楊春秀，胡建娥，傘景輝，陳建斌

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 血液內(nèi)科，貴州 遵義 563099；2.重慶市三峽中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科，重慶 404100；3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 血液內(nèi)科，重慶 400016)

臨床醫(yī)學(xué)研究

Notch4受體激活對K562細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制研究

楊春秀1，胡建娥2，傘景輝1，陳建斌3

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 血液內(nèi)科，貴州 遵義 563099；2.重慶市三峽中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科，重慶 404100；3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 血液內(nèi)科，重慶 400016)

目的 研究Notch4受體激活后對慢性髓系白血病細(xì)胞株K562增殖的影響及可能的作用機(jī)制。方法 用脂質(zhì)體分別將攜帶Notch4胞內(nèi)段(ICN4)的質(zhì)粒pcDNA 3.1-ICN4及空載體質(zhì)粒pcDNA 3.1轉(zhuǎn)染入K562細(xì)胞，用G418篩選出穩(wěn)定表達(dá)ICN4的細(xì)胞株。觀察K562細(xì)胞ICN4轉(zhuǎn)染后的形態(tài)變化，MTT法分析細(xì)胞增殖水平，RT-PCR法和Western blot法檢測Notch4受體、Hes1、Hey1下游靶基因 mRNA及蛋白的表達(dá),流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布。結(jié)果 篩選出穩(wěn)定表達(dá)ICN4的細(xì)胞株K562/ICN4細(xì)胞，與對照組及空載體組比較，ICN4轉(zhuǎn)染組K562細(xì)胞數(shù)量減少，胞膜透亮度減小，核染色質(zhì)固縮，核漿比例減低；ICN4轉(zhuǎn)染后K562細(xì)胞生長受抑(P<0.05),且隨時(shí)間延長而明顯；Notch4受體及Hes1下游靶基因 mRNA及蛋白表達(dá)水平相似，均較對照組及空載體組表達(dá)增強(qiáng),但Hey1下游靶基因mRNA及蛋白表達(dá)水平未見明顯變化；細(xì)胞周期檢測結(jié)果示，轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞阻滯于G1期 (P<0.05)，S期細(xì)胞減少(P<0.05)。結(jié)論 Notch4受體激活可抑制K562細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能是通過激活下游靶基因Hes1表達(dá)，而調(diào)控細(xì)胞于G1期而實(shí)現(xiàn)的。

