袁慧敏，何茳萍，張光亞，張丹丹，陳鳳玲

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院 臨床學(xué)院，安徽 蚌埠 233030； 2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院 內(nèi)分泌科，上海 201900)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

OC-STAMP基因過表達(dá)載體及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建

袁慧敏1，何茳萍2，張光亞2，張丹丹2，陳鳳玲2

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院 臨床學(xué)院，安徽 蚌埠 233030； 2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院 內(nèi)分泌科，上海 201900)

目的 構(gòu)建破骨細(xì)胞多次跨膜蛋白(OC-STAMP)基因過表達(dá)質(zhì)粒，體外轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，為進(jìn)一步研究OC-STAMP的功能提供工具。方法 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中OC-STAMP基因信息，設(shè)計引物，采用PCR擴(kuò)增其基因片段; 運(yùn)用基因重組方法雙酶切目的基因，并將其克隆至含有綠色熒光蛋白(GFP)的pCDH-CMV慢病毒載體，經(jīng)酶切測序?qū)χ亟M質(zhì)粒進(jìn)行鑒定；轉(zhuǎn)染成功構(gòu)建的質(zhì)粒至293T細(xì)胞中Western blotting驗證蛋白過表達(dá)情況；采用psPAX2和pMD2.G兩種包裝質(zhì)粒包裝pCDH-CMV-oc-stamp重組質(zhì)粒獲得病毒液，病毒感染RAW264.7細(xì)胞獲得OC-STAMP過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，Q-PCR和Western blotting驗證蛋白過表達(dá)情況。結(jié)果 酶切和測序鑒定表明成功構(gòu)建pCDH-CMV-oc-stamp的基因重組質(zhì)粒; 將成功構(gòu)建的pCDH-CMV-oc-stamp質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T，可觀察到大量綠色熒光表達(dá); 將成功包裝獲得的病毒液感染RAW264.7細(xì)胞后q-PCR及Western blotting結(jié)果證實OC-STAMP成功過表達(dá)。結(jié)論 成功構(gòu)建pCDH-CMV-oc-stamp重組質(zhì)粒及OC-STAMP過表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。

破骨細(xì)胞多次跨膜蛋白；質(zhì)粒構(gòu)建;病毒轉(zhuǎn)染；RAW264.7細(xì)胞

破骨細(xì)胞跨膜蛋白(Osteoclast stimulatory transmembrane protein，OC-STAMP) 是Yang等[1]于2008年在經(jīng)核因子B受體活化因子配體( receptor activator of nuclear factor-Bligand，RANKL) 誘導(dǎo)后的小鼠巨噬細(xì)胞株RAW 264.7細(xì)胞及原代骨髓巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一個多次跨膜蛋白。小鼠的OC-STAMP基因位于2號染色體上，與人的同源性和相似性分別為74%和86%。該基因結(jié)構(gòu)上高度保守，蛋白表達(dá)廣泛，且具有組織特異性，已經(jīng)證實OC-STAMP在肝臟、心臟及腦等組織中高表達(dá)，這提示OC-STAMP可能具有重要的生理功能[2]。OC-STAMP作為近年來新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞融合相關(guān)蛋白分子，主要調(diào)控破骨細(xì)胞融合和異物巨噬細(xì)胞融合[3-16]，但關(guān)于OC-STAMP的功能研究仍不明確。在我們的前期工作中，利用Affymetrix mouse 430 2.0基因表達(dá)譜芯片雜交技術(shù)觀察到小鼠OC-STAMP基因在糖尿病模型小鼠db/db鼠的腹腔靜置巨噬細(xì)胞中表達(dá)明顯下調(diào)，其表達(dá)量是同窩野生型對照組小鼠的1/13，并在小鼠原代腹腔靜置巨噬細(xì)胞mRNA水平也驗證了以上結(jié)果。同時我們成功制備了OC-STAMP的多克隆抗體[17]?？紤]到OC-STAMP基因是一個功能尚不清楚的基因，且在小鼠糖尿病代謝狀態(tài)中有明顯變化，因此我們設(shè)想糖尿病狀態(tài)的一些代謝因素(如高血糖、高血脂、炎癥因子等)可降低OC-STAMP的表達(dá)水平，OC-STAMP可能參與相關(guān)代謝環(huán)節(jié)。為進(jìn)一步研究OC-STAMP的蛋白功能及其對糖尿病的代謝狀態(tài)的可能影響，我們擬構(gòu)建OC-STAMP過表達(dá)載體及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，為后期的功能機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，提供研究工具。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 主要試劑 大腸埃希菌菌株DH 5 購于康為世紀(jì)公司; 限制性內(nèi)切酶Nhe I/Not I、T 4連接酶、Q 5高保真聚合酶均購自NEB公司; 所用引物均訂購于上海生工有限公司；5 000 bp DNA maker購于上海業(yè)立生物技術(shù)有限公司; 質(zhì)粒大抽提試劑盒購自上海天根生物科技公司；小質(zhì)粒抽提試劑盒購于TaKaRa公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3 000購自Invitrogen公司；Polybrene及Puromycin購自Sigma公司；小鼠單核細(xì)胞株RAW 264.7細(xì)胞購自ATCC細(xì)胞庫；293 T細(xì)胞受贈于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院燒傷科實驗室。

