deng等[25]研究了茶籽苗各部位茶氨酸合成酶基因的表達(dá)差異，結(jié)果表明TS1在新梢中表達(dá)量高于其他部位，根部相對(duì)較低；TS2在新梢和根系中表達(dá)量相同，但在子葉中的轉(zhuǎn)錄水平較低。李春芳等[26]對(duì)茶樹(shù)的13個(gè)組織部位進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，共在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋得到9個(gè)候選茶氨酸合成酶基因（TS），其中有3個(gè)基因在所有檢測(cè)的組織中均有表達(dá)，其余6個(gè)基因的表達(dá)模式不盡相同。這表明該酶同時(shí)受到多個(gè)基因調(diào)控，而這些基因的作用模式目前尚不清楚，是由多個(gè)基因共同作用還是某一個(gè)基因起到關(guān)鍵性作用[27-28]，這仍需要進(jìn)行深入的研究。

茶氨酸合成酶基因與谷氨酰胺合成酶基因序列相似度較高，其功能與來(lái)源問(wèn)題一直頗受爭(zhēng)議。對(duì)茶樹(shù)TS與GS基因的SNPs挖掘，實(shí)現(xiàn)在遺傳圖譜上的定位，從而確定兩個(gè)基因的位置關(guān)系，可以進(jìn)一步分析TS基因的來(lái)源和與GS基因家族的關(guān)系。本研究同時(shí)也選取了與TS基因序列差異相對(duì)較多的AB115184基因序列，并對(duì)茶樹(shù)GS基因進(jìn)行了SNPs挖掘，但是在該基因的編碼區(qū)并未挖掘到SNPs位點(diǎn)。本次對(duì)GS基因SNPs的挖掘是在一個(gè)F1群體內(nèi)進(jìn)行，其遺傳多樣性有一定的局限性，后續(xù)的研究可以在遺傳多樣性豐富的樣本內(nèi)開(kāi)展[29]，以期挖掘到更多的SNPs。

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SNP Detection and Mapping of Theanine Synthetase Gene in Tea Plant

LI Xiaojie, MA Jianqiang, YAO Mingzhe*, CHEN Liang*
Tea Research Institute of the Chinese Academy of Agricultural Sciences, National Center for Tea Improvement, Hangzhou 310008, China

The theanine synthetase (TS) gene is considered as the key functional gene for the synthesis of theanine in tea plant. In this study, an F1segregating population and its parents were used to detect single nucleotide polymorphism (SNP) in theTSgene for genetic mapping. According to the sequence alignment between the parents, three SNPs were found, and SNP735 was identified to be heterozygous in YS. SNP735 was subsequently transformed into dCAPS marker and used for genotyping in the F1population. The results showed that the segregation ratio of alleles at this SNP locus was close to 1∶1. The dCAPS marker was mapped to LG03 at a position between TM299 and TM517 in the tea genetic map. Meanwhile, significant correlations between the dCAPS marker and the content of theanine and total amino acid were identified in this study.

tea plant,TS, SNP, dCAPS marker, mapping, theanine

Q51；Q52

A

1000-369X(2017)03-251-07

2017-01-17

：2017-03-28

國(guó)家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-023）、國(guó)家自然科學(xué)基金（31170624、31500568）

李小杰，女，碩士研究生，主要從事茶樹(shù)資源育種研究。*通訊作者