Notch4；K562細(xì)胞；基因轉(zhuǎn)染；靶基因

Notch受體是進(jìn)化過程中具有高度保守性的單遍跨膜蛋白，表達(dá)于多種動物的細(xì)胞與組織，與多種生命進(jìn)程如造血系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等密切相關(guān)[1]。有研究表明，Notch信號系統(tǒng)在胚胎造血過程中起重要作用，在造血系統(tǒng)發(fā)育各個(gè)階段影響造血祖細(xì)胞的存活、增殖和決定細(xì)胞分化命運(yùn)，促進(jìn)干細(xì)胞自我更新[2]，其異常表達(dá)與多種疾病進(jìn)程及腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)，包括造血系統(tǒng)腫瘤(如急性T/B淋巴細(xì)胞白血病、急性髓系白血病、慢性B淋巴細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤等)[3-5]及實(shí)體腫瘤(如乳腺癌、黑色素瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、胰腺癌、肝癌等)[6]。Notch4激活可增加干細(xì)胞活性，減少分化，并改變淋巴細(xì)胞發(fā)育方向，表明其可影響干細(xì)胞和普通淋巴祖細(xì)胞發(fā)育[7]，其異常高表達(dá)被證實(shí)與多種腫瘤相關(guān)，但在慢性粒細(xì)胞白血病中的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。本研究采用基因轉(zhuǎn)染法，將Notch4胞內(nèi)段ICN4轉(zhuǎn)染入慢性髓系白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞中，研究其在慢性髓系白血病中的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 慢性髓系白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞、DH5α大腸桿菌及空載體質(zhì)粒pcDNA 3.1由本室常規(guī)保存。pcDNA 3.1-ICN4質(zhì)粒由重慶醫(yī)科大學(xué)組織與胚胎教研室李芳菲博士惠贈。RPMI 1 640培養(yǎng)基、胎牛血清、質(zhì)粒提取試劑盒、RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒、脂質(zhì)體LipofectamineTM2 000等分別購自Invitrigen公司，天根生物、Roche、Hyclone、TaKaRa公司及碧云天生物技術(shù)研究所；MTT購自Sigma；Notch4山羊抗人單克隆抗體、Hes1兔抗人單克隆抗體、Hey1小鼠抗人單克隆抗體購自Santa cruz，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購自北京中杉。儀器：細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本SANYO公司，型號：RKJ-2)，酶標(biāo)儀(日本UNRISE公司)，倒置相差顯微鏡(Olympus公司，型號：CKC-TR-2 W)，PCR儀(Thermo Hybaid公司)，流式細(xì)胞儀(美國Becton-Dickinson公司，型號：FACS Calibur)，凝膠呈像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) K562細(xì)胞于RPMI1 640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中培養(yǎng)，置于含5%CO2、飽和濕度、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，每2日換液傳代一次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與穩(wěn)定篩選 轉(zhuǎn)染方法按LipofectamineTM2 000說明書操作進(jìn)行，將脂質(zhì)體和質(zhì)粒按1∶1比例以無血清的RPMI 1 640培養(yǎng)基稀釋，混勻后靜置30 min。取生長狀態(tài)佳的細(xì)胞，每孔細(xì)胞數(shù)調(diào)整為5×105/mL接種于12孔培養(yǎng)板，加入質(zhì)粒與脂質(zhì)體混合液繼續(xù)培養(yǎng)；2 d后傳代，次日將轉(zhuǎn)染細(xì)胞在含750 μg/mL G418的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，G418濃度經(jīng)濃度分析后所確定，在含抗生素的培養(yǎng)基中每3日換液1次。約10 d后觀察到抗性克隆，經(jīng)有限稀釋法篩取單克隆抗性細(xì)胞，經(jīng)PCR法鑒定轉(zhuǎn)染成功后，設(shè)為ICN4轉(zhuǎn)染組；空載組將空載體質(zhì)粒pcDNA 3.1按轉(zhuǎn)染說明書轉(zhuǎn)入K562細(xì)胞，對照組加入同等量培養(yǎng)基代替，繼續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 RT-PCR檢測Notch4、Hes1、Hey1 mRNA表達(dá) 分別提取ICN4轉(zhuǎn)染組、空載組與對照組培養(yǎng)48 h的K562細(xì)胞，裂解后按RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，取OD260/OD280比值處于1.8～2.0之間的RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用primer 3 軟件根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，并于Genebank核對無誤后，于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列及擴(kuò)增條件見表1所示。 PCR電泳產(chǎn)物電泳分析：取10 μL產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠(含0.5 mg/mL溴化乙啶)電泳，90 V，20～30 min，觀察結(jié)果并采圖，以β-actin為內(nèi)參，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1 PCR引物序列

基因引物序列退火溫度(℃)循環(huán)ICN4P1:CGGACTCGAGGCAATATGG5835P2:AGGGGTCGAAGCTCGCTCTNotch4P1:GGCTCCTTCAACTGCCTCTG5630P2:CTGCCCTTCTAAGCCTGGCHes1P1:TGAGTCTGGCGAACACTCTG5638P2:CACGGATCGAGGCTAAGAAAHey1P1:AAAGAAGACGAGAGAGGCATA5635P2:GCGCATCAACATATAGCTTCβ-actinP1:TGGCATCCACGAGACCACCTTCA6430P2:GACTGCTGTCACCTTCACCGTTCC

1.5 Western blot法檢測Notch4、Hes1、Hey1蛋白表達(dá) 收取轉(zhuǎn)染組、空載組與對照組培養(yǎng)48 h的 K562細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)檢測蛋白濃度后調(diào)整蛋白上樣量為每組60 ng，加入上樣緩沖液，100 ℃變性5 min；10%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜；于含5%脫脂奶粉的TBST中封閉過夜，加入Notch4抗體(1∶200 )，于37 ℃恒溫孵育3 h。洗膜，加入二抗常溫封閉1.5 h，洗膜3次后成像分析，以GAPDH為內(nèi)參。Hes1、Hey1蛋白檢測方法同上。

