李興 李冰 夏家鳳 劉健 范濤

(安徽省農(nóng)業(yè)科學院蠶桑研究所，安徽合肥230061)

利用風味蛋白酶制備蠶蛹蛋白多肽的工藝研究

李興 李冰 夏家鳳 劉健 范濤

(安徽省農(nóng)業(yè)科學院蠶桑研究所，安徽合肥230061)

蠶蛹蛋白是一種優(yōu)質(zhì)蛋白資源，蠶蛹蛋白多肽分子量更小，可廣泛應用于食品、保健品。以裸蛹家蠶一代雜交種的新鮮、無污染的蠶蛹為研究基礎(chǔ)材料，通過有機溶劑提取的方法脫脂后得到蠶蛹粗蛋白，選擇市場價格低廉、反應條件溫和、酶解產(chǎn)物品質(zhì)高的風味蛋白酶酶解蠶蛹蛋白，制備蠶蛹蛋白多肽。通過單因素和正交試驗確定了蠶蛹蛋白酶解制備蠶蛹蛋白多肽的最佳工藝條件:酶解溫度50℃，酶解時間4 h，料液質(zhì)量濃度111 g/L，酶解液pH值6.0，酶用量750 U/g，此條件下水解度(DH)達到30.12%。

蠶蛹;蛋白多肽;風味蛋白酶;酶解;工藝優(yōu)化

蠶蛹具有較高的營養(yǎng)價值，一直作為滋補強身、活血脾胃的食物和藥物［1］?，F(xiàn)代科學試驗證明，蠶蛹中含有豐富的營養(yǎng)成分，蠶蛹粉中含55%～60%的粗蛋白、25%～30%的粗脂肪、3%～5%的糖、2%～3%的殼聚糖等有效成份，還含有多種微量元素等［2］;蠶蛹蛋白是純天然全價蛋白質(zhì)，其人體必需氨基酸與非必需氨基酸的比例符合世界衛(wèi)生組織/聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(WHO/FAO)提出的參考蛋白模型，是一種理想的優(yōu)質(zhì)蛋白［3］。通常每生產(chǎn)1.0 t生絲可以獲得1.0 t干蠶蛹，而目前蠶蛹主要用于飼料加工和粗蛋白提取等附加值較低的用途，造成了極大的浪費［4］。隨著科學技術(shù)的進步和人們對蠶蛹蛋白認識的加深，蠶蛹蛋白的綜合利用將越來越受到人們的重視［5］。而且近些年來，隨著中國社會老齡化的加劇，市場對氨基酸及其衍生物的需求量也逐年加大，特別是作為更易被人體吸收的蠶蛹蛋白多肽具有廣闊的市場發(fā)展前景，相關(guān)開發(fā)與利用技術(shù)也成為學者研究的熱點。熊燕飛等［6］采用酶解法對蠶蛹蛋白進行酶解，經(jīng)胰蛋白酶處理后酸溶性多肽的得率為92.37%，將制取得到的蠶蛹蛋白多肽應用到食品中，可增加食品的營養(yǎng)性。陳靜等［7］以超臨界提取油脂后的蠶蛹蛋白粉為原料，采用堿性蛋白酶酶解制備蠶蛹蛋白多肽，通過正交試驗確定了蠶蛹蛋白酶解制備蠶蛹蛋白多肽的最佳工藝條件，并研制了能夠緩解疲勞的蠶蛹蛋白多肽運動飲料。張海娜［8］選擇中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、復合蛋白酶等5種蛋白酶對脫脂處理后的蠶蛹蛋白進行雙酶解效果實驗，得到以堿性蛋白酶和復合蛋白酶雙酶解制備出的蠶蛹活性多肽對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制率最高，達到38.09%，同時利用響應面優(yōu)化法得到最佳的酶解條件。

