林 茂，王 敏，劉 芳，羅小金，高仕琴，王春梅

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū) 珠海市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨中藥基礎(chǔ)及應(yīng)用研究實(shí)驗(yàn)室，廣東 珠海 519041)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

綠原酸對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

林 茂，王 敏，劉 芳，羅小金，高仕琴，王春梅

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū) 珠海市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨中藥基礎(chǔ)及應(yīng)用研究實(shí)驗(yàn)室，廣東 珠海 519041)

目的 探討綠原酸(CGA)對(duì)β淀粉樣蛋白25-35(Aβ25-35)誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法 采用Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞損傷模型，并用3個(gè)不同濃度的CGA分組干預(yù)。CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；比色法檢測(cè)細(xì)胞丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活力；Western blot檢測(cè)細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)和白細(xì)胞介素1β(IL-1β)表達(dá)；ELISA法檢測(cè)細(xì)胞腫瘤壞死因子α(TNF-α)濃度。結(jié)果 與Control組比較，Model組細(xì)胞存活率下降、凋亡率升高，SOD和GSH-Px活力降低、MDA水平升高，NF-κB、IL-1β和TNF-α表達(dá)水平升高(P<0.05)。與Model組比較，CGA各組細(xì)胞存活率升高、凋亡率下降，SOD和GSH-Px活力升高、MDA水平降低，NF-κB、IL-1β和TNF-α蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05)。結(jié)論 CGA對(duì)Aβ25-35致PC12細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。其機(jī)制可能與CGA提高細(xì)胞抗氧化能力，抑制NF-κB介導(dǎo)的炎癥通路有關(guān)。

綠原酸；β淀粉樣蛋白；PC12細(xì)胞；阿爾茨海默病

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是老年人常見(jiàn)的一種以漸進(jìn)性認(rèn)知功能減退為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1-3]。隨著全球人口老齡化進(jìn)程加劇，AD患者人數(shù)逐年上升，在嚴(yán)重影響老年人生活質(zhì)量的同時(shí)，也給社會(huì)醫(yī)療帶來(lái)了沉重負(fù)擔(dān)[4]。β淀粉樣蛋白(beta-amyloid protein，Aβ)異常沉積所形成的老年斑是AD主要的病理變化之一。Aβ可誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥因子，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成神經(jīng)細(xì)胞損傷[5-8]。因此，消除或減弱Aβ毒性是改善AD病程的關(guān)鍵。綠原酸(chlorogenic acid，CGA)作為杜仲、金銀花中含量豐富的活性物質(zhì)，是植物體有氧呼吸過(guò)程中產(chǎn)生的一種苯丙素類化合物，因具有良好的抗氧化、抗炎的藥理作用而引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注[9-10]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞損傷模型[2,11]，研究觀察CGA對(duì)其保護(hù)作用，并分析可能機(jī)制，旨在為CGA用于臨床防治AD提供藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試細(xì)胞株 PC12細(xì)胞由遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)生物醫(yī)藥(學(xué))研發(fā)中心中藥基礎(chǔ)及應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 藥品與主要試劑 綠原酸購(gòu)自成都曼思特生物科技公司(含量≥98%，批號(hào)：MUST-16031610)；Aβ25-35和二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide,DMSO)購(gòu)自Sigma公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物；丙二醛(malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒和β-actin抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa β,NF-κB)和白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；其它試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞損傷模型的構(gòu)建及分組處理 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，1×105個(gè)/mL細(xì)胞接種于96孔板，每孔100 μL。分為正常對(duì)照組(Control)、模型組(Model)組及3個(gè)不同濃度CGA組(CGA 25 μmol/L、CGA 50 μmol/L和CGA 100 μmol/L)。24 h后，無(wú)血清DMEM處理細(xì)胞，先用不同濃度CGA作用細(xì)胞2 h，除Control組外，其余各組加Aβ25-3520 μmol/L ，孵育24 h。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率 藥物干預(yù)結(jié)束后，每孔板細(xì)胞加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃、5%的CO2孵育2 h，酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450 nm測(cè)吸光度值。存活率計(jì)算公式：細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A-空白組A)/(對(duì)照組A-空白組A)×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 選用磷脂結(jié)合蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V- fluorescein isothiocyanate,Annexin V-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)雙染試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡。每孔板細(xì)胞用不含乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)的胰酶消化，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌細(xì)胞兩次，離心，棄上清。分別加入200 μL Annexin V-FITC結(jié)合液和10 μL PI染色液輕輕混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4 比色法檢測(cè)細(xì)胞SOD、GSH-Px活力及MDA含量 收集各組細(xì)胞，冰上裂解，離心，將上清制成樣品溶液。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)定MDA含量、SOD和GSH-Px活力。