1.6 細(xì)胞增殖檢測 收取生長狀態(tài)佳的K562細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)調(diào)整為1.5×104/mL，ICN4轉(zhuǎn)染組、空載組與對照組分別以200 μL/孔接種于96孔板中，各設(shè)6個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入5 g/L MTT 20 μL，放入5%CO2、飽和濕度、37 ℃恒溫孵箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出培養(yǎng)板離心，后棄上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩15 min，待藍(lán)色結(jié)晶物充分溶解，選擇570 nm波長，測定各孔OD值(A570)，記錄結(jié)果，按公式計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。細(xì)胞生長抑制率=(1-轉(zhuǎn)染組平均OD值/對照組平均OD值)×100%。重復(fù)該實(shí)驗(yàn)3次。

1.7 細(xì)胞周期檢測 收取ICN4轉(zhuǎn)染組、空載組與對照組培養(yǎng)48 h的K562細(xì)胞， PBS洗滌3次，濃度為75%的冰乙醇固定，放置于4 ℃。檢測前去瀝去冰乙醇，加入RNA消化酶置于4 ℃ 30 min，再予碘化丙碇(PI)染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測。計(jì)算機(jī)MultiCycle軟件分析得出各期所占比例。

2 結(jié)果

2.1 ICN4在K562細(xì)胞中成功轉(zhuǎn)染 將篩取的單克隆抗性細(xì)胞培養(yǎng)后提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果示對照組及空載組中ICN4低表達(dá)，而ICN4轉(zhuǎn)染組mRNA表達(dá)水平明顯增高，表明轉(zhuǎn)染成功(見圖1)。

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)；a：對照組；b：空載組；c：轉(zhuǎn)染組。圖1 RT-PCR鑒定ICN4轉(zhuǎn)染

2.2 Notch4受體激活后K562細(xì)胞形態(tài)變化 細(xì)胞形態(tài)觀察示(見圖2)，對照組(圖2 a，b，c)及空載組(圖2 d，e，f) K562細(xì)胞胞膜透亮，核大而明顯，核仁清楚，核質(zhì)比大，胞漿呈淡紫色，無特殊顆粒，隨培養(yǎng)時(shí)間延長，細(xì)胞數(shù)逐漸增多，密集，至72 h時(shí)細(xì)胞達(dá)融合狀態(tài)。ICN4轉(zhuǎn)染組(圖2 g，h，i)培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞開始呈現(xiàn)成團(tuán)生長，胞膜透亮度變差，胞體變小，核仁減少或不可見，核漿比例減小，且隨培養(yǎng)時(shí)間延長，細(xì)胞有進(jìn)一步減小和固縮趨勢。

a、b、c：對照組 24、48、72 h；d、e、f:空載組 24、48、72 h；g、h、i：轉(zhuǎn)染組24、48、72 h。

圖2 Notch4受體激活前后K562細(xì)胞形態(tài)變化(×400)

2.3 ICN4轉(zhuǎn)染抑制K562細(xì)胞增殖 MTT結(jié)果見圖3，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，ICN4轉(zhuǎn)染組細(xì)胞生長抑制率與空載組及對照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，隨培養(yǎng)時(shí)間延長，至72 h時(shí)，差異更明顯，而空載組對K562細(xì)胞的增殖則無明顯影響(P>0.05)。MTT結(jié)果表明Notch4受體激活后抑制K562細(xì)胞生長。

a:與對照組比較，P<0.05；b：與空載組比較， P<0.05；c：與對照組比較，P<0.01；d：與空載組比較，P<0.01。圖3 MTT法測定K562細(xì)胞增殖水平

2.4 ICN4轉(zhuǎn)染對K562細(xì)胞中Notch4受體、靶基因Hes1、Hey1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響 利用RT-PCR和Western-blot法檢測各組K562細(xì)胞中Notch4受體、靶基因Hes1、Hey1 mRNA及蛋白的表達(dá)。結(jié)果(如圖4～7)所示，與空載組及對照組相比，ICN4轉(zhuǎn)染組Notch4受體、靶基因Hes1 mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，而Hey1 mRNA及蛋白的表達(dá)則無明顯變化(P>0.05)。

a：對照組；b：空載組；c：ICN4轉(zhuǎn)染組。圖4 RT-PCR檢測Notch4受體、靶基因Hes1、Hey1 mRNA的表達(dá)

