李小波，彭榜亞，楊江權(quán)，陳 陽(yáng)

(1.遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū) 診斷學(xué)教研室，廣東 珠海 519000；2.遵義醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)和分子生物學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；3.遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū) 藥學(xué)教研室，廣東 珠海 519000)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

桃仁、紅花對(duì)UUO大鼠腎組織ILK、E-cad、FN和α-SMA表達(dá)的影響

李小波1，彭榜亞2，楊江權(quán)2，陳 陽(yáng)3

(1.遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū) 診斷學(xué)教研室，廣東 珠海 519000；2.遵義醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)和分子生物學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；3.遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū) 藥學(xué)教研室，廣東 珠海 519000)

目的 探討桃仁、紅花及其藥對(duì)對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)大鼠腎組織ILK、FN、α-SMA及E-cadherin表達(dá)的影響。方法 健康SD大鼠隨機(jī)分為5組，每組6只，除正常組外，其余大鼠行單側(cè)輸尿管梗阻手術(shù)。正常組、模型組給予2 mL蒸餾水灌喂，桃仁組、紅花組、桃仁+紅花組分別給予6 g/(kg·d)的灌喂量。連續(xù)灌喂14 d后處死大鼠，取出手術(shù)側(cè)腎臟，HE染色觀察腎臟病理變化，qPCR和western blot檢測(cè)腎組織中整合素連接激酶(integrin-linked kinase，ILK)、纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、α-平滑肌激動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)及E-鈣黏蛋白(E-cadherin，E-cad)基因和蛋白表達(dá)。結(jié)果 腎臟組織形態(tài)學(xué)觀察顯示，與正常組相比，模型組大鼠梗阻側(cè)腎臟，腎間質(zhì)表現(xiàn)出明顯腫脹，纖維化程度重；模型組的E-cad表達(dá)降低，ILK、FN及α-SMA的表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組相比，各治療組的腎臟病理改變減輕，E-cad表達(dá)升高(P<0.05)，ILK、FN及α-SMA的表達(dá)降低(P<0.05)；且以桃仁+紅花組的效果更佳。結(jié)論 桃仁、紅花及其藥對(duì)可通過(guò)升高E-cadherin和降低ILK、FN及α-SMA的表達(dá)來(lái)減緩腎間質(zhì)纖維化，以桃仁-紅花藥對(duì)的效果更好。

桃仁；紅花；單側(cè)輸尿管梗阻；整合素連接激酶

腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)是所有慢性腎臟疾病進(jìn)展為慢性腎衰竭的共同通路和病理改變，其主要病理表現(xiàn)成纖維細(xì)胞增殖造成的大量基質(zhì)蛋白積聚。腎小管上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)是RIF的關(guān)鍵機(jī)制，即腎小管上皮細(xì)胞激活成為具有分泌和收縮能力的肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast，MyoF)，MyoF分泌大量的膠原沉積于腎間質(zhì)，導(dǎo)致纖維化的發(fā)生。鈣依賴性跨膜糖蛋白(E-cadherin，E-cad)是上皮細(xì)胞標(biāo)志物，在腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過(guò)程中，主要就是E-cad代表的腎小管上皮細(xì)胞減少，而α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)標(biāo)志的間質(zhì)細(xì)胞增加[1]。整合素連接激酶(integrin linked kinase，ILK)是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，不僅可加強(qiáng)整合素與纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)的結(jié)合，調(diào)節(jié)由整合素介導(dǎo)的FN等細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrixc，ECM)的聚集，而且對(duì)腎小管上皮細(xì)胞EMT起著重要調(diào)節(jié)作用[2-3]。

桃仁-紅花藥對(duì)是傳統(tǒng)的活血化瘀藥物，研究表明桃仁、紅花可以延緩多臟器纖維化[4-6]，但是兩者相須配伍是否可以加強(qiáng)這種作用，鮮有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)以單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)大鼠為研究對(duì)象，觀察桃仁、紅花及其藥對(duì)對(duì)UUO模型大鼠腎組織ILK、E-cadherin、FN、α-SMA表達(dá)的影響，進(jìn)一步揭示桃仁、紅花及其藥對(duì)抗腎纖維化的作用機(jī)制是否與ILK誘導(dǎo)的EMT有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)雄性SD大鼠，10～12周齡，體重(200±20) g；購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：XK粵2013-0046。大鼠自由進(jìn)食和飲水，溫度(23±2)℃，濕度控制在40%～70%，采用交替燈光照射12 h，每籠子飼養(yǎng)6只。

