許凌懿，謝 笛，朱宇航，朱昭瓊

(1.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 麻醉科，貴州 遵義 563099；2.貴州省麻醉與器官保護基礎研究重點實驗室，貴州 遵義 563099)

基礎醫(yī)學研究

七氟烷對大鼠海馬Tau蛋白基因的調控作用及其對認知的影響

許凌懿1，謝 笛2，朱宇航1，朱昭瓊1

(1.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 麻醉科，貴州 遵義 563099；2.貴州省麻醉與器官保護基礎研究重點實驗室，貴州 遵義 563099)

目的 探討新生期大鼠重復七氟烷麻醉后海馬內Tau蛋白mRNA表達水平的改變程度及其對認知功能的影響。方法 SPF級7日齡健康SD大鼠36只，體重15～18 g，雌雄不拘。首先隨機分為兩個組：2.6%七氟烷組(Sev2.6組，n=18)和對照組(Con組，n=18)。于大鼠出生后第7天(P7)、第14天(P14)和第21天(P21)進行重復七氟烷吸入麻醉處理及對照處理，Sev2.6組吸入2.6%七氟烷2 h，Con組吸入O21 L/min +Air 1 L/min 的混合氣體。再據(jù)大鼠生長的不同時期隨機分為3個亞組(新生期、幼年期、成年期)，于幼年期、成年期大鼠行Morris水迷宮實驗檢測大鼠行為學變化。水迷宮實驗結束后立即取海馬組織，采用RT-qPCR法測定Tau蛋白mRNA的表達水平。結果 隨測試天數(shù)的增加，兩組大鼠在幼年期、成年期逃避潛伏期均呈縮短趨勢，并且在第3、4、5天之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在幼年期和成年期兩組大鼠逃避潛伏期、原平臺象限滯留時間、原平臺象限路程、平均速度、經(jīng)過平臺次數(shù)等指標組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。幼年期Sev2.6組大鼠海馬中Tau蛋白mRNA表達量為1.44±0.43，較Con組Tau蛋白mRNA表達量(0.93±0.13)明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而在新生期、成年期兩組大鼠海馬中Tau蛋白mRNA表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論 新生期重復2.6%七氟烷吸入麻醉后可導致大鼠海馬Tau蛋白mRNA表達的一過性上調，但不引起認知功能的損害。

七氟烷；認知功能；海馬；Tau蛋白；mRNA

七氟烷因其誘導迅速、蘇醒快且平穩(wěn)等特點，是兒科手術中常用的吸入麻醉藥[1]。如今多數(shù)患兒因唇腭裂修補、喉乳頭狀瘤切除、骨折固定及內固定取出等需要間斷重復手術。Wilder等[2]在對全麻手術患兒的臨床回顧性研究中發(fā)現(xiàn)，小兒4歲前接受≥2次全身麻醉后認知功能障礙的發(fā)生風險明顯高于單次全麻。因此，反復使用七氟烷麻醉是否對患兒認知功能產(chǎn)生不良影響亟待研究。Le Freche等[3]研究發(fā)現(xiàn)，成年小鼠單次吸入不同濃度七氟烷，可發(fā)生濃度依賴性海馬區(qū)Tau蛋白可逆性磷酸化，得出七氟烷吸入濃度的改變會引起海馬區(qū)蛋白結構的變化，進而產(chǎn)生了認知功能的損傷。這一研究提示，七氟烷吸入次數(shù)的變化是否也會對海馬區(qū)蛋白產(chǎn)生相關的影響，從而損害認知。故本實驗研究新生期大鼠重復七氟烷麻醉后海馬Tau蛋白mRNA表達水平的改變，探討與認知功能之間的關系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 七氟烷(山東魯南貝特制藥有限公司)、RNAiso Plus(日本TaKaRa公司)、PrimeScriptTM RT reagent Kit(日本TaKaRa公司)、iQTMSYBR@ Green Supermix(美國Bio-Rad公司)及引物(日本TaKaRa公司)；Fabius麻醉機(德國Drager公司)、Vamos氣體監(jiān)護儀(德國Drager公司)、七氟烷揮發(fā)罐(美國雅培公司)、Morris水迷宮測試儀(成都泰盟科技有限公司)、CFX ConnectTM熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2 實驗動物及分組 SPF級7日齡健康SD大鼠36只，雌雄不拘，體重15～18 g(購于重慶第三軍醫(yī)大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(渝)2012-0005)。新生期內大鼠與母鼠同籠飼養(yǎng)，母乳喂養(yǎng)至出生后第28天與母鼠分籠飼養(yǎng)，按照國家嚙齒類動物干燥飼料飼養(yǎng)標準喂食，飼養(yǎng)環(huán)境安靜，室溫控制在20～24 ℃，相對濕度50%～60%，自然晝夜明暗循環(huán)。采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為兩個組：2.6%七氟烷組(Sev2.6組，n=18)和對照組(Con組，n=18)，每組大鼠又根據(jù)檢測不同的生長時期分為3個亞組：新生期組(0～21 d，n1=12)、幼年期組(22～60 d，n2=12)、成年期組(60 d～20個月，n3=12)。