a:與對照組比較，P<0.05；b：與空載組比較， P<0.05；c：與對照組比較，P>0.05；d：與空載組比較，P>0.05。 圖5 ICN4轉(zhuǎn)染后K562細(xì)胞中Notch4受體、靶基因Hes1、Hey1 mRNA表達(dá)變化

a：對照組；b：空載組；c：ICN4轉(zhuǎn)染組。 圖6 Western blot法檢測Notch4受體、靶基因Hes1、Hey1 蛋白的表達(dá)

a:與對照組比較，P<0.05；b：與空載組比較， P<0.05；c：與對照組比較，P>0.05；d：與空載組比較，P>0.05。 圖7 ICN4轉(zhuǎn)染后K562細(xì)胞中Notch4、靶基因Hes1、Hey1蛋白表達(dá)變化

2.5 ICN4轉(zhuǎn)染對K562細(xì)胞周期分布的影響 收取ICN4轉(zhuǎn)染組、空載組及對照組培養(yǎng)48 h K562細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。結(jié)果示，與對照組及空載組相比，轉(zhuǎn)染ICN4組細(xì)胞阻滯于G1期(P<0.05)，S期細(xì)胞減少(P<0.05)，說明ICN4轉(zhuǎn)染后可影響K562細(xì)胞周期分布(見表2)。而空載組與對照組各期相比則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

組別G1期S期G2+M期對照22.12±1.7754.18±1.9325.00±0.19空載20.38±2.5658.75±6.3722.71±3.91ICN4轉(zhuǎn)染45.00±5.42ab25.39±1.74ab27.42±2.85

a：與對照組比較，P<0.05；b：與空載組比較，P<0.05。

3 討論

相鄰細(xì)胞膜上的Notch受體與配體結(jié)合，經(jīng)過至少兩次蛋白裂解作用，釋放出具有活性的胞內(nèi)段(intracellular domain of Notch，ICN)并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物，引起下游靶基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)，影響細(xì)胞增殖、分化及凋亡，決定細(xì)胞命運(yùn)。Notch信號通路下游靶基因包括Hes、HERP兩大家族，還有p 21、細(xì)胞周期D 1和NF-κB等。Hey1是HERP家族成員，作為Notch信號通路中極重要的下游靶基因，Hes及Hey基因的表達(dá)是Notch信號通路激活的標(biāo)志，受Notch信號的調(diào)控。

ICN的激活使Notch信號通路具有不可調(diào)控性和持續(xù)活性，致下游靶基因表達(dá)異常，這可能與腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程密切相關(guān)。Notch4信號持續(xù)表達(dá)可誘發(fā)小鼠乳腺腫瘤形成[8]，且在人乳腺癌、肺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞系中亦檢測到Notch4高表達(dá)[9]。Notch4活化可使正常乳腺上皮細(xì)胞在體外發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，且高表達(dá)Notch4的腫瘤患者總體生存期較短[10]。沉默Notch4基因表達(dá)可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖、遷移和侵襲能力[11]。另有研究證實(shí)，Notch相關(guān)受體及配體在正常成人前列腺中表達(dá)，且在前列腺癌尤其是晚期前列腺癌中高表達(dá)，表明其與前列腺癌的進(jìn)展相關(guān)[12]。抑制Notch 3、4和Jagged 1、2的表達(dá)可增加B-ALL細(xì)胞凋亡[13]。Hes1,Hey1是Notch信號通路下游靶基因,Notch信號通路激活后，通過調(diào)控其表達(dá)而對組織、細(xì)胞發(fā)揮相應(yīng)作用，已有研究表明，Hes1是鼠胚胎期造血干細(xì)胞發(fā)育所必需的[14]，Hey1在胚胎血管形成過程中的重要轉(zhuǎn)錄抑制因子，也是雄激素受體的輔阻遏因子,可影響前列腺癌發(fā)育及抑制肌節(jié)發(fā)生等。