1.2 藥物與試劑 桃仁、紅花顆粒劑購(gòu)于江陰天江藥業(yè)有限公司(產(chǎn)品批號(hào)：1307092、1207072)。Prime Script RT reagent kit和SYBR Premix EX Taq Ⅱ購(gòu)自大連寶生物有限公司，批號(hào)為RR047A和RR820A; BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司。兔抗大鼠ILK、E-cadherin、FN和α-SMA抗體購(gòu)自武漢天鷹試劑公司，批號(hào)分別為：12955、20874、15613和14395。

1.3 儀器 奧林巴斯生物顯微鏡BX-43(日本OLYMPUS公司)，PCR擴(kuò)增儀7500(美國(guó)ABI公司)。

1.4 方法

1.4.1 UUO模型的制備 用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，脊背部左肋脊角處做一縱行切口，分離出輸尿管并且結(jié)扎，即為單側(cè)輸尿管梗阻動(dòng)物模型。

1.4.2 動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn) 30只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分組：正常組、模型組、桃仁組、紅花組和桃仁+紅花組，每組6只。正常組、模型組于每日灌喂2 mL蒸餾水1次，桃仁組、紅花組、桃仁+紅花組(桃仁、紅花比例為1∶1)按6 g/(kg·d)日將顆粒藥稀釋成2 mL，一次灌胃，手術(shù)次日開(kāi)始灌喂，連續(xù)灌喂14 d，處死大鼠，取出腎臟。一部分腎臟用作HE染色切片觀察，一部分用作qPCR和Western blot檢測(cè)。

1.4.3 形態(tài)學(xué)觀察及檢測(cè)方法

1.4.3.1 HE病理切片觀察 取出腎臟用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋并切片，將組織切片按常規(guī)方法進(jìn)行HE染色，光鏡觀察腎小球、腎小管和間質(zhì)的病理變化。顯微鏡400倍下連續(xù)記錄不重疊10個(gè)視野的數(shù)值，小管間質(zhì)損害的特征按Banff分級(jí)進(jìn)行0～3+半定量計(jì)分：無(wú)變化評(píng)0分，輕度改變?cè)u(píng)1分(病變范圍<25%)；中度評(píng)2分(病變范圍26%～50%)；嚴(yán)重評(píng)3分(病變范圍>50%)[7]。

1.4.3.2 qPCR檢測(cè)ILK、FN、α-SMA及E-cadherin的基因表達(dá) 取80 mg腎組織用TRIzon法提取總RNA，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA 合成，作為模板，引物序列見(jiàn)表1，進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)，反應(yīng)體積為20 μL:cDNA 2.0 μL，上、下游引物各0.8 μL，2× SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，ddH2O 6.4 μL。反應(yīng)條件為第一步預(yù)變性：95 ℃，30 s，1個(gè)循環(huán)；第二步PCR反應(yīng)：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。結(jié)果使用Bio-Rad CFX Manager熒光定量軟件進(jìn)行分析用公式2-△△Ct方法。

表1 引物序列

基因序列(5'-3')ILKForward:TTTTGCCGTGCTTCTGTGGReverse:CGTGGGGGGAAATACCTGE-cadherinForward:AGGTCGGTGCCCGTATTGReverse:TGGTCTTGGGGTCTGTGATGFNForward:GTTGGTTGCCCTGTTCTGCReverse:GGCTACCTGTGTTTCCCTTTGα-SMAForward:CTGAACCCTAAGGCCAACCGReverse:CTCCAGAGTCCAGCACAATACCGADPHForward:CATCAACGACCCCTTCATTGReverse:GAAGATGGTGATGGGTTTCC

1.4.3.3 Western blot 取80 mg大鼠腎臟組織加入1 mL裂解液，12 000 rmp離心10 min，取上清，根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，加20 μL蛋白上樣在10% SDS-PAGE中電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將膜浸在封閉液中低速搖勻封閉2 h，將膜取出直接放入一抗中，4 ℃封閉過(guò)夜；PBST洗膜，5 min×10次；將膜轉(zhuǎn)入二抗中，室溫，孵育1～2 h；PBST洗膜， 5 min×10次；用化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腎臟形態(tài)學(xué)及病理切片觀察 正常組腎臟未見(jiàn)病理改變，模型組腎小管上皮細(xì)胞大量萎縮、變性，間質(zhì)內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，呈現(xiàn)明顯的間質(zhì)纖維化。與正常組比較，模型組HE評(píng)分明顯升高 (P<0.05) ，說(shuō)明造模成功，大鼠腎臟出現(xiàn)腎間質(zhì)纖維化改變。與模型組比較，各治療組HE評(píng)分明顯降低 (P<0.05)，說(shuō)明桃仁、紅花對(duì)腎間質(zhì)纖維有確切的防治作用。并且以桃仁、紅花藥對(duì)治療組效果最佳，說(shuō)明聯(lián)合使用較單獨(dú)使用效果更佳(見(jiàn)圖1和表2)。