1.3 麻醉處理 所有大鼠于出生后第7天(P7)、第14天(P14)和第21天(P21)進行重復七氟烷吸入麻醉處理及對照處理。自制有機玻璃吸入麻醉箱(75 cm×40 cm×15 cm)，與麻醉機回路相連，氣體監(jiān)測儀持續(xù)監(jiān)測保證進氣孔和出氣孔氣體濃度一致，Sev2.6組吸入濃度為2.6%七氟烷，Con組吸入空氧混合氣體(O21 L/min+Air 1 L/min)，待氣體平衡后放入大鼠持續(xù)吸入2 h，吸入時間從大鼠麻醉起效(大鼠夾尾反射消失)開始計時，Con組以氣體平衡放入大鼠即開始計時。吸入過程中控制箱溫在30～34 ℃，密切觀察大鼠呼吸情況及皮膚色澤，將出現(xiàn)紫紺及呼吸暫停的大鼠立即終止實驗并予以剔除。吸入結束后取出大鼠置于自然環(huán)境中蘇醒，待完全清醒后放回原飼養(yǎng)環(huán)境飼養(yǎng)。為確定2 h的麻醉對大鼠呼吸的影響程度，監(jiān)測并記錄隨機6只大鼠每間隔30 min的SpO2及呼吸頻率。

1.4 行為學檢測 Morris水迷宮實驗[4]是當前公認檢驗嚙齒類動物學習記憶能力的行為變化最有效的方法，通過行為學的變化反映認知功能中學習記憶能力的影響?；诒菊n題組前期大量的實驗結果表明，新生期大鼠無法耐受長時間水迷宮訓練，并且相關的文獻報道均從28 d以后開始進行[5-6]，故本實驗通過Morris水迷宮僅研究幼年期、成年期大鼠行為學變化。水迷宮設備由圓形水池、可移動平臺以及圖像采集記錄系統(tǒng)3部分組成。將盛有水的圓形鐵皮水池[直徑 120 cm ，高60 cm，水深 32 cm，水溫(25±1)℃]平均劃分為4個象限，依逆時針命名為一、二、三、四象限。放600 g奶粉入水使水池呈乳白色，并保持水迷宮外參照物不變。在定位航行實驗中，將與水池背景同色直徑為20 cm可移動平臺隱藏于第四象限中央水下2 cm，此時肉眼無法直視平臺。水池正上方通過一攝像機與監(jiān)視器和計算機連接，可自動跟蹤并記錄下大鼠的游泳軌跡，并計算出實驗指標的數(shù)據(jù)。①適應性訓練：將幼年期大鼠P31、成年期大鼠P91放入沒有平臺的池中游泳120 s，以適應環(huán)境和剔除不會游泳而漂浮的大鼠。②定位航行實驗：幼年期(P32～P36)和成年期(P92～P96)分別進行為期5 d的定位航行實驗。每天將大鼠面向池壁分別從4個象限盆壁中點處放入水中，從入水到找到隱藏平臺的時間記為逃避潛伏期，若大鼠120 s內未找到平臺則指引其爬上平臺并休息10 s，逃避潛伏期記為120 s，取當天4個象限逃避潛伏期平均值為實驗成績。③空間探索實驗：分別在幼年期大鼠P37、成年期大鼠P97進行。撤去平臺，大鼠從平臺象限的對側象限面向盆壁入水，游泳120 s，記錄原平臺象限滯留時間，經(jīng)過原平臺象限路程，平均速度以及經(jīng)過平臺次數(shù)等指標。