1.1.2 主要儀器 超凈工作臺(海爾A 2生物)，倒置熒光相差顯微鏡(Olympus，日本)，低溫離心機(jī)(Eppendorf，德國)，PCR 基因擴(kuò)增儀(ABI 公司，美國)，Bio-RAD電泳儀和瓊脂糖水平電泳槽(BIO-RAD)，F(xiàn)usion FX 7圖像掃描分析儀器(Viber，法國)，隔水恒溫振蕩箱(培英實驗設(shè)備有限公司)，隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司),超濾管(Millipore，美國)，10 cm2/6 cm2/3 cm2細(xì)胞培養(yǎng)皿、15 mL/5 mL離心管、6孔板、 96孔板(Corning，美國)，1 000 μL/100 μL/10 μL/2.5 μL移液槍(Eppendorf，德國)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的鼠OC-STAMP基因編碼區(qū)( CDS區(qū))序列，經(jīng)PrimerPremier 5分析，并依據(jù)質(zhì)粒載體pCDH-CMV的多克隆位點設(shè)計相應(yīng)引物; 在引物前分別添加Nhe I/Not I酶切位點序列及保護(hù)堿基，上游引物引入Nhe I位點，下游引入Not I位點，引物序列由上海生工有限公司合成。擴(kuò)增引物序列及酶切位點序列(見表1)。

表1 擴(kuò)增引物序列及酶切位點序列

基因引物名稱引物序列(5'-3')產(chǎn)物長度(bp)OC-STAMPpLenti-CMV-OC-STAMP-FCTAGCTAGCGCCACCATGAGGACCATCAGGGCAGCCACGGpLenti-CMV-OC-STAMP-RATTTGCGGCCGCCTACTCGAGGTCATATGGAGGCCCA 1496

劃線部分為酶切位點，前面為保護(hù)堿基。

1.2.2 OC-STAMP基因的擴(kuò)增質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 以小鼠單核細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞的總RNA反轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板，PCR擴(kuò)增OC-STAMP基因序列目的片段(95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，64 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s為1個循環(huán)，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物，割膠回收試劑盒純化回收后和pCDH-CMV載體都進(jìn)行Nhe I/Not I雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建為pLenti-CMV-OC-STAMP重組質(zhì)粒。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH 5感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃溫箱孵育14 h，獲得在氨芐抗生素篩選平板上生長的菌落; 挑取陽性克隆后4 mL LB液體培養(yǎng)基(含氨芐抗生素1∶1 000)，180～220 rpm，37 ℃ 14 h，應(yīng)用小提試劑盒抽取質(zhì)粒(Takara)，再經(jīng)雙酶切鑒定，將酶切大小正確的陽性質(zhì)粒送上海生工有限公司測序分析，結(jié)果經(jīng)Blast比對。

1.2.3 293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染及病毒包裝 質(zhì)粒驗證構(gòu)建成功后，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH 5感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃溫箱孵育14 h，獲得在氨芐抗生素篩選平板上生長的菌落; 挑取陽性克隆后100 mL LB液體培養(yǎng)基(含氨芐抗生素1∶1 000)，200～250 rpm，37 ℃ 14 h，應(yīng)用大提試劑盒抽取質(zhì)粒(天根)。質(zhì)粒抽提成功后，利用Lipofectamine 3 000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察熒光判斷轉(zhuǎn)染程度。并用Western blot驗證OC-STAMP過表達(dá)情況。采用兩包裝質(zhì)粒系統(tǒng)(psPAX2/pMD2.G)包裝目的質(zhì)粒，以各質(zhì)粒個數(shù)比(目的質(zhì)粒:psPAX2∶pMD2.G=1∶1 ∶1)混合后用Lipofectamine 3 000共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞，分別收集48和72 h的病毒液，并用過濾器(Millipore)5 000 rpm×15 min過濾收集濃縮病毒液，于-80 ℃保存。