前人對制備蠶蛹蛋白多肽的研究大多是利用經(jīng)過高溫蒸煮、堿水浸泡后的繅絲下腳料蠶蛹，此類蠶蛹已受到一定程度的污染，而隨著人們對食品原料要求標準的提高，繅絲下腳料蠶蛹將無法達到人們對健康、綠色食品的要求［9］。同時，雖然水解酶大多選擇效率高，但胰蛋白酶、堿性蛋白酶等酶解效率高的酶類多需在苛刻的pH值、溫度環(huán)境中進行，而且市場售價高，難以應用于生產(chǎn)實踐。家蠶裸蛹是一種自然突變產(chǎn)生的性狀變異，產(chǎn)少量或不產(chǎn)絲膠，并能穩(wěn)定遺傳［10］，其一代雜交種具有裸蛹性狀，同時兼有抗逆性好、蛹體大等優(yōu)勢，是一種獲得天然、無污染蠶蛹的良好素材［11］。風味蛋白酶是利用米曲霉發(fā)酵，經(jīng)先進的提取工藝微濾、超濾濃縮、干燥技術(shù)精制而得，再添加一些風味物質(zhì)，篩選復配而成，風味蛋白酶天然安全，可應用于各種動植物蛋白的酶解，后期風味優(yōu)化，去除苦味，改善口感，應用風味蛋白酶可以制取風味良好的動植物酶解產(chǎn)品，提高產(chǎn)品質(zhì)量，降低成本。在食品加工過程中添加合適的風味蛋白酶，使風味前體物酶解，從而釋放出風味物質(zhì)，增強和改善食品的風味［12］。本文以天然裸蛹家蠶一代雜交種蠶蛹為研究基礎(chǔ)材料，利用有機溶劑提取油脂后的蠶蛹蛋白粉為原料，選用市場價格低廉、反應條件溫和、酶促反應相對較好的風味蛋白酶制備蠶蛹蛋白多肽，并通過正交試驗確定了酶解制備蠶蛹蛋白多肽的最佳工藝條件，為工業(yè)化生產(chǎn)天然、無污染的蠶蛹蛋白多肽提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蠶蛹:由安徽省農(nóng)業(yè)科學院蠶桑研究所保存的裸蛹家蠶品種Nd和實用性品種Z18的一代雜交種經(jīng)常規(guī)飼育，上蔟第6天后所得的天然蠶蛹。

主要試劑:風味蛋白酶(15 000 U/g)，上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品;正己烷(分析純)，萊陽經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)精細化工廠產(chǎn)品;丙酮(分析純)、無水乙醇(分析純)、石油醚(分析純)、硫酸銅(CuSO4· 5H2O)、硫酸鉀(K2SO4)，國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)品;鹽酸(HCl)，淄博碩營化工銷售有限公司產(chǎn)品。

主要儀器與設(shè)備:TP－500索氏提取器，金壇富華儀器有限公司產(chǎn)品;DH6－924385－III型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司產(chǎn)品; LABOROTA400旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，德國Heidoph公司產(chǎn)品;FW100高速萬能粉碎機、S212恒速攪拌器，上海精宏實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品;DZKW－S－4型恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品;FA2004電子天平，上海天平儀器廠產(chǎn)品;PHS－3C精密pH計，上海精密科學儀器有限公司產(chǎn)品;SHZ－82振蕩水浴鍋，上海儀純實業(yè)有限公司產(chǎn)品;5430R離心機，Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 蠶蛹粗蛋白的制備將試驗蠶蛹置于60℃的烘箱里恒溫干燥12 h以上，至恒質(zhì)量，用粉粹機粉碎，過60目篩，得到蠶蛹粉備用。采用參考文獻［13］的方法，定量稱取上述蠶蛹粉，用裁剪成長方形的脫脂濾紙包成圓柱形，置于索式提取器筒內(nèi)，加入2/3索式提取器體積的正己烷，連接好接收瓶，置于70℃恒溫水浴鍋中進行加熱回流5～8 h，結(jié)束后將濾紙包取出并置于通風廚中，待有機溶劑揮發(fā)后，置于60℃恒溫烘箱中烘干至質(zhì)量不變，去除濾紙，即得到去除蛹油的蠶蛹粗蛋白，所制得的蠶蛹粗蛋白繼續(xù)用于后續(xù)風味蛋白酶酶解試驗，工藝流程如圖1所示。