1.5 海馬Tau蛋白mRNA水平測定 于新生期大鼠第三次吸入麻醉結束的當天(P21)、幼年期和成年期空間探索實驗結束后當天(P36和P96)，1%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后，取腦組織于冰盤上分離出海馬組織，置于-80 ℃冰箱中保存。采用RT-PCR法檢測海馬Tau蛋白 mRNA水平，取海馬標本解凍后，用研磨杵充分勻漿至組織完全裂解，4 ℃ 12 000 rpm離心10 min，取上清液加入氯仿0.2 mL，劇烈震蕩后靜置10 min，4 ℃ 12 000 rpm離心15 min，再取上清液，加0.2 mL異丙醇，顛倒混勻后室溫沉淀10 min，于4 ℃ 12 000 rpm離心15 min后，棄上清液。加入75%乙醇1 mL，4 ℃ 7 500 rpm離心15 min后棄去上清液。將EP管倒置于濾紙上室溫下自然干燥，以去酶水50 μL 溶解。采用紫外分光光度計測定光密度值(A260/A280)，比值為1.8～2.0，滿足實驗要求。根據(jù)GeneBank中目的基因全序列，由TaKaRa生物工程公司合成Tau基因mRNA上游引物：5＇-CCTGAGCAAGGTGACCTCCAA-3＇、下游引物：5＇-GGGACATGGGTGATGTTATCCAA-3＇，擴增片段150 bp；β-actin 上游引物: 5＇-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3＇；β-actin 下游引物: 5＇-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3＇，擴增片段150 bp。定量PCR反應體系為10 μL，Tau蛋白mRNA和β-actin反應條件循環(huán)設置：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性35 s，60 ℃退火30 s，循環(huán)40 次。結果采用相對定量法分析處理。以PCR擴增過程中熒光信號強度達到閾值所需要的循環(huán)系數(shù)(Ct)為統(tǒng)計參數(shù)，基因的表達= 2-△△CT(△△CT=Ct平均值-Ct中間值)；相對表達量=目的基因的表達(Tau蛋白mRNA)/內參基因的表達(β-action)×100%。

1.6 觀察指標 Sev2.6組和Con組所有觀察指標均在同一實驗條件下采集、處理。

2 結果

2.1 一般情況 吸入七氟烷麻醉期間各組大鼠呼吸平穩(wěn)，皮膚色澤紅潤，麻醉后蘇醒良好。適應性訓練中未發(fā)現(xiàn)不會游泳的大鼠，各組實驗大鼠均順利完成Morris水迷宮的行為學測試，無意外死亡。隨機抽取的6只大鼠吸入麻醉過程中各時間點SpO2、呼吸頻率均在正常值范圍，各時間點SpO2與麻醉前比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；麻醉后30 min、1、1.5 h呼吸頻率分別較麻醉前明顯減慢，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，大鼠蘇醒后呼吸頻率與麻醉前比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表1)。

觀察指標麻醉前麻醉后30min麻醉后1h麻醉后1.5h蘇醒后SpO2(%)呼吸頻率(次/min)97.2±0.8107.5±8.896.5±1.089.2±8.0a96.5±1.683.9±5.4a96.7±1.271.8±4.1a96.8±1.5101.8±8.8

與麻醉前比較，aP<0.05。

2.2 行為學檢測結果

2.2.1 幼年期兩組大鼠分別組內各天間比較，逃避潛伏期差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但隨著測試天數(shù)的增加，與定位航行第1天相比，逃避潛伏期呈縮短趨勢，在第3、4、5天之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2.2 成年期大鼠Sev2.6組和Con組分別組內比較，隨測試天數(shù)的增加，與定位航行第1天相比，逃避潛伏期逐漸縮短，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，并且兩組大鼠在第3、4、5天之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2.3 幼年期和成年期大鼠Sev2.6組與Con組比較，逃避潛伏期、原平臺象限滯留時間、原平臺象限路程、平均速度、經(jīng)過平臺次數(shù)各指標組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表2～3)。