1.2.4 OC-STAMP過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建 將RAW 264.7細(xì)胞以1×105/孔的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞鋪板約50%～60%時換用病毒液1 mL(含Polybrene 8 μg/mL)，培養(yǎng)約4～6 h后用低血清培養(yǎng)液opti-medium(Hyclone)補(bǔ)到2 mL，繼續(xù)培養(yǎng)，第二天換液。繼續(xù)培養(yǎng)約72 h后，加入Puromycin 2.5 μg/mL進(jìn)行篩選3 d。最終獲得的細(xì)胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)，q-PCR和Western blot驗證OC-STAMP穩(wěn)定過表達(dá)。

1.2.5 熒光定量PCR Trizol法提取OC-STAMP過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)系RAW 264.7細(xì)胞和對照組正常細(xì)胞的總RNA，RNA濃度通過Nanodrop光度計檢測(260 nm/280 nm)。1 μg總量RNA采用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RT反應(yīng)，生成cDNA。SYBR Green熒光定量法檢測OC-STAMP mRNA水平，反應(yīng)體系20 μL(SYBR premix Ex TaqII 10 μL；PCR forward/reverse primer各0.8 μL；dH2O 6.4 μL；模板cDNA 2 μL)預(yù)變性95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s為1個循環(huán)，共40循環(huán)。所用引物序列(見表2)。

表2 熒光定量PCR引物序列

基因引物名稱引物序列(5'-3')Mouser18SMouser18S-FTTCTGGCCAACGGTCTAGACAACMouser18S-RCCAGTGGTCTTGGTGTGCTGAOC-STAMPOC-STAMP-FATGAGGACCATCAGGGCAGCCACGOC-STAMP-RGGAGAAGCTGGGTCAGTAGTTCGT

1.2.6 Western blotting檢測OC-STAMP 293 T細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCDH-CMV-oc-stamp重組質(zhì)粒及pCDH-CMV-vector后48 h和過表達(dá)OC-STAMP穩(wěn)轉(zhuǎn)株RAW 264.7細(xì)胞及對照組細(xì)胞鋪滿皿約90%時，吸棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS輕洗3遍，加入含有蛋白酶抑制PMSF-NaF的細(xì)胞裂解液RIPA(P 0013，Beyotime)，收集蛋白，離心取上清，BCA(Beyotime)測定蛋白濃度。取適量蛋白加入loading buffer混勻，99 ℃加熱5 min，等量上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉1～2 h，分別用OC-STAMP抗體(1 ∶500，Santa Cruz Biotechnology)和兔GAPDH抗體(1 ∶1 000，CST)4 ℃孵育過夜，TBST洗3次，每次5～10 min。分別用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔(1∶5 000，Jackson)二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜，添加ECL化學(xué)發(fā)光顯色液，顯影讀片。

2 結(jié)果

2.1 重組pCDH-CMV/OC-STAMP質(zhì)粒的鑒定 將構(gòu)建好的pCDH-CMV/OC-STAMP重組質(zhì)粒用NehI及NotI進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后出現(xiàn)的條帶與預(yù)測的大小相一致(見圖1 A)，進(jìn)一步經(jīng)測序證實所構(gòu)建的小鼠OC-STAMP蛋白表達(dá)載體序列正確，框架基本無誤(見圖1 B)。

A：重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定；B：重組質(zhì)粒測序的部分序列。1：為重組質(zhì)粒未用限制性內(nèi)切酶酶切；2：為重組質(zhì)粒雙酶切后。圖1 pLenti-CMV-OC-STAMP重組質(zhì)粒的雙酶切及測序

2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后的熒光表達(dá)及OC-STAMP蛋白表達(dá) 將成功構(gòu)建的pCDH-CMV/OC-STAMP重組質(zhì)粒以及對照vector質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞48 h后可見大量綠色熒光，提示質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染，并表達(dá)GFP(見圖2 A)。然后收集細(xì)胞，用RIPA裂解提取總蛋白，Western blot結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染pCDH-CMV/OC-STAMP重組質(zhì)粒后，293 T細(xì)胞中OC-STAMP表達(dá)量顯著增高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(見表3和圖2 B)。進(jìn)一步證明重組質(zhì)粒的構(gòu)建成功。

A：對照空載質(zhì)粒和重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞48 h后，熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)(×100，圖中標(biāo)尺為100 μm)。B：對照空載質(zhì)粒和重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞后，OC-STAMP的蛋白表達(dá)。*：P<0.05。圖2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后的熒光GFP表達(dá)及OC-STAMP的蛋白表達(dá)

