蔣文明，田文霞，侯廣宇，李金平，程 隆，王素春，彭 程，王仲兵，陳繼明

（1. 中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2. 山西省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山西太原 033000）

山西省圣天湖天鵝H5N8禽流感疫情與當(dāng)前H5亞型病毒譜系分析

蔣文明1，田文霞2，侯廣宇1，李金平1，程 隆2，王素春1，彭 程1，王仲兵2，陳繼明1

（1. 中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2. 山西省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山西太原 033000）

2016年12月，山西省芮城縣圣天湖景區(qū)的18只白天鵝陸續(xù)出現(xiàn)異常死亡。經(jīng)病毒分離、基因組測(cè)序與分析，確定此次疫情的病原為H5N8亞型高致病性禽流感病毒。該毒株與同期在歐洲流行的H5N8病毒同源性很高，其HA和NA基因同源性分別為99.1%～99.6%和98.7%～99.6%；同期在歐洲流行的H5N8病毒的HA基因主要從2010—2013年在韓國(guó)、保加利亞、泰國(guó)、越南流行的病毒進(jìn)化而來(lái)?；蚪M序列分析表明，2016年流行的H5N8病毒是一種新重組病毒。病毒的不斷變異進(jìn)化，造成了全球H5亞型禽流感流行的復(fù)雜性，增加了對(duì)其防控的難度，疫苗也需要隨之更新?lián)Q代。因此，建議加大疫苗的研發(fā)投入力度，改進(jìn)水禽養(yǎng)殖模式，提高水禽免疫覆蓋率和合格率，從而降低其感染和排毒的風(fēng)險(xiǎn)。

禽流感；野鳥(niǎo)；H5；防控

2016年11月以來(lái)，H5N8亞型禽流感病毒在歐洲、中東、非洲等地引起了多起疫情，我國(guó)的遷徙野鳥(niǎo)也受到影響。本研究對(duì)引起2016年12月山西省芮城縣圣天湖天鵝疫情的病原進(jìn)行了分離和分析，并結(jié)合當(dāng)前的H5亞型禽流感形勢(shì)，提出了相應(yīng)的防控措施，以期為H5亞型禽流感的防控提供技術(shù)支持。

1 圣天湖天鵝疫情基本情況

山西省芮城縣圣天湖的規(guī)劃范圍包括圣天湖內(nèi)湖、外湖、周邊部分的河灘地，以及內(nèi)湖西側(cè)的部分林地。地域范圍東至黃河河岸，西邊及北邊至崖根，南至圣天湖南壩外200 m；地理坐標(biāo)為東經(jīng)110°53′27″～110°55′02″，北緯34°42′20″～34°44′04″；總面積為470.8公頃（1公頃= 0.01 km2），其中非水域面積約246.6公頃。2016年在芮城縣越冬的天鵝約有1 500余只、野鴨約3 000余只。

2016年12月13日，圣天湖景區(qū)有2只白天鵝異常死亡；12月16日，又有8只白天鵝死亡。12月18日、19日、20日，圣天湖景區(qū)又分別有3只、2只、3只白天鵝死亡。此次疫情共造成18只白天鵝死亡。

2 病毒分離

將發(fā)病天鵝的肺臟、腸道組織剪碎后，加入含抗生素的PBS和鋼珠，用MM400組織勻漿機(jī)（Retsch）處理后，-20 ℃凍融1次，10 000 r/min 4 ℃離心10 min，上清經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后接種10日齡SPF雞胚，37 ℃孵化培養(yǎng)，每隔24 h照胚1次；收獲死胚尿囊液，用1%雞紅細(xì)胞測(cè)定其血凝性。