現(xiàn)有研究證實(shí)，Notch 1過表達(dá)抑制K562細(xì)胞增殖[15-16]，而Notch4在慢性粒細(xì)胞白血病中的作用及可能機(jī)制，則未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將攜有活性Notch4胞內(nèi)段的質(zhì)粒pcDNA 3.1-ICN4轉(zhuǎn)染入慢性髓系白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞中，并通過G418篩選出ICN4穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染組ICN4表達(dá)，證實(shí)轉(zhuǎn)染ICN4成功。以此為細(xì)胞模型，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)、增殖性能、Notch4受體及下游靶基因Hes1、Hey1基因和蛋白的表達(dá)以及細(xì)胞周期變化。結(jié)果表明：經(jīng)轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察示對照組及空載組細(xì)胞胞體圓而大，胞膜透亮，胞漿呈紫色，72 h時(shí)已鋪滿視野；而ICN4轉(zhuǎn)染組細(xì)胞數(shù)明顯減少，胞膜透亮度變差，胞核減少或消失，核漿比例減?。贿M(jìn)一步的MTT實(shí)驗(yàn)表明， Notch4受體激活后抑制K562細(xì)胞增殖，且隨時(shí)間延長，其抑制作用更加明顯；Notch4受體、下游靶基因Hes1 mRNA及蛋白在K562細(xì)胞中表達(dá)水平均比對照組及空載組升高；但Hey1 mRNA及蛋白的表達(dá)則較對照組無明顯變化。細(xì)胞周期檢測結(jié)果示，ICN4轉(zhuǎn)染后48 h，細(xì)胞阻滯于G1期，S期細(xì)胞減少。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ICN4轉(zhuǎn)染入K562細(xì)胞后，抑制K562細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能有兩方面：一方面ICN4轉(zhuǎn)染后，Notch4 受體表達(dá)增加，激活Notch信號通路，增加下游靶基因Hes1而非Hey1轉(zhuǎn)錄而調(diào)控K562細(xì)胞，減少S期DNA合成，阻滯細(xì)胞于G1期；另一方面也可能是激活后的Notch信號通路增強(qiáng)或減弱了其他信號機(jī)制作用，從而抑制K562細(xì)胞生長。但I(xiàn)CN4轉(zhuǎn)染后抑制K562細(xì)胞增殖，是否激活Hes1以外靶基因的表達(dá)，是否與其他信號通路相交聯(lián)，以什么樣的方式產(chǎn)生作用等，尚待深入研究。

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[收稿2017-01-02;修回2017-03-16]

(編輯：王福軍)

Effects of Notch4 receptor activation on proliferation of K562 cells and the mechanism study

YangChunxiu1，HuJiane2，SanJinghui1，ChenJianbin3

(1.Department of Hematology,Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China;2.Clinical Laboratory,Three Georges Central Hospital,Chongqing 404100,China; 3.Department of Hematology,First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China)

Objective To investigate the effects of activation of Notch4 receptor on cell proliferation and possible mechanisms in human chronic myeloid leukemia cell line K562.Methods The ICN4 expression plasmid pcDNA3.1-ICN4 and the empty vector pcDNA3.1 were individually transfected in K562 cells with LipofectamineTM2000 and the ICN4 stable expression cell line was screened with G418.The morphology change of K562 cells was observed after trasnsfected with ICN4.The cell proliferation of K562 cells was detected by MTT assays.RT-PCR and Western-blot were used to detect the mRNA and protein expression of Notch4 receptor,Hes1 and Hey1 target genes.The cell cycle distribution was detected by flow cytometry.Results The stable expression of cell line K562/ICN4 cells was screened.Compared with the control group and empty vector transfected group,the cell number of ICN4 transfected K562 cells decreased with nuclear chromatin aggregated.The proliferation of transfected group K562 cells were inhibited (P<0.05).With time extending,the cells were significantly inhibited.Both mRNA and protein expression of Notch4 receptor and Hes1 target genes were up-regulated in ICN4 transfected group,while the Hey1 mRNA and protein expression level showed no significant change.After transfected with ICN4 for 48 h,the cell cycle was blocked in G1phase (P<0.05),while S phase cells were reduced (P<0.05).Conclusion The Notch4 receptor activation could inhibit K562 cells proliferation by up-regulating the target gene Hes1 expression and arresting cells at G1phase.

Notch4; K562 cells; gene transfection; target genes

重慶市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO：CSTC2009BB5401)。

陳建斌，男，博士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：白血病的基礎(chǔ)與臨床研究， E-mail:cqchenjianbin2007@126.com。

R733.72

A

1000-2715(2017)02-0172-05