蛋白組別面積平均灰度值累計光密度GAPDH空載對照2728.00±35.03197.02±3.38537387±3453.80質(zhì)粒轉(zhuǎn)染2834.30±27.10192.79±0.19546361±1737.15OC-STAMP空載對照3546.00±40.36150.78±1.56534631±587.73 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染7269.67±49.16189.17±1.901375188±6215.01

2.3 熒光定量PCR和Western blot驗證穩(wěn)轉(zhuǎn)RAW264.7細(xì)胞后OC-STAMP的表達(dá) 采用psPAX2/pMD2.G兩包裝質(zhì)粒系統(tǒng)包裝目的質(zhì)粒獲得病毒液后，感染RAW 264.7細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選后傳代培養(yǎng)獲得表達(dá)OC-STAMP的穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞。Trizol法提取總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成cDNA，并進(jìn)行熒光定量PCR檢測。如圖3 A和表4所示，與感染對照組細(xì)胞相比，過表達(dá)感染組細(xì)胞中的OC-STAMP mRNA水平顯著提高，并且具有統(tǒng)計學(xué)意義。同時采用RIPA裂解液裂解穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，Western blot結(jié)果顯示：過表達(dá)OC-STAMP的穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞系成功過表達(dá)了OC-STAMP蛋白含量，較空白對照組增加了約2.5倍(見表5和圖3 B)。以上結(jié)果顯示OC-STAMP的過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建成功。

A：重組質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)RAW 264.7細(xì)胞后OC-STAMP的mRNA水平；B：重組質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)RAW264.7細(xì)胞后OC-STAMP的蛋白水平。*：P<0.05；**：P<0.01。圖3 重組質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)RAW 264.7細(xì)胞后OC-STAMP的表達(dá)

基因組別Ct△Ct△△Ct2-△△Ctr18s感染對照14.79±0.05---質(zhì)粒感染14.91±0.08---OC-STAMP感染對照24.72±0.169.93±0.15--質(zhì)粒感染18.33±0.11 3.42±0.09**-6.51±0.1391.14±0.21

與感染對照組相比，**P<0.01。

蛋白組別面積平均灰度值累計光密度GAPDH感染對照2364.33±42.12151.95±2.03359210±2715.77質(zhì)粒感染2041.33±80.69156.92±4.63320084±6026.59OC-STAMP感染對照1727.33±24.50147.03±1.17253943±1601.90質(zhì)粒感染3457.67±38.55157.31±0.33543918±6012.85

3 討論

OC-STAMP基因的功能尚不明確。以往研究表明，OC-STAMP在經(jīng)RANKL誘導(dǎo)后表達(dá)量可明顯上調(diào)，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化和融合，且呈劑量依賴性[1]。Kim等[2]在RANKL誘導(dǎo)下的RAW 264.7和原代骨髓巨噬細(xì)胞中，分別加入PKCβ、Akt、P38、NF-κB、c-Jun氨基末端激酶(JNK)等的阻斷劑均可引起OC-STAMP mRNA表達(dá)水平的下調(diào)。同樣是在小鼠巨噬細(xì)胞株RAW 264.7及原代骨髓巨噬細(xì)胞中，氧化低密度脂蛋白可通過抑制ERK、P38、JNK和轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、NFAT的活性來阻斷RANKL信號通路，從而抑制破骨細(xì)胞分化，且這種抑制作用呈劑量依賴性[18]。高濃度右旋葡萄糖則能通過抑制細(xì)胞內(nèi)ROS的釋放抑制NF-κB活性，還能抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化及趨化運(yùn)動[19]。致炎因子白介素17可直接刺激多種細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞等)分泌RANKL，同時還可以通過刺激細(xì)胞合成分泌IL-1、L-6等促進(jìn)細(xì)胞分泌RANKL，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成，促進(jìn)骨吸收[20]。

RANKL是目前發(fā)現(xiàn)的惟一具有誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化發(fā)育發(fā)揮功能的因子，與NF-κB受體活化因子(receptoractivatorof nuclearfactor-B，RANK)結(jié)合后可引起RANK結(jié)構(gòu)的改變，激活位于RANK胞質(zhì)側(cè)的腫瘤壞死因子受體連接蛋白6(TRAF 6)，形成RANK-TRAF 6受體復(fù)合物，進(jìn)而通過招募下游信號因子(PKC、NFAT、P38、JNK及NF-κB等)激活NF-κB、MAPK、PI3K/Akt等通路[21]，形成RANKL-RANK軸，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的分化成熟，抑制凋亡維持存活，影響巨噬細(xì)胞的分化移行[18-19,21]。

