張啟全 侯遠沛 劉成永

國產(chǎn)試劑檢測結(jié)核分枝桿菌對異煙肼、利福平耐藥基因臨床價值的探討

張啟全 侯遠沛 劉成永

目的 比較進口試劑和國產(chǎn)試劑在檢測結(jié)核分枝桿菌對利福平、異煙肼耐藥基因差異 ，探討國產(chǎn)試劑的臨床使用價值 方法 152株經(jīng)羅氏培養(yǎng)陽性的菌株，分別用德國Hain life science GmbH生產(chǎn)的Geno Type?MTBDRplus、亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司生產(chǎn)的基因探針試劑檢測利福平、異煙肼耐藥基因，并與傳統(tǒng)的藥敏結(jié)果作比較。結(jié)果 152例菌株中有148株納入比較，其中 進口試劑、國產(chǎn)試劑和羅氏培養(yǎng)法對利福平、異煙肼耐藥的檢出率分別為47.30%(70/148)，43.24%(64/148)；50%(74/148)，41.89(62/148)； 48.65%(72/148)，47.30%(70/148)，國產(chǎn)試劑與進口試劑、羅氏培養(yǎng)法相比，對利福平、異煙肼耐藥檢出率均無統(tǒng)計學差異(P>0.05). 以羅氏培養(yǎng)的藥敏結(jié)果為金標準，國產(chǎn)試劑和進口試劑對利福平、異煙肼耐藥的檢出敏感性和特異性均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。結(jié)論 國產(chǎn)試劑檢測異煙肼和利福平耐藥的敏感性與特異性與進口試劑相接近，且操作簡便，價格便宜，適合基層醫(yī)院對結(jié)核分枝桿菌耐藥性的快速檢測。

分枝桿菌；結(jié)核；異煙肼；利福平；耐藥

根據(jù)近年來國家以及地方對結(jié)核分枝桿菌的耐藥調(diào)查，均提示結(jié)核分枝桿菌的耐藥情況并未得到有效的控制[1-3]，與2000年第四次全國結(jié)核病流行病學抽樣調(diào)查相比, 結(jié)核分枝桿菌初、復治耐藥率都有所增加[4]，尤其是西部欠發(fā)達地區(qū)，增加更為明顯[5]。耐藥結(jié)核分枝桿菌的發(fā)現(xiàn)主要依賴藥敏試驗,傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)法及其藥敏試驗是確診耐藥結(jié)核病的“金標準”,但該方法耗時2-3月，難以滿足臨床對耐藥結(jié)核病快速診斷的需要，隨著結(jié)核分枝桿菌對單個抗結(jié)核藥物耐藥分子機制的闡明[6]，檢測利福平、異煙肼耐藥基因作為一種快速藥敏試驗已經(jīng)逐漸應用于臨床。本院既往使用的是德國Hain life science GmbH生產(chǎn)的GenoType?MTBDRplus試劑，之后又引進深圳亞能生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的基因探針試劑，本文應用這兩種試劑同時檢測利福平、異煙肼的耐藥基因，并與傳統(tǒng)的羅氏藥敏結(jié)果作比較，探討國產(chǎn)基因探針檢測試劑的臨床應用價值。

資料與方法

一、病例選擇

152株結(jié)核分枝桿菌的菌株均來自我院2014,1-2015.6月病房和門診痰菌培養(yǎng)陽性患者,男122例,女30例,年齡8-87，平均年齡47.54±20.29。152例菌株中用進口試劑檢測到4株為非結(jié)核分枝桿菌，另兩種試劑檢測為結(jié)核分枝桿菌，結(jié)果不符，去除這4例菌株，共有148株菌株進行比較。

二、試劑和方法

結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑:①國產(chǎn)試劑由亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司提供，采用PCR-反向點雜交酶顯色法②進口試劑為GenoType MTBDRplus，由德國Hain life science GmbH提供，采用PCR-反向線雜交酶顯色法③傳統(tǒng)的藥敏試劑由珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供，實驗方法按照《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》中的比例法進行[7]，所用藥物濃度:異煙肼0.2μg/mL，利福平為40μg/mL。刮取羅氏培養(yǎng)基上生長的分枝桿菌于無菌管中，加入無菌生理鹽水，研磨成混懸液，先接種于羅氏藥敏培養(yǎng)基表面，剩余菌液85℃ 30分鐘滅活后，超聲破碎，制成原始菌液，供耐藥基因檢測使用。所有檢測均嚴格按照試劑盒配備的說明書和SOP文件操作。

三、儀器選擇

超聲儀為Elma GmbH&Co KG提供，型號為DE-78224,PCR擴增儀為天隆生物科技有限公司提供，型號為TI988； GenoType MTBDRplus使用的雜交儀為德國Hain life science GmbH提供，型號為TwinCubator，亞能試劑使用的恒溫雜交儀為亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司提供，型號為YN-H16