A：正常組；B：模型組；C：桃仁組；D：紅花組；E：桃仁+紅花藥對(duì)組。圖1 大鼠腎臟病理切片觀察(HE，×400)

組別腎間質(zhì)損傷評(píng)分正常0.06±0.03模型2.82±0.43#桃仁2.34±0.45*紅花2.32±0.33*桃仁+紅花1.91±0.32*

與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

2.2 桃仁、紅花及其藥對(duì)調(diào)節(jié)ILK、FN、α-SMA及E-cadherin基因表達(dá) 與正常組相比，模型組的ILK、FN、α-SMA的表達(dá)較高(P<0.05)，E-cadherin的表達(dá)較低(P<0.05)；與模型組相比較，各治療組的ILK、FN、α-SMA的表達(dá)下降(P<0.05)，E-cadherin的表達(dá)上升(P<0.05，見(jiàn)圖2)。

與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較， *P<0.05。 圖2 桃仁、紅花調(diào)節(jié)ILK、FN、α-SMA及E-cadherin基因表達(dá)

2.3 桃仁、紅花及其藥對(duì)調(diào)節(jié)ILK、FN、α-SMA及E-cadherin蛋白表達(dá) 與空白組比較，模型組大鼠腎組織ILK、FN、α-SMA蛋白表達(dá)均明顯上升(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)。與模型組相比，各治療組下調(diào)ILK、FN、α-SMA蛋白表達(dá)，升高E-cadherin蛋白表達(dá)(P<0.05)。但桃仁-紅花藥對(duì)效果更好(見(jiàn)圖3和圖4)。

與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。 圖3 桃仁、紅花調(diào)節(jié)ILK、FN、α-SMA、E-cadherin蛋白表達(dá)

圖4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)條帶圖

3 討論

方劑配伍講究君臣佐使，整合多種藥物針對(duì)病變發(fā)揮出更加全面而副作用小的療效，相比單味中藥，方劑中的藥物不僅僅是簡(jiǎn)單的疊加，而是發(fā)生了復(fù)雜的效應(yīng)。深入研究方劑配伍是中醫(yī)發(fā)展的關(guān)鍵問(wèn)題之一，探明中醫(yī)方劑的配伍療效機(jī)制，有利于中醫(yī)藥走向世界，更好地為患者服務(wù)。藥對(duì)是中醫(yī)臨床常用的相對(duì)固定的兩味中藥的配伍組合，是中藥配伍的基本形式，傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為兩味中藥配伍可相須、相對(duì)、相使，但是缺乏現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的理論研究。桃仁-紅花是相須配伍，用于治療血瘀證，可活血化瘀，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為兩者同時(shí)應(yīng)用于患者，可以加強(qiáng)治療的效果。李均等[8-9]觀察了桃仁對(duì)UUO模型大鼠的影響，發(fā)現(xiàn)桃仁可以減輕炎性浸潤(rùn)，減緩纖維化，減少結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)表達(dá)，提示桃仁可以降低TGF-β、CTGF的過(guò)度表達(dá)，減緩腎間質(zhì)纖維化病程進(jìn)展。許慶友等[10-11]觀察紅花對(duì)UUO模型大鼠腎間質(zhì)纖維的影響，發(fā)現(xiàn)紅花明顯抑制腎小管上皮細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、α-SMA和Ⅲ型膠原(collagen-Ⅲ，Col-Ⅲ)的表達(dá)，從而有效緩解腎間質(zhì)的纖維化。孫時(shí)華等[12]運(yùn)用紅花的主要有效成分紅花黃色素對(duì)UUO大鼠模型進(jìn)行干預(yù)治療，發(fā)現(xiàn)紅花黃色素可降低腎間質(zhì)中FN和Ⅰ型膠原(collagen-Ⅰ Col-Ⅰ)蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞外基質(zhì)在腎間質(zhì)的堆積，延緩腎小管損傷及腎纖維化的進(jìn)展。在臨床使用中，桃仁、紅花經(jīng)常是以藥對(duì)的形式出現(xiàn)在復(fù)方中，但已有研究并沒(méi)有涉及到兩者聯(lián)合使用效果較單獨(dú)使用是否有加強(qiáng)。ILK作為T(mén)GF-β下游重要的效應(yīng)物，可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積[13]。桃仁、紅花及其藥對(duì)是否通過(guò)減少I(mǎi)LK表達(dá)，而抑制腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，延緩腎小管間質(zhì)纖維化的進(jìn)展，尚無(wú)報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，UUO造模后第14日，正常組大鼠ILK、α-SMA和FN在腎組織無(wú)或僅微量表達(dá)，E-cad表達(dá)顯著，而模型組大鼠ILK、α-SMA和FN表達(dá)增高，E-cad表達(dá)降低，說(shuō)明模型組出現(xiàn)了明顯的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，ILK可能參與了梗阻性腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生。而桃仁、紅花組能有效降低ILK、α-SMA和FN在腎小管上皮細(xì)胞和間質(zhì)中的表達(dá)，提高E-cad的表達(dá)。說(shuō)明桃仁、紅花可能是通過(guò)抑制ILK的表達(dá)，保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞，防止其轉(zhuǎn)分化，從而減少肌成纖維細(xì)胞的生成，減低細(xì)胞外基質(zhì)的聚集。各治療組均能降低ILK、α-SMA、FN的表達(dá)，升高E-cad表達(dá)，但未能到正常組的水平，說(shuō)明桃仁、紅花及其藥對(duì)只能延緩疾病的發(fā)展，并不能完全阻止RIF的發(fā)生發(fā)展；研究顯示桃仁-紅花藥對(duì)較單個(gè)藥物能夠更好延緩腎間質(zhì)纖維化，說(shuō)明桃仁-紅花藥對(duì)相須配伍有利于藥效的發(fā)揮。藥對(duì)作用的機(jī)制研究為進(jìn)一步研究其在復(fù)方中的作用奠定基礎(chǔ)，有助于我們繼續(xù)探討桃仁-紅花藥對(duì)在臨床慢性腎臟疾病的治療作用。