本實驗從小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW 264.7中提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄、聚合酶鏈反應(yīng)得到小鼠OC-STAMP的全長序列，克隆至pCDH-CMV的慢病毒載體中，雙酶切及基因測序表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，與NCBI基因庫中的鼠OC-STAMP堿基序列基本符合。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293 T細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察到大量熒光，提示具有良好的轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)效率。最后，提取過表達(dá)組及對照組細(xì)胞的總蛋白，經(jīng)Western blot進(jìn)一步證實過表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建成功。質(zhì)粒的成功構(gòu)建為深入了解OC-STAMP的蛋白功能提供了有效工具。

此后，我們進(jìn)一步構(gòu)建了過表達(dá)OC-STAMP的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。Real-time PCR和Western blot的結(jié)果顯示，RAW 264.7穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞較好地過表達(dá)了OC-STAMP。本實驗最終獲得的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系是混合細(xì)胞系，后期可能會存在細(xì)胞的過表達(dá)效應(yīng)降低。由于實驗技術(shù)能力局限，未能將該穩(wěn)轉(zhuǎn)系成功單克隆化。但我們會繼續(xù)探索，盡可能將該穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系單克隆化。

膜蛋白在免疫反應(yīng)中扮演著非常重要的作用，他們與相應(yīng)的配體(如炎癥因子、生長因子、趨化因子等)結(jié)合，激活下游信號通路，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)?；谝延醒芯拷Y(jié)果和我們的前期工作，我們設(shè)想OC-STAMP參與了RANKL-RANK軸引發(fā)的巨噬細(xì)胞相關(guān)的反應(yīng)，有可能在糖尿病狀態(tài)下的大血管病變進(jìn)程中扮演某種角色。在現(xiàn)有的研究基礎(chǔ)上應(yīng)用慢病毒攜帶的過表達(dá)技術(shù)和沉默技術(shù)以及抗體中和技術(shù)，觀察OC-STAMP對于巨噬細(xì)胞的調(diào)控作用及潛在機(jī)制，并尋找其可能配體。本實驗構(gòu)建的OC-STAMP過表達(dá)載體及過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞的成功制備將有助于對OC-STAMP在巨噬細(xì)胞中信號通路的調(diào)控機(jī)制展開更深入的研究。

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[收稿2017-02-10;修回2017-03-22]

(編輯：王靜)

Construction of the OC-STAMP over-expressed vector and its stable expression cell strain

YuanHuimin1，HeJiangping2,ZhangGuangya2,ZhangDandan2,ChenFengling2

(1.Clinical College,Bengbu Medical College，Bengbu Anhui 233030，China;2.Department of Endocrinology，Shanghai Ninth People’s Hospital，School of Medicine of Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 201900，China)

Objective To construct the Osteoclast stimulatory transmembrane protein (OC-STAMP) over-expressed plasmid and transfect RAW264.7 cell in vitro to construct stable expression cell strain.Methods Primers were designed according to the gene information on OC-STAMP in National Center for Biotechnology Information,and the OC-STAMP gene was amplified by Polymerase Chain Reaction (PCR).Using the gene recombination technology，the double enzyme-digested OC-STAMP gene was cloned into the pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro vector with GFP.Recombined plasmids were identified with enzyme digestion and sequencing and transfected into 293T cell,.Western blotting was used to detect its expression.Lentiviruses were harvested using pLenti-CMV-OC-STAMP co-transfected with psPAX2 and pMD2.G into HEK293T cells，then RAW264.7 cells were transduced with lentiviruses.Quantitative real-time RT-PCR and western blotting were used to confirm its over-expression.Results The results of enzyme digestion and sequencing revealed that the recombinant plasmids pLenti-CMV-OC-STAMP was successfully constructed.After transfecting 293T cells with the successfully constructed plasmid pLenti-CMV-OC-STAMP，a largeamount of green fluorescence was observed.After transfecting RAW264.7 cells with lentiviruses，the results of quantitative real-time RT-PCR and western blotting showed that the successful over-expression of pLenti-CMV-OC-STAMP.Conclusion The recombinant plasmids pLenti-CMV-OC-STAMP is successfully constructed and the stable expression cell strain is also constructed successfully.

osteoclast stimulatory transmembrane protein; plasmid construction; lentiviruses transfection; RAW264.7 cells.

上海市寶山區(qū)科學(xué)技術(shù)委員會科研項目(NO：14-E-3)；上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士創(chuàng)新基金資助項目(NO：BXJ201638)。

陳鳳玲，女，博士，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，研究方向：糖尿病大血管病變發(fā)病機(jī)制及干預(yù)、線粒體糖尿病的基因突變與糖脂代謝紊亂，E-mail：cfl1993@126.com。

R589.9

A

1000-2715(2017)02-0143-07