1.2.5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞NF-κB和IL-1β的表達(dá) 冰上裂解細(xì)胞、提取蛋白?？捡R斯亮藍(lán)法檢測(cè)蛋白濃度。上樣75 μg/泳道，SDS-PAGE凝膠電泳。260 mA電流下轉(zhuǎn)膜70 min，5%脫脂奶粉封閉。分別加入NF-κB和IL-1β的一抗，4 ℃搖床上緩慢搖動(dòng)，孵育過(guò)夜，加二抗。β-actin作為內(nèi)參。曝光、顯影、定影后Quantity-One軟件分析，以相對(duì)光密度值(目的條帶光密度值/β-actin光密度值)作為各蛋白表達(dá)量。

1.2.6 ELISA測(cè)定細(xì)胞內(nèi)TNF-α的濃度 冰上裂解細(xì)胞、離心、吸取各組上清即得到樣品。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)各孔吸光度值，測(cè)定TNF-α濃度。

2 結(jié)果

2.1 CGA對(duì)細(xì)胞存活率的影響 如圖1所示，與Control組比較，Model組細(xì)胞存活率下降(P<0.05)；與Model組比較，CGA各組細(xì)胞存活率升高(P<0.05)。

與Control組相比，*P<0.05；與Model組相比，。圖1 各組細(xì)胞存活率的變化

2.2 CGA對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響 如圖2所示，凋亡早期的細(xì)胞僅被Annexin V-FITC染色，PI染色呈陰性(見(jiàn)圖2中Q3象限)。死亡和凋亡晚期的細(xì)胞可以同時(shí)被Annexin V-FITC和PI染色(見(jiàn)圖2中Q2象限)。統(tǒng)計(jì)Q2和Q3象限的細(xì)胞百分比之和記為各組細(xì)胞凋亡率，結(jié)果如表1所示。與Control組比較，Model組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)。與Model組比較，CGA各組細(xì)胞凋亡率下降(P<0.05，見(jiàn)表1)。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞凋亡檢測(cè)分析圖

組別凋亡率(%)Control1.93±1.72Model29.31±1.46*CGA25μmol/L26.16±1.68#CGA50μmol/L16.07±2.16#CGA100μmol/L22.67±1.67#

與Control組相比，*P<0.05；與Model組相比，#P<0.05。

2.3 CGA對(duì)細(xì)胞SOD、GSH-Px活力及MDA含量的影響 如表2所示，與Control組比較，Model組細(xì)胞SOD、GSH-Px活力降低，MDA水平升高(P<0.05)。與Model組比較，CGA各組細(xì)胞SOD、GSH-Px活力升高，MDA含量減低(P<0.05)。

組別SOD[U/mg(prot)]GSH-Px(mU/mg)MDA[nmol/mg(prot)]Control326.89±8.65 365.11±6.40 600.94±28.91Model154.16±5.70* 96.77±13.25*1293.49±27.47*CGA25μmol/L190.01±21.46#172.79±11.14#1054.75±22.97# CGA50μmol/L285.59±4.22# 269.42±3.59#427.96±15.47#CGA100μmol/L273.77±4.54# 233.81±9.32#406.30±2.88#