四、統(tǒng)計學方法

采用 PEMS 3.1醫(yī)學統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，率的比較采用χ2檢驗，兩組均數(shù)的比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。以羅氏培養(yǎng)的藥敏結(jié)果為金標準，判斷兩種基因探針檢測試劑的敏感性和特異性。

結(jié) 果

一、148株結(jié)核分枝桿菌采用國產(chǎn)試劑對利福平、異煙肼耐藥基因的檢出率分別為50%(74/148)，41.89(62/148)；進口試劑對利福平、異煙肼耐藥基因的檢出率為47.30% (70/148)，43.24%(64/148)；兩種試劑相比，耐藥基因的陽性檢出率無統(tǒng)計學意義(χ2=0.22,0.06；P=0.64,0.81)，傳統(tǒng)的羅氏藥敏結(jié)果提示利福平、異煙肼耐藥率分別為48.64%(72/148)，47.30(70/148)，與國產(chǎn)試劑相比，耐藥檢出率無統(tǒng)計學差異(χ2=0.05,0.88；P=0.82,0.35)，148株結(jié)核分枝桿菌采用國產(chǎn)試劑、進口試劑以及傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)法對利福平和異煙肼耐藥檢出率(見表1)。

表1 148株結(jié)核分枝桿菌采用國產(chǎn)試劑、進口試劑以及傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)法對利福平和異煙肼耐藥檢出率(%)

※:①與②、③相比

二、72株傳統(tǒng)的羅氏藥敏結(jié)果為利福平耐藥的菌株中，國產(chǎn)試劑檢出72株耐藥，進口試劑檢出70株耐藥，與傳統(tǒng)的羅氏藥敏結(jié)果相比，國產(chǎn)試劑對利福平耐藥檢出率為100%(72/72)，進口試劑對利福平耐藥檢出率為97.22%(70/72)，二者相比無統(tǒng)計學差異(χ2=2.03，P=0.15)；

70株羅氏藥敏結(jié)果，異煙肼耐藥菌株中，國產(chǎn)試劑與進口試劑均檢出62株耐藥，與傳統(tǒng)的羅氏藥敏結(jié)果相比，二者耐藥檢出率相同，均為88.57%，72株利福平耐藥菌株與70株異煙肼耐藥菌株用國產(chǎn)試劑和進口試劑耐藥檢出率的比較(見表2)。

表2 比較國產(chǎn)試劑和進口試劑對利福平和異煙肼的耐藥檢出率(%)

三、以傳統(tǒng)的羅氏藥敏結(jié)果為金標準，測得國產(chǎn)試劑和進口試劑對利福平耐藥的敏感性分別為100%(72/72)，97.22%(70/72)；特異性分別為97.37%(74/76)，100%(76/76), 二者相比，敏感性和特異性均無統(tǒng)計學差異(χ2=2.03,2.03；P=0.15,0.15)；國產(chǎn)試劑和進口試劑對異煙肼耐藥的檢測敏感性相同，均為88.57%(62/72)；特異性分別為100%(78/78)，97.44%(76/78),特異性相比無統(tǒng)計學差異(χ2=2.03；P=0.15)。國產(chǎn)試劑和進口試劑對利福平、異煙肼耐藥的檢測敏感性和特異性(見表3)。

表3 國產(chǎn)試劑和進口試劑對利福平、異煙肼耐藥的檢測敏感性和特異性

討 論

一、據(jù)WHO發(fā)布的《2015年全球結(jié)核病監(jiān)測報告》估計，2014年全球約有960萬例新發(fā)結(jié)核病例，48萬耐多藥結(jié)核病患者，超過一半的耐多藥結(jié)核病患者發(fā)生在中國、印度和印度尼西亞[8]。多地的耐藥監(jiān)測結(jié)果顯示我國耐藥結(jié)核病的發(fā)生率高于全球，尤其對于合并糖尿病和艾滋病等免疫功能低下的患者，其結(jié)核病的感染率和耐藥率均高于機體免疫功能正常的患者[9-10]，給結(jié)核病的防治造成很大的困難。目前化學藥物治療仍是結(jié)核病的首選，由于耐藥患者較多，因此越早知道藥敏結(jié)果越有利于患者的治療和康復，減少耐藥結(jié)核分枝桿菌在人群中的傳播。研究表明對利福平、異煙肼耐藥基因的檢測，可作為一種快速檢測方法，用于耐藥結(jié)核病的檢查[11-12]。