組別幼年期(n2=12)第1天第2天第3天第4天第5天成年期(n3=12)第1天第2天第3天第4天第5天Sev2.647.91±8.0425.26±12.5332.32±33.5824.29±14.1324.98±10.9942.01±14.1226.87±16.93a19.80±13.76a15.06±8.45a8.66±4.82abCon59.09±36.6233.84±15.2123.79±9.49 20.00±10.1014.03±7.55 41.97±25.6622.88±10.04a15.88±5.20a9.26±3.98a11.33±6.05a

組內比較，與定位航行第1天比較，aP<0.05；與定位航行第3天比較，bP<0.05。

組別幼年期(n2=12)原平臺象限滯留時間(s)原平臺象限路程(mm)平均速度(mm/s)經(jīng)過平臺次數(shù)成年期(n3=12)原平臺象限滯留時間(s)原平臺象限路程(mm)平均速度(mm/s)經(jīng)過平臺次數(shù)Sev2.628.16±5.357726.04±1192.47276.20±15.354.67±2.7325.02±6.176459.19±1716.87258.84±34.332.83±1.33Con25.65±4.167292.18±840.31 287.66±35.303.17±2.4828.05±4.717716.37±1626.62281.48±75.353.33±1.21

2.3 海馬Tau蛋白mRNA的表達量分析 幼年期大鼠Sev2.6組與Con組比較，海馬中Tau蛋白mRNA表達量增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；新生期大鼠Sev2.6組與Con組比較，Tau蛋白mRNA表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；成年期大鼠Sev2.6組與Con組比較，Tau蛋白mRNA表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表4)。

組別新生期(n1=12)幼年期(n2=12)成年期(n3=12)Sev2.60.82±0.141.44±0.43a0.69±0.10Con0.81±0.210.93±0.130.64±0.14

與Con組相比，aP<0.05。

3 討論

Morris水迷宮是目前公認的通過觀察大鼠行為學改變檢測大鼠學習記憶能力改變的經(jīng)典實驗方法，在認知功能領域研究中被廣泛應用。大鼠的學習記憶能力包括陳述性記憶能力和空間聯(lián)想與回憶探究能力。定位航行實驗結果既能體現(xiàn)大鼠的陳述性記憶能力又能使大鼠通過學習過程形成空間參考記憶。而空間探索實驗即是大鼠對已形成的空間參考記憶的提取，屬于空間聯(lián)想與回憶探究能力范疇[7-8]。本研究中的實驗結果表明，隨測試天數(shù)的增加，幼年期、成年期兩組大鼠逃避潛伏期均呈縮短趨勢，并且在第3、4、5天之間比較差異無統(tǒng)計學意義，說明各組大鼠通過學習能力已形成了穩(wěn)定的空間參考記憶。幼年期和成年期大鼠逃避潛伏期及空間探索實驗各指標組間比較差異無統(tǒng)計學意義，證明大鼠哺乳期內重復七氟烷麻醉未對幼年期及成年期的學習記憶能力產(chǎn)生損害。

有研究報道，大鼠吸入麻醉后引起的海馬結構改變、神經(jīng)變性以及神經(jīng)電生理功能受損等，會使大鼠產(chǎn)生持續(xù)性的認知功能障礙[9]。因而，海馬區(qū)的相關蛋白和基因表達水平的改變是目前研究認知功能損害的熱點方向。Tau蛋白是海馬神經(jīng)細胞主要的微管相關蛋白，微管相關蛋白Tau基因經(jīng)轉錄、翻譯后形成Tau蛋白，Tau基因突變可導致Tau蛋白表達水平異常和結構紊亂，從而可導致一系列神經(jīng)退行性疾病病理改變[10]。本實驗結果發(fā)現(xiàn)新生期間斷重復吸入七氟烷麻醉后會引起幼年期大鼠海馬中Tau蛋白mRNA表達上調，但當大鼠生長到成年期后，Tau蛋白mRNA表達量并未出現(xiàn)相同的上調趨勢。說明在大鼠動態(tài)的生長發(fā)育過程中，重復的七氟烷吸入麻醉后對Tau蛋白mRNA表達水平的影響只是一過性的發(fā)生在幼年期，并未延續(xù)至成年期，其原因在于大鼠的幼年期正是處于神經(jīng)發(fā)育的生長爆發(fā)期，該時期除對內外環(huán)境的變化異常敏感外，同時還具有較強的修復作用，隨著這種自我修復的作用存在，Tau蛋白mRNA表達水平的變化僅在幼年期呈現(xiàn)為一過性的上調。