與Control組相比，*P<0.05；與Model組相比，#P<0.05。

2.4 CGA對(duì)細(xì)胞IL-1β及NF-κB表達(dá)的影響 如圖3所示，與Control組比較，Model組細(xì)胞NF-κB、IL-1β表達(dá)水平升高(P<0.05)；與Model組比較，CGA各組細(xì)胞NF-κB、IL-1β表達(dá)水平下降(P<0.05)。

與Control組相比，*P<0.05；與Model組相比，。圖3 各組細(xì)胞IL-1β、NF-κB的表達(dá)

2.5 CGA對(duì)細(xì)胞內(nèi)TNF-α濃度的影響 如圖4所示。與Control組比較，Model組細(xì)胞內(nèi)TNF-α濃度升高(P<0.05)；與Model組比較，CGA各組細(xì)胞內(nèi)TNF-α濃度下降(P<0.05)。

與Control組相比，*P<0.05；與Model組相比，。圖4 各組細(xì)胞內(nèi)TNF-α濃度

3 討論

Aβ是AD特征性病理老年斑的主要成份，也是AD多種病理變化的中心環(huán)節(jié)。生理情況下，Aβ的產(chǎn)生和降解保持動(dòng)態(tài)平衡，并不影響神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能[7]。AD病程中Aβ異常增多，沉積的Aβ引起氧化應(yīng)激，神經(jīng)炎癥，誘導(dǎo)tau蛋白磷酸化水平失衡，導(dǎo)致神經(jīng)纖維纏結(jié)的形成，損傷神經(jīng)元[5-8]。研究發(fā)現(xiàn)，Aβ25-35是Aβ產(chǎn)生毒性作用的必要結(jié)構(gòu)。將Aβ25-35注入動(dòng)物腦內(nèi)或處理細(xì)胞可誘發(fā)細(xì)胞氧化損傷和炎癥損傷，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，引起動(dòng)物認(rèn)知功能下降等表現(xiàn)[11-12]。PC12細(xì)胞是大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤分化的細(xì)胞株，因其具有與神經(jīng)元類似的生理特征，故常被應(yīng)用于神經(jīng)生理和藥理研究。本實(shí)驗(yàn)選擇Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞作為細(xì)胞損傷模型進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，與Control組相比，Model組細(xì)胞存活率下降、凋亡率升高，SOD和GSH-Px活力降低、MDA水平升高，NF-κB、IL-1β和TNF-α表達(dá)水平升高。其中TNF-α和IL-1β作為兩個(gè)重要的炎癥因子，可以誘導(dǎo)NF-κB經(jīng)典信號(hào)通路的激活，而NF-κB的激活又與TNF-α、IL-1β表達(dá)存在正反饋調(diào)節(jié)。在損傷細(xì)胞模型中它們?nèi)叩谋磉_(dá)增高，說(shuō)明了細(xì)胞炎癥損傷的存在。此外，SOD、GSH-Px和MDA 3個(gè)指標(biāo)的異常變化，揭示了氧化損傷的存在。以上結(jié)果說(shuō)明Aβ25-3520 μmol/L 孵育24 h對(duì)PC12細(xì)胞造成了損傷，顯示成功模擬出AD的部分病理生理變化。