綜上所述，桃仁、紅花及其藥對(duì)能降低ILK、FN、α-SMA的表達(dá)，升高E-cadherin的表達(dá)，可能是其延緩腎間質(zhì)纖維化進(jìn)展的作用機(jī)制。本研究為中醫(yī)藥防治慢性腎功能衰竭提供了新的思路；并且通過(guò)對(duì)桃仁-紅花藥對(duì)的研究，為中藥組方提供依據(jù)，為進(jìn)一步研究相關(guān)復(fù)方的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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[收稿2017-01-05;修回2017-03-10]

(編輯：王靜)

Effects of Persicae Semen and safflower on the expressions of ILK,E-cad,FN and α-SMA in the renal tissue of unilateral ureteral obstruction rats

LiXiaobo1,PengBangya2,YangJiangquan2,ChenYang3

(1.Department of Diagnostics,Zhuhai Campus of Zunyi Medical University,Zhuhai Guangdong 519000,China; 2.Department of Biochemistry and Molecular Biology,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 3.Department of Pharmacy,Zhuhai Campus of Zunyi Medical University,Zhuhai Guangdong 519000,China)

Objective To investigate the effects of Persicae Semen and safflower on the expressions of integrin-linked kinase (ILK),fibronectin (FN),α- smooth muscle actin (α-SMA) and E-cadherin (E-cad) mRNA and protein in renal interstitial fibrosis (RIF) of obstructed kidneys in a unilateral ureteral obstruction (UUO) rat model.Methods Thirty SD rats were randomly divided into 5 groups:normal group,model group,Persicae Semen group,safflower group,Persicae Semen & safflower group.Normal and model groups were gavaged with steamed water and other treated groups were gavaged with relevant drugs.Rats were sacrificed and the specimens were collected on 14 d after UUO.HE staining was used to observe the pathological changes.ILK,E-cad,FN and α-SMA expressions were measured by qPCR and western blot analysis.Results The most obvious pathological changes were shown in the model group and Persicae Semen + safflower attenuated these pathological changes.Compared with the nomal group,the expressions of ILK,FN,and α-SMA were significantly increased,and E-caderin expression was decreased in the model group (P<0.05).Compared with the model group,the expressions of ILK,FN,and α-SMA were obviously decreased (P<0.05),and E-caderin expression was increased in all treated groups,with the better effects in Semen + safflower group.Conclusion Persicae Semen and safflower produces protection on renal function and renal tubular in UUO rat.This mechanisms might be related to increasing E-cadherin expression and decreasing the expressions of ILK,FN and α-SMA.

Persicae Semen; safflower; unilateral ureteral obstruction; integrin-linked kinase

貴州省聯(lián)合基金資助項(xiàng)目(NO：黔科合J字LKZ[2010]37)。

陳陽(yáng)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥藥理學(xué)，E-mail:chenyang197732@hotmail.com。

R285.5

A

1000-2715(2017)02-0134-05