圖1 蠶蛹蛋白多肽的加工流程

1.2.2 指標測定采用參考文獻［14］指標測定的方法，準確稱取一定量的蠶蛹粗蛋白按設(shè)定的底物濃度加入一定量的水。用1 moL/L NaOH溶液調(diào)節(jié)至所需pH值，加熱至85℃保持20 min后冷卻至40℃以下，然后加入蛋白酶，在保持一定pH值及溫度條件下酶解。酶解結(jié)束后煮沸10 min滅酶，冷卻后12 000 r/min離心10 min，取上清液。沉淀用適量蒸餾水洗滌1次并12 000 r/min離心10 min，合并上清液，記錄體積。蠶蛹蛋白酶解液中氨基酸態(tài)氮含量采用甲醛滴定法測定，蠶蛹蛋白質(zhì)量分數(shù)采用微量凱氏定氮法測定(蛋白質(zhì)換算系數(shù)6.25)［15］。

1.2.3 水解度(DH)的計算

式中:N為酶解液中氨基酸態(tài)氮的含量，單位g/mL; V為酶解液的體積，單位mL;G為脫脂蠶蛹粉的質(zhì)量，單位g;P為脫脂蠶蛹粉蛋白質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)，單位%;6.25為蛋白質(zhì)換算系數(shù)［14］。

1.2.4 蠶蛹蛋白酶解工藝的單因素試驗以脫脂后的蠶蛹粗蛋白為原料，以水解度為指標，采用風味蛋白酶酶解法制備蠶蛹蛋白多肽，通過單因素試驗對酶解溫度、酶解液pH值、料液質(zhì)量濃度、酶用量、酶解時間等對蠶蛹蛋白酶解作用影響較大的5個關(guān)鍵因素進行考察。分別以不同溫度(35、40、45、50、55、60℃)，不同pH值(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)，不同料液質(zhì)量濃度(250、200、167、143、125、111 g/L)，不同酶用量(150、300、450、600、750、900 U/g)，不同酶解時間(1、2、3、4、5、6 h)做單因素試驗，每個試驗重復3次。

1.2.5 蠶蛹蛋白酶解工藝的正交試驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以酶解溫度、酶解液pH值、料液質(zhì)量濃度、酶用量、酶解時間5個因素進行正交試驗，以蛋白水解度為參考指標，通過L16(45)正交試驗設(shè)計，試驗結(jié)果利用正交設(shè)計助手軟件進行分析，確定風味蛋白酶酶解蠶蛹蛋白的最佳工藝條件，因素水平見表1。

表1 蠶蛹蛋白酶解工藝條件L16(45)正交試驗因素水平設(shè)計

1.2.6 最佳工藝的驗證為進一步考察正交分析所得最佳工藝的科學性和穩(wěn)定性，按照優(yōu)化的最佳工藝條件經(jīng)過重復性試驗3次，并分別測定蠶蛹蛋白水解度，計算其相對標準偏差(RSD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶解溫度對蠶蛹蛋白水解度的影響稱取5 g蠶蛹粗蛋白，設(shè)定酶解液PH值為7.0，料液質(zhì)量濃度為143 g/mL，酶用量為600 U/g，酶解時間為3 h的條件，在不同酶解溫度(35、40、45、50、55、60℃)下對蠶蛹蛋白進行酶解，根據(jù)1.2.3中蛋白水解度的測定方法對不同溫度下蠶蛹蛋白的水解度進行測定，結(jié)果如圖2所示。

圖2 酶解溫度對蠶蛹蛋白水解度的影響

從圖2可以看出，隨著溫度的升高，蠶蛹蛋白水解度逐漸增加，在50℃的時候達到最大值，之后隨著溫度的增加，水解度又逐漸下降，這說明在50℃時，風味蛋白酶活性達到最大值，高于或低于這個溫度，活性都下降。所以后續(xù)正交試驗選擇50℃上下的4個梯度值(40、45、50、55℃)進行試驗。

