陳 莉，侯成賢，楊燕飛

(遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

綠原酸溶液、微乳和凝膠的透皮特性與皮膚刺激性研究

陳 莉，侯成賢，楊燕飛

(遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

目的 對綠原酸溶液、微乳和凝膠的體外透皮特性和皮膚刺激性進(jìn)行對比研究，為綠原酸外用制劑的開發(fā)提供實驗依據(jù)。方法 以雄性大鼠背部皮膚為滲透屏障，采用Franz擴散池比較不同制劑中綠原酸的透皮特性，并采用大鼠自身對照考察綠原酸不同制劑對大鼠皮膚的刺激性。結(jié)果 綠原酸3種制劑的累積滲透量Qn與時間t有較好線性關(guān)系。微乳及凝膠組24 h的累積滲透量Q24h分別為溶液組的7.71倍和7.49倍，其透皮速率常數(shù)J分別為7.98倍和7.50倍，且累積透過百分率分別為2.63倍和2.16倍。綠原酸凝膠組的體外透皮釋放過程符合Higuchi模型。綠原酸制劑對大鼠皮膚均無刺激性。結(jié)論 綠原酸微乳及凝膠能夠促進(jìn)綠原酸經(jīng)皮滲透，有望開發(fā)成為新的綠原酸外用制劑。

綠原酸；微乳；凝膠；體外經(jīng)皮滲透；皮膚刺激性

綠原酸是植物體在有氧呼吸過程中由咖啡酸與奎尼酸生成的縮酚酸，具有較廣泛的抗菌、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、降壓、補腎、利尿、利膽等作用[1]，口服生物利用度低[2-3]。因其分子量小、油水分配系數(shù)適宜[4]、毒性低，可將其制成經(jīng)皮給藥制劑，避免肝臟首過效應(yīng)及被腸道菌群破壞[5]，延長給藥時間，提高局部或全身治療的療效，便于使用。

微乳是經(jīng)皮給藥制劑有前景的載體，對藥物具有增溶、促滲及增加皮膚滯留量的作用[6]，可通過改變角質(zhì)層的脂質(zhì)、促進(jìn)角蛋白水化及改變角蛋白結(jié)構(gòu)從而降低其屏障功能[7]等促滲機制，提高給藥的有效性與安全性。此外，水凝膠劑也是近年來發(fā)展較快的一種新型經(jīng)皮給藥劑型，具有分散性好、黏附力強、穩(wěn)定性好、藥效持久、應(yīng)用方便、透皮吸收快、可避開首過效應(yīng)和給藥部位濃度高等優(yōu)點，與外用溶液劑相比，還可延緩藥物釋放，延長藥物在皮膚上的保留時間[8]。有關(guān)綠原酸溶液、微乳和凝膠的透皮給藥目前鮮見報道，因此本文重點考察三者的透皮性質(zhì)以及對大鼠皮膚的刺激性，為研究綠原酸新制劑及新的給藥途徑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試藥 綠原酸對照品，中國藥品生物制品檢定所，批號：110753-200413；綠原酸原料藥(金銀花提取物)，96%，南京朗澤醫(yī)藥科技有限公司；油酸乙酯，阿拉丁試劑公司；吐溫-80，重慶川江化學(xué)試劑廠；丙三醇，成都市科龍化工試劑廠；卡波姆940，鄭州優(yōu)然食品化工有限公司；甲醇，色譜純，上海躍勝貿(mào)易有限公司；乙腈，色譜純，上海躍勝貿(mào)易有限公司；磷酸，分析純，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器 Agilent 1 260高效液相色譜儀，美國安捷倫有限公司；TGL-16 C高速臺式離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；XW-80 A渦旋混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；ME 204 E萬分之一分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；TK-24 BL透皮擴散試驗儀(接收池體積為8 mL，有效透皮面積為3.14 cm2)，上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司；DN-36 A氮吹儀，無錫沃信儀器有限公司。