二、結(jié)核分枝桿菌對利福平耐藥的原因主要是由于編碼RNA聚合酶的rpoB基因突變，干擾了利福平與RNA聚合酶β亞單位結(jié)合，使利福平失去療效[13]。對異煙肼耐藥與過氧化氫酶編碼基因KatG及烯酰酸性磷酸酶還原酶(NADH)編碼基因inhA和ahpC基因啟動子的缺失和突變有關(guān)[14]，基因突變使得異煙肼不能干擾細胞壁中分枝菌酸的生物合成，不能破壞結(jié)核分枝桿菌細胞壁的完整性及抗酸性，使異煙肼失去療效，導致耐藥[15]。目前無論是國產(chǎn)試劑還是進口試劑都是基于此原理設(shè)計探針，用于檢測與利福平、異煙肼耐藥相關(guān)的基因，盡管進口試劑設(shè)計的探針數(shù)量略多于國產(chǎn)試劑，但表1的檢測結(jié)果提示國產(chǎn)試劑與進口試劑對利福平、異煙肼耐藥的陽性檢出率無顯著差異(P>0.05)，國產(chǎn)試劑使用的基因檢測法與傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)法相比，對利福平、異煙肼耐藥的陽性檢出率也無顯著差異(P>0.05)，基因檢測法的使用，提高了耐藥結(jié)核病的診斷效率，有利于用藥方案的及時調(diào)整，提高耐藥結(jié)核病患者的治愈率。

三、表2結(jié)果表明，以傳統(tǒng)的羅氏藥敏結(jié)果為金標準，國產(chǎn)試劑和進口試劑對利福平耐藥的陽性檢出率分別為100%、97.22%，國產(chǎn)試劑的檢測結(jié)果與傳統(tǒng)的藥敏結(jié)果高度一致；兩種試劑對異煙肼耐藥的陽性檢出率均為88.57%，低于傳統(tǒng)的藥敏結(jié)果，造成這一現(xiàn)象的原因可能是由于目前檢測異煙肼耐藥的試劑僅包含KatG和inhA兩種最常見的耐藥基因以及少量的耐藥位點，與異煙肼耐藥相關(guān)的基因位點還有很多[15]，目前的基因檢測試劑包含的變異位點數(shù)有限，使得有些對異煙肼耐藥的菌株不能被及時檢出。

四、表3結(jié)果表明，以傳統(tǒng)的羅氏藥敏結(jié)果為金標準，國產(chǎn)試劑與進口試劑對利福平、異煙肼耐藥的檢出敏感性和特異性相近，二者相比差異不明顯(P>0.05)，國產(chǎn)試劑對儀器要求不高，操作簡單，24h可出具報告，試劑價格相對便宜，可作為進口試劑的替代產(chǎn)品在國內(nèi)基層醫(yī)院廣泛使用，既滿足臨床對結(jié)核分枝桿菌耐藥快速檢測的需要，又為患者節(jié)約了檢測成本。

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Clinical value of domestic reagents for detecting of drug resistance gene of Mycobacterium tuberculosis against isoniazid and rifampin

ZHANGQi-quan,HOUYuan-pei,LIUCheng-yong.

DepartmentofClinicalLaboratory,XuzhouMunicipalInfectiousDiseaseHospital,Xuzhou,Jiangsu221004,China

Objective To compare the differences of domestic and imported reagents on detecting drug resistance gene of Mycobacterium tuberculosis against isoniazid and rifampin. Methods Drug resistance was detected by reagent with Germany Hain life science GmbH production MTBDRplus and Yaneng Biological Technology Co. (Shenzhen) analysis in 152 strains with L-J culture-positive, and the results of L-J culture were compared. Results 148 strains were compared in 152 cases. The rates of drug resistance against rifampin and isoniazid were 47.30% (70/148) Vs 43.24% (64/148), 50% (74/148) Vs 41.89% (62/148) and 48.65% (72/148) Vs 47.30% (70/148) by imported reagents, domestic reagents and L-J culture respectively. The rates of drug resistance against rifampin and isoniazid showed no significant difference among imported reagents, domestic reagents and L-J culture (P>0.05). The sensitivity and specificity had no significant difference in detecting drug resistance against isoniazid and rifampin between imported and domestic reagents as the gold standard of l-J susceptibility (P>0.05). Conclusion The sensitivity and specificity about domestic reagent for detecting isoniazid and rifampicin are closer to imported reagents. Domestic reagents fit for basic hospital on detecting drug resistance of Mycobacterium tuberculosis rapidly, because it is simple and cheap.

mycobacterium tuberculosis; isoniazid; rifampicin; drug resistance

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.06.003

221004 江蘇 徐州 ，徐州市傳染病醫(yī)院檢驗科

侯遠沛,E-mail hhyyppxz@163.com

2016-09-18]