2.1.2 酶解液pH值對蠶蛹蛋白水解度的影響稱取5 g蠶蛹粗蛋白，設(shè)定酶解溫度為50℃，料液質(zhì)量濃度為143 g/L，酶用量為600 U/g，酶解時間為3 h的條件，在不同酶解液pH值(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)下對蠶蛹蛋白進行酶解，根據(jù)1.2.3中蛋白水解度的測定方法對不同pH值下蠶蛹蛋白的水解度進行測定，結(jié)果如圖3所示。

圖3 酶解液pH值對蠶蛹蛋白水解度的影響

從圖3可以看出，風味蛋白酶的最適酶解液pH值為6.5，此時蠶蛹蛋白水解度達到最大值，低于或高于該pH值，均使風味蛋白酶的水解效率降低，所以后續(xù)正交試驗選擇pH值為6.5上下的4個梯度值(6.0、6.5、7.0、7.5)進行試驗。

2.1.3 料液質(zhì)量濃度對蠶蛹蛋白水解度的影響稱取5 g蠶蛹粗蛋白，設(shè)定酶解溫度為50℃，酶解液pH值為7.0，酶用量為600 U/g，酶解時間為3 h的條件，在不同料液質(zhì)量濃度(250、200、167、143、125、111 g/L)下對蠶蛹蛋白進行酶解，根據(jù)1.2.3中蛋白水解度的測定方法對不同料液質(zhì)量濃度下蠶蛹蛋白的水解度進行測定，結(jié)果如圖4所示。

圖4 料液質(zhì)量濃度對蠶蛹蛋白水解度的影響

從圖4可以看出，在設(shè)定的條件下，蠶蛹蛋白和溶劑水的料液質(zhì)量濃度為143 g/L時，風味蛋白酶酶解效率最高，此時蠶蛹蛋白水解度最大。當料液質(zhì)量濃度低于143 g/L時，可能是因為蠶蛹蛋白還未完全溶于水，溶液已達到飽和狀態(tài)，這時的水解效率是由溶劑的量所決定的。當料液質(zhì)量濃度高于143 g/L時，溶劑的增加降低了酶的濃度，使反應效率下降。所以后續(xù)正交試驗選擇料液質(zhì)量濃度143 g/L左右的4個梯度值(167、143、125、111 g/L)進行試驗。

2.1.4 酶用量對蠶蛹蛋白水解度的影響稱取5 g蠶蛹粗蛋白，設(shè)定酶解溫度為50℃，酶解液pH值為7.0，料液質(zhì)量濃度為143 g/L，酶解時間為3 h的條件，在不同酶用量(150、300、450、600、750、900 U/ g)下對蠶蛹蛋白進行酶解，根據(jù)1.2.3中蛋白水解度的測定方法對不同酶用量下蠶蛹蛋白的水解度進行測定，結(jié)果如圖5所示。

從圖5可以看出，在設(shè)定的條件下，隨著風味蛋白酶用量的增加，蠶蛹蛋白水解度在增加，但當酶用量達到750 U/g時，水解度已趨于最大值，酶量再增加時水解度增加不明顯。為了節(jié)約成本，所以后續(xù)正交試驗選擇風味蛋白酶用量750 U/g以下的4個梯度值(300、450、600、750 U/g)進行試驗。

圖5 酶用量對蠶蛹蛋白水解度的影響

2.1.5 酶解時間對蠶蛹蛋白水解度的影響稱取5 g蠶蛹粗蛋白，設(shè)定酶解溫度為50℃，酶解液pH值為7.0，底物質(zhì)量濃度為143 g/L，酶用量600 U/g的條件，在不同酶解時間(1、2、3、4、5、6 h)下對蠶蛹蛋白進行酶解，根據(jù)1.2.3中蛋白水解度的測定方法對不同酶解時間下蠶蛹蛋白的水解度進行測定，結(jié)果如圖6所示。