1.3 實驗動物 健康雄性SD大鼠，SPF級，體重(200±20) g，購自重慶第三軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗中心，許可證號：SCXK(渝)2012-0005，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。動物房溫度為(23±2) ℃，相對濕度為50%±10%，每日照明12 h，大鼠給藥后采用單籠飼養(yǎng)，自由飲食和飲水。1.4 色譜條件 DIKMA Plastisill C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm )，并配以DIKMA C18(10 mm×4.6 mm)保護柱；流動相：乙腈-0.4%磷酸(15∶85，v/v)；檢測波長：327 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

1.5 方法學(xué)考察

1.5.1 方法專屬性 取空白接收液、空白接收液+對照品及透皮試驗樣品，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液20 μL進(jìn)樣分析。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取綠原酸對照品11.67 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，用50%甲醇溶液溶解并定容至刻度，搖勻，得濃度為233.33 μg/mL的對照品儲備液。再用50%甲醇溶液依次稀釋成濃度為23.33、11.67、5.83、2.92、1.46、0.73、0.36、0.18、0.09 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)樣。以綠原酸的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，標(biāo)準(zhǔn)系列濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和線性。

1.5.3 精密度試驗 分別制備綠原酸低(0.36 μg/mL)、中(2.92 μg/mL)、高(11.67 μg/mL)3個濃度的對照樣品，過濾后重復(fù)進(jìn)樣6次并連續(xù)測3 d。將峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算各樣品的濃度，求得日內(nèi)和日間精密度(RSD%)。

1.5.4 加樣回收率試驗 按1.5.3項下方法制備綠原酸低、中、高3個濃度的對照樣品各3份，分別加入等量另一已知濃度的供試品，混勻過濾后進(jìn)樣，測得相應(yīng)峰面積，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線求得混合樣品濃度，計算加樣回收率。

1.5.5 穩(wěn)定性試驗 分別于0、1、3、6、9、12、18、24、30 h測定同一透皮試驗樣品的峰面積，考察待測樣品在室溫放置30 h的穩(wěn)定性(RSD%)。

1.6 透皮制劑的制備

1.6.1 綠原酸溶液 精密稱取綠原酸原料藥0.054 5 g加10 mL純水?dāng)嚢枞芙猓吹镁G原酸濃度為5.420 5 mg/g(w/w)的無色澄明溶液。

1.6.2 綠原酸微乳 按照文獻(xiàn)比例(1∶3∶6，w/w/w)[9]，精密稱取油酸乙酯0.10 g、吐溫-80 0.30 g和甘油0.60 g，混勻后加入綠原酸原料藥0.100 5 g于37 ℃水浴中攪拌溶解完全，在攪拌下緩慢加入19 mL純水使之完全乳化，即得綠原酸濃度為4.999 9 mg/g(w/w)的無色綠原酸微乳。1.6.3 綠原酸凝膠劑 精密稱取卡波姆940 0.16 g，加甘油2.00 g潤濕后再加入8 mL純水混勻待其完全溶脹。另精密稱取綠原酸原料藥0.109 1 g加10 mL純水?dāng)嚢枞芙夂笈c完全溶脹的卡波姆940混合均勻，加適量三乙醇胺調(diào)pH至5.5[4]，即得綠原酸濃度為5.382 6 mg/g(w/w)的無色透明黏度適宜的綠原酸凝膠劑。

1.7 綠原酸溶液、微乳和凝膠的體外透皮考察

1.7.1 大鼠離體皮膚的制備 取健康雄性大鼠脫毛膏脫去背部毛發(fā)，飼養(yǎng)24 h后頸部脫臼處死，用手術(shù)剪小心剝離背部皮膚，鋪于玻璃板上仔細(xì)剔除皮下脂肪層和結(jié)締組織，用生理鹽水反復(fù)沖洗干凈，并于-20 ℃中保存?zhèn)溆?。實驗前自然解凍，再用生理鹽水浸泡15 min，取完整皮膚進(jìn)行實驗。