綜上，重復七氟烷麻醉可引起大鼠海馬中Tau蛋白mRNA的表達量一過性上調，但不能引起大鼠行為學的改變，即不損害大鼠的認知功能，考慮其原因可能為：①新生期重復七氟烷麻醉后對認知功能的影響可能不是Tau蛋白基因表達量改變獨立作用的結果，而是多種基因標記物及相應表達產(chǎn)物蛋白之間相互關聯(lián)的結果[11]。②海馬Tau mRNA的表達量與影響藥物之間可能存在劑量依賴關系，本實驗結果可推斷該濃度下的七氟烷麻醉后引起的Tau蛋白mRNA表達的上調程度可能不足以導致大鼠認知功能障礙，同時提示了若提高七氟烷吸入的濃度后對海馬Tau基因表達調控作用的影響程度可能不同，我們將進一步探討并對比不同劑量的研究。

因此，新生期大鼠重復吸入2.6%的七氟烷后僅引起幼年期海馬Tau蛋白mRNA表達水平的上調，但未導致大鼠任何時期的行為學改變，說明新生期重復2.6%的七氟烷吸入麻醉后僅可導致Tau蛋白mRNA表達的一過性上調，但這種上調不引起認知功能的損害。

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[收稿2017-02-16;修回2017-03-05]

(編輯：王靜)

Effects of sevoflurane anesthesia on Tau mRNA expression in rat hippocampus and the cognition

XuLingyi1,XieDi2,ZhuYuhang1,ZhuZhaoqiong1

(1.Department of Anesthesiology,Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 2.Guizhou Key Laboratory of Basic Research for Anesthesia and Organ Protection,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To study the effects of repeated sevoflurane anesthesia on Tau mRNA expression in hippocampus and investigate the relationship between the Tau mRNA expression and the ability of learning and memory in neonatal rats.Methods Thirty-six healthy Sprague-Dawley rats were randomly divided into two groups,control group (n=18) and sevoflurane group (n=18).The sevoflurane group was given 2.6% sevoflurane inhalation anesthesia for 2 h at the postnatal 7th days,14th days and 21st days (P7,P14 and P21).Control group was given mixed carrier gas (the proportion of 1∶1 oxygen and air) for 2 h at the same days.The behavior was tested through Morris water maze test in two groups at juvenile and adult period.After the behavior test,hippocampal specimens were obtained for determination of the expression of Tau mRNA by RT-qPCR.Results In juvenile and adult periods,the escape latency in two groups became shorter over time,and there was no statistical difference between two groups at the 3,4 and 5 d (P>0.05).No significant change was found between two groups in the escape latency,the time of staying at the original platform quadrant,the distance of swimming in the original platform,the average speed of swimming and the frequency of crossing the original platform during juvenile and adult period (P>0.05).In the juvenile period,the expression of Tau mRNA in the hippocampus of sevoflurane group was higher than that in the control group (P<0.05).No difference of Tau mRNA expression between neonatal and adult periods was shown (P>0.05).Conclusion The repeated 2.6% sevoflurane inhalation in the neonatal period could increase the expression of Tau mRNA in the hippocampus of juvenile rats with no behavior changes in juvenile and adult periods.

Sevoflurane; cognitive ability; hippocampus; protein Tau; mRNA

國家自然科學基金資助項目(NO：81660193)；貴州省科技廳技術基金資助項目(NO：黔科合J字LKZ[2012]04)。

朱昭瓊，女，博士，教授，碩士生導師，研究方向：吸入麻醉、臨床麻醉，E-mail:xly0101mz@163.com。

R614.2

A

1000-2715(2017)02-0129-05