圖6 酶解時間對蠶蛹蛋白水解度的影響

從圖6可以看出，在設(shè)定的條件下，隨著酶解時間的延長，蠶蛹蛋白水解度在增加，當酶解時間為3 h時，蛋白水解度已趨于最大值，再延長酶解時間蛋白水解度增加不明顯。為了提高提取效率，后續(xù)正交試驗選擇酶解時間4 h左右的4個梯度值(2、3、4、5 h)進行試驗。

2.2 蠶蛹蛋白最佳酶解工藝的確定

為優(yōu)化酶解條件，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用L16(45)正交試驗，以水解度為指標，確定蠶蛹蛋白最佳酶解工藝，結(jié)果如表2所示。由表2極差分析可得，影響酶解反應的主次關(guān)系為A＞E＞D＞C＞B，說明在蠶蛹蛋白酶解過程中影響水解度的主要因素是酶解溫度，然后是酶解時間、酶用量、料液質(zhì)量濃度和酶解液pH值。根據(jù)表2中各因素的K值大小可以確定各因素的較優(yōu)水平組合是A3B1C4D4E3，正交試驗中無此方案，通過驗證試驗確定蠶蛹蛋白酶解最佳的工藝參數(shù)為酶解溫度50℃、酶解時間4 h、料液質(zhì)量濃度111 g/L、酶解液pH值6.0、酶用量750 U/g，在此條件下水解度為30.97%。

表2 蠶蛹蛋白酶解工藝條件的正交試驗結(jié)果

2.3 正交試驗優(yōu)化驗證

采用正交試驗所得最佳提取工藝在酶解溫度50℃，酶解時間4 h，料液質(zhì)量濃度111 g/L，酶解液pH值6.0，酶用量750 U/g進行3次重復試驗，從試驗結(jié)果得出在該條件下蠶蛹蛋白水解度平均可達到30.12%，說明經(jīng)過正交試驗篩選出來的提取條件科學合理，結(jié)果穩(wěn)定可靠，具有較好的重復性。

3 小結(jié)與討論

進行蠶蛹蛋白酶解技術(shù)的研究與開發(fā)，生產(chǎn)蠶蛹蛋白多肽創(chuàng)新產(chǎn)品，不僅可提高蠶桑產(chǎn)業(yè)的附加值和比較效益，也豐富了我國氨基酸產(chǎn)品的消費市場。且隨著科技的發(fā)展，人們對蠶蛹蛋白的研究將更加深入，將在食品、醫(yī)藥、化工、農(nóng)業(yè)等行業(yè)不斷開發(fā)出更多應用［16］，蠶蛹蛋白多肽產(chǎn)業(yè)大有可為。

本文以天然裸蛹家蠶一代雜交種(Nd×Z18)的蠶蛹為研究基礎(chǔ)材料，利用有機溶劑提取油脂后的蠶蛹蛋白粉為原料，采用市場價格低廉、反應條件溫和、酶促反應相對較好的風味蛋白酶制備蠶蛹蛋白多肽，并通過正交試驗確定了蠶蛹蛋白酶解的最佳工藝條件，在酶解溫度50℃，酶解時間4 h，料液質(zhì)量濃度111 g/L，pH值6.0，酶用量750 U/g的最優(yōu)條件下，蠶蛹蛋白的水解度可達到30.12%。為工業(yè)化生產(chǎn)天然、無污染的蠶蛹蛋白多肽提供了參考，同時也為提高蠶業(yè)附加值、構(gòu)建蠶業(yè)非絹絲產(chǎn)業(yè)鏈［17］提供了解決思路。

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S886.9

A

1007－0982(2017)02－0012－06

10.16839/j.cnki.zgcy.2017.02.003

2017－02－28;接受日期:2017－03－28

安徽省農(nóng)業(yè)科學院學科建設(shè)項目(編號16A0619、17A0617);現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(編號CARS－22)。

信息:李興(1984—)，男，安徽桐城，碩士，副研究員。Tel:0551－62826593，E-mail:ahcss@sohu.com

信息:范濤(1962—)，男，安徽太和，碩士，研究員。Tel:0551－66826686，E-mail:fantao1116@163.com