1.7.2 透皮擴散實驗 采用Franz擴散池法。將大鼠背部皮膚固定于透皮擴散儀的供給池和接收池之間，角質(zhì)層朝向供給池。在供給池中分別加入綠原酸溶液、微乳及凝膠各1.00 g，接收池中加入生理鹽水8 mL作接收液。磁攪拌轉(zhuǎn)速為300 rpm，溫度為32 ℃，分別于0.5、1、1.5、3、5、7.5、10、12和24 h從接收池取出接收液1 mL，并立即補充等體積同溫度的接收液。樣品經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后用HPLC法測定綠原酸的含量。按下式計算各個時間點的單位面積累積透過量(Qn，μg/cm2)[10]。

Qn=(CnVn+∑CiVi)/A

式中，Cn為第n個取樣點的濃度(μg/mL)；Ci為第i個取樣點的濃度(μg/mL)；Vn為接收池體積(8 mL)；Vi為第i個取樣點取樣體積(1 mL)；A為有效透皮面積(3.14 cm2)。以Qn對時間t作圖，并對曲線中的直線部分線性回歸，求出直線斜率，即穩(wěn)態(tài)滲透速率J[μg/(cm2·h)]。

1.8 大鼠皮膚刺激性試驗 健康雄性SD大鼠36只，按體重隨機均分為兩組：完整皮膚組和破損皮膚組。每組再按受試物不同隨機分為3組：溶液組、微乳組和凝膠組。在給藥前去除大鼠背脊兩側(cè)毛發(fā)，面積約5 cm×10 cm，破損皮膚組除毛后需用砂紙磨擦，去毛部位以滲血為度。以大鼠自身左側(cè)皮膚為對照，于右側(cè)去毛區(qū)皮膚均勻涂抹制劑1.00 g。每天給藥1次，連續(xù)7 d，觀察受試期間大鼠行為活動、精神狀況及飲食情況。于末次給藥4 h后用溫水洗去殘留受試物，觀察第1、24、48、72小時大鼠涂抹部位有無出現(xiàn)紅斑、水腫等情況，并按表1中的評價方法進(jìn)行刺激性評分，計算出平均值后根據(jù)以下評價標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評價。無刺激性：0～0.49；輕度刺激性：0.50～2.99；中度刺激性：3.00～5.99；強刺激性：6.00～8.00[11]。

表1 皮膚刺激性反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)

刺激反應(yīng)的表征(紅斑)分值刺激反應(yīng)的表征(水腫)分值無紅斑0無水腫0輕微紅斑(勉強可見)1輕微水腫(勉強可見)1中度紅斑2中度水腫(涂藥區(qū)域隆起輪廓明顯)2嚴(yán)重紅斑3重度水腫(涂藥區(qū)域隆起約1mm,輪廓清楚)3紫紅色紅斑并有焦痂形成4嚴(yán)重水腫(涂藥區(qū)域隆起約1mm,并范圍擴大)4

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察結(jié)果 結(jié)果見圖1和表2。綠原酸的保留時間為8.5 min左右，生理鹽水及透皮試驗中的其他雜質(zhì)對綠原酸的測定無干擾。綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=28.72X+0.615，R2=0.999 9，表明綠原酸為0.09～23.33 μg/mL時，峰面積與濃度線性關(guān)系良好。精密度、回收率結(jié)果符合綠原酸含量測定要求。透皮試驗樣品在室溫放置30 h的RSD%為5.47，表明樣品在30 h內(nèi)含量穩(wěn)定。綜上所述，本文所建立的色譜方法適于透皮試驗樣品中綠原酸的含量測定。

A：空白接收液；B：空白接收液+綠原酸對照品；C：綠原酸供試品；1：綠原酸。圖1 綠原酸HPLC圖

表2 精密度和方法回收率試驗結(jié)果

濃度(μg/mL)精密度(RSD%)日內(nèi)(n=6)日間(n=3)方法回收率(%)x±sRSD0.365.436.8790.35±6.066.712.933.205.0393.33±5.065.4211.674.435.2492.03±3.754.07