相對(duì)于臨床化學(xué)藥物治療AD的局限性，從天然藥用植物中篩選活性成分已成為防治AD的重要途徑[1-2]。CGA是杜仲、金銀花等植物中含量豐富的一種酚型抗氧化劑，具有清除體內(nèi)自由基、預(yù)防腫瘤和抗衰老等作用[9-10]。因其含有R-OH基，能消除超氧陰離子、羥自由基等自由基活性，可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[10]。文獻(xiàn)報(bào)道CGA可以通過(guò)抑制乙酰膽堿酯酶活性，改善強(qiáng)氧化劑誘導(dǎo)的大鼠腦組織氧化應(yīng)激損傷[13]。CGA亦能通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2表達(dá)，改善乙醇誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡[14]。CGA還可以通過(guò)抑制p38分裂原激活蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞[15]。但針對(duì)AD特征病理Aβ和tau蛋白的研究尚少見(jiàn)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Model組比較，CGA各組細(xì)胞存活率升高、凋亡率下降，細(xì)胞內(nèi)SOD和GSH-Px活力升高、MDA水平降低；同時(shí)，NF-κB、IL-1β和TNF-α蛋白表達(dá)水平下降。提示CGA對(duì)Aβ25-35致PC12細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與CGA可以對(duì)抗Aβ毒性，提高細(xì)胞抗氧化能力，抑制NF-κB介導(dǎo)的炎癥通路有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)定了25、50和100 μmol/L 3個(gè)濃度CGA干預(yù)細(xì)胞損傷模型。CGA 25 μmol/L與50 μmol/L組間比較，可見(jiàn)隨著CGA濃度升高細(xì)胞的存活率相應(yīng)提高，而CGA 100 μmol/L較50 μmol/L組的存活率有所下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示這一現(xiàn)象是CGA濃度過(guò)高而出現(xiàn)的毒性作用，或是CGA 50 μmol/L已達(dá)到其最大效應(yīng)濃度，尚有待進(jìn)一步研究。

機(jī)體的生理環(huán)境與體外的細(xì)胞環(huán)境差別很大，影響因素更加復(fù)雜。CGA對(duì)AD模型動(dòng)物是否也能發(fā)揮其抗炎抗氧化的多重神經(jīng)保護(hù)作用有待深入研究。

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[收稿2017-02-14;修回2017-03-10]

(編輯：王靜)

Protective effect of chlorogenic acid on β-amyloid protein 25-35 induced PC12 cell death

LinMao,WangMin,LiuFang,LuoXiaojin,GaoShiqin,WangChunmei

(Zhuhai Key Laboratory of Fundamental and Applied Research in Traditional Chinese Medicine,Zhuhai Campus of Zunyi Medical University,Zhuhai Guangdong 519041,China)

Objective To observe the protective effect of chlorogenic acid (CGA) on the death of rat pheochromocytoma (PC12) cells induced by β-amyloid protein 25-35 (Aβ25-35),and explore its possible mechanisms.Methods Aβ25-35was used to induce PC12 cell death.Cells were interfered with three different concentrations of CGA.CCK-8 kit was used to detect cell viability.Cell apoptosis rate was detected by flow cytometry.Photocolorimetric method was applied to detect the MDA content and GSH-Px and SOD activity.Western blot assay was used to detect the intracellular expression of nuclear factor kappa B (NF-κB) and interleukin-1β (IL-1β).The intracellular concentration of tumor necrosis factor-α (TNF-α) was measured by enzyme immunoassay assay (ELISA).Results Compared with the control group,PC12 cells viability of the model group were significantly reduced.The apoptosis rate of the model group was increased.The levels of intracellular SOD and GSH-Px were decreased and the MDA level was increased.The expressions of NF-κB,IL-1β and TNF-α were increased.Compared with the model group,the PC12 cells viability of CGA groups were significantly increased.The apoptosis rate of CGA groups were reduced.The levels of intracellular SOD and GSH-Px were increased and the MDA level was decreased.The expressions of NF-κB,IL-1β and TNF-α were declined.Conclusion CGA has a protective effect on Aβ25-35-induced PC12 cells death.The mechanisms may be related to the improvement of the antioxidant ability and the inhibition of NF-κB signaling pathway activation.

chlorogenic acid; β-amyloid protein; PC12 cells; Alzheimer’s disease

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO：81560562)；貴州省科技廳資助項(xiàng)目(NO：黔科合J字[2013]2314)；貴州省教育廳資助項(xiàng)目(NO：黔教科[2009]0108);珠海市中藥基礎(chǔ)及應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(NO：ZYKL-2016K6)。

王春梅，女，碩士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機(jī)制及藥物防治，E-mail:linmao3000@163.com。

R285.5；R741

A

1000-2715(2017)02-0161-05