2.2 透皮試驗結(jié)果 將綠原酸溶液、微乳及凝膠各時間點的累積滲透量Qn分別對時間t進(jìn)行線性回歸，得到滲透動力學(xué)方程，所得斜率為透皮速率常數(shù)J[μg/(cm2·h)](見表3)。綠原酸溶液、微乳及凝膠的累積滲透量Qn與滲透的時間t有較好的線性關(guān)系，采用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析，與綠原酸溶液組比較，微乳及凝膠組的透皮滲透速率J與累積滲透量Q24h有明顯差異(P<0.05)，其中透皮速率常數(shù)J分別是溶液組的7.98倍和7.50倍，而累積滲透量Q24 h分別是溶液組的7.71倍和7.49倍。

對綠原酸凝膠劑的透皮數(shù)據(jù)分別采用零級模型、一級模型和Higuchi模型擬合[12]。從擬合結(jié)果(見表4)可看出，Huguchi方程的R2最大，其次是零級方程，最小的是一級方程，因此，綠原酸凝膠的體外透皮釋放過程更符合Higuchi模型，故推測綠原酸在凝膠中具有緩釋特征。綠原酸3種制劑的累積滲透曲線見圖2。5 h以前，三者累積透過率均較低(P>0.05)，但5 h之后綠原酸微乳與凝膠的透過率明顯高于綠原酸溶液(P<0.05)。3種制劑中綠原酸的24 h透過率分別為1.27%、3.34%和2.74%，其中微乳組和凝膠組的透過率分別是溶液組的2.63倍和2.16倍。

表3 綠原酸不同制劑的滲透動力學(xué)方程(n=6)

組別滲透動力學(xué)方程(Q-t)R2J[μg/(cm2·h)]Q24h(μg/cm2)綠原酸溶液Q=6.016t+9.96080.91146.016134.185綠原酸微乳Q=48.006t-113.150.999548.006*1034.722*綠原酸凝膠Q=45.139t-59.0440.991745.139*1005.510*

*：vs綠原酸溶液，P<0.05。

表4 綠原酸凝膠劑體外累積釋放模型擬合

名稱方程R2零級方程(Q-t)Q=44.544t-51.1120.9917一級方程(lnQ-t)lnQ=0.0707t+5.26170.9439Higuchi方程(Q-t1/2)Q=331.56t1/2-625.070.9995

圖2 綠原酸在不同制劑中的累積滲透曲線

2.3 大鼠皮膚刺激性試驗 根據(jù)表1中的評價方法考察大鼠涂抹部位的紅斑和水腫情況，結(jié)果顯示大鼠給予綠原酸3種制劑后，行為活動、精神狀況、飲食情況均正常，去除受試物后無論是完整皮膚還是破損皮膚均未見紅斑、水腫等皮膚刺激性表征(各時間點評分結(jié)果為0)，表明綠原酸3種制劑對皮膚均無刺激性。

3 討論

本文透皮試驗采用了大鼠背部皮膚，較常用的小鼠或大鼠的腹部皮膚更厚，然而透皮試驗結(jié)果顯示，3種制劑的綠原酸都能透過該皮膚，并隨著時間的延長呈線性增加。三者的透皮能力依次為：綠原酸微乳>綠原酸凝膠>綠原酸溶液劑。

綠原酸溶液劑的經(jīng)皮透過性可能與其理化性質(zhì)[13]有密切關(guān)系：①綠原酸相對分子質(zhì)量為354.31(小于500)，較易穿透皮膚屏障。②表皮的pH值為4.2～5.6，在此生理條件下綠原酸能夠以較穩(wěn)定的分子形式存在，較離子型有更好的透過性。③研究表明，lgP<1或者lgP>5的化合物吸收都較差，而綠原酸25 ℃的表觀油水分配系數(shù)lgP為1.42[4](大于1且小于5)，也為綠原酸的經(jīng)皮滲透提供了有利條件。與溶液劑相比，綠原酸微乳的滲透速率和滲透量明顯增加，表明微乳有利于藥物經(jīng)皮吸收。此結(jié)果可能與微乳的特性有關(guān)：①綠原酸微乳粒徑小(約20 nm[9])，有利于降低表面張力，濕潤皮膚，保證藥物的經(jīng)皮滲透[14]。②改善藥物在皮膚角質(zhì)層的分配系數(shù)，滲透系數(shù)增大，相對于綠原酸水溶液更容易通過角質(zhì)層并滯留在皮膚內(nèi)形成貯庫[15]。③微乳處方中的表面活性劑(吐溫-80)可以改變生物膜的通透性，增加細(xì)胞間隙，促進(jìn)藥物滲透。④提高藥物穩(wěn)定性，增加藥物的溶解度，增大藥物在皮膚兩側(cè)的濃度梯度，起到促滲劑的作用[16]。綠原酸微乳具有很強的透皮能力，有望進(jìn)一步開發(fā)成為新的綠原酸外用制劑，為綠原酸新劑型及新制劑進(jìn)一步開發(fā)研究提供實驗依據(jù)。

此外，綠原酸凝膠劑以卡波姆940為凝膠基質(zhì)并用三乙醇胺調(diào)節(jié)pH值至5.5，在此條件下凝膠黏度適宜，綠原酸性質(zhì)穩(wěn)定[4]，能夠以分子形式均勻分散于基質(zhì)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，為綠原酸的經(jīng)皮滲透提供了有利條件。與溶液劑比較，凝膠劑還具有較強的皮膚黏附和潤濕能力，從而使得綠原酸凝膠的透皮能力優(yōu)于溶液劑。然而凝膠劑的促滲作用略低于微乳，其具體的促滲機制還有待進(jìn)一步研究?？紤]到微乳經(jīng)皮給藥存在黏附性差、滯留時間較短等問題，擬將其進(jìn)一步制備成微乳凝膠，并考察微乳與凝膠聯(lián)合應(yīng)用對藥物透皮吸收是否存在協(xié)同促進(jìn)作用。

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[收稿2016-12-26;修回2017-02-07]

(編輯：王靜)

Study on in vitro transdermal permeability and skin irritation of chlorogenic acid in solution, microemulsion and carbomer hydrogel

ChenLi,HouChengxian,YangYanfei

(Department of Pharmaceutics, School of Pharmacy, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

Objective To investigate the differences in transdermal permeability and skin irritation of chlorogenic acid in three different formulations based on solution, microemulsion and carbomer hydrogel. Methods Franz diffusion cells were used for the transdermal permeation study using male rats dorsal skin. Irritation effects on rats intact or damaged skin were studied by self control. Results The accumulative amount of the permeated chlorogenic acid (Qn) increased linearly with time (t). Within 24 hours, theQ24hof chlorogenic acid in microemulsion and gel groups were 7.71 times and 7.49 times than that in solution group, respectively. The permeation rate (J) was 7.98 times and 7.50 times, meanwhile the accumulative permeation percent ratio was 2.63 times and 2.16 times. Theinvitrotransdermal delivery ability of chlorogenic acid in gel group conformed to Higuchi equation. The skin irritation test indicated that chlorogenic acid formulations did not cause irritation on the intact or damaged skin．Conclusion Chlorogenic acid formulations have no stimulation to rat skin. Compared with the solution group, microemulsion and gel groups can promote transdermal permeability, suggesting that microemulsion and gel may be promising new transdermal formulations of chlorogenic acid．

chlorogenic acid; microemulsion; gel; transdermal permeation; skin irritation

貴州省聯(lián)合基金資助項目(NO：黔科合J字LKZ[2013]26)。

R943

A

1000-2715(2017)02-0119-05