3 基因組測(cè)序與分析

用QIAamp Viral RNA Mini Kit（Qiagen）提取血凝陽(yáng)性尿囊液中的病毒RNA，根據(jù)Hoffmann發(fā)表的文獻(xiàn)[1]，用HiScript II One Step RT-PCR Kit（Vazyme）擴(kuò)增病毒的8個(gè)基因片段。反應(yīng)體系包括：2 × RT-PCR Buffer 25.0 μL，引物各2.0 μL（10 μmol/L），Enzyme Mix 2.5 μL，ddH2O 12.5 μL，RNA模板6.0 μL。RT-PCR反應(yīng)條件為：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min，94 ℃預(yù)變性2 min，然后94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。用innuPRER Gel Extraction Kit（Analytikjena）回收純化PCR產(chǎn)物，然后與pClone-TA-AMP載體（Clone Smarter）連接，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒送青島志遠(yuǎn)生物進(jìn)行測(cè)序鑒定。

Blast結(jié)果顯示，此次疫情的病原為H5N8亞型高致病性禽流感，并命名為A/swan/Shanxi/ST/2016（H5N8）。下載GenBank和GISAID數(shù)據(jù)庫(kù)中的禽流感病毒基因組序列，利用MegAlian軟件對(duì)序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)A/swan/Shanxi/ST/2016與同期在歐洲流行的H5N8病毒同源性很高（表1），而與2014—2015年在全球流行的H5N8病毒同源性較低。HA和NA基因與同期在歐洲流行的H5N8病毒同源性分別為99.1%～99.6%和98.7%～99.6%。其中，HA基因核苷酸序列與A/duck/India/10CA01/2016、A/ turkey/Poland/83/2016、A/turkey/Poland/78/2016、A/bronze_turkey/Czech_Republic/1414-17/2017的同源性最高。NA基因核苷酸序列與A/duck/ India/10CA01/2016、A/Brown-headed_Gull/ Qinghai/ZTO1-LU/2016的同源性最高。除NP基因與A/great_crested_grebe/Uvs-Nuur_Lake/341/2016（H5N8）的同源性最高，親緣關(guān)系最近外，其他內(nèi)部基因與A/duck/India/10CA01/2016的同源性最高，親緣關(guān)系最近。

表1 A/swan/Shanxi/ST/2016（H5N8）基因組與同期在歐洲流行的H5N8病毒同源性比較

利用Mega 6軟件對(duì)H5N8亞型禽流感病毒HA基因片段進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)前的H5N8病毒HA基因主要從2010—2013年在韓國(guó)、保加利亞、泰國(guó)、越南流行的病毒進(jìn)化而來(lái)（圖1）。H5N8病毒HA基因可以分為兩個(gè)大的分支[2]：一是Gochang1分支，以A/breeder duck/Korea/Gochang1/2014為代表，主要包括2016—2017年在全球流行的H5N8病毒，以及2013—2014年中國(guó)和韓國(guó)流行的部分毒株。導(dǎo)致此次圣天湖天鵝疫情的病毒屬于此分支。二是Buan2分支，以A/broiler duck/Korea/ Buan2/2014為代表，主要包括2014—2015年在全球流行的H5N8病毒，以及2010—2014年中國(guó)流行的部分毒株。特別指出的是，2016年在韓國(guó)流行的H5N8也屬于這個(gè)分支。

圖1全球H5N8亞型禽流感病毒HA基因遺傳進(jìn)化分析

4 H5N8候鳥(niǎo)疫情

2014年1月16日，韓國(guó)首先報(bào)道了H5N8亞型高致病性禽流感疫情。此次疫情導(dǎo)致蛋鴨產(chǎn)蛋率下降（60%）和死亡率上升。此后該病毒迅速傳播至亞洲（中國(guó)、日本）、歐洲（德國(guó)、荷蘭、英國(guó)、意大利）和北美洲（美國(guó)），在全球引起了大流行。從2016年11月開(kāi)始，歐洲多個(gè)國(guó)家再次暴發(fā)H5N8亞型高致病性禽流感疫情，并迅速蔓延至歐洲、亞洲和大洋洲，感染的禽類(lèi)涉及野生鳥(niǎo)類(lèi)、鴨子和火雞等[3]。

現(xiàn)有證據(jù)表明，這兩波疫情主要是由野生鳥(niǎo)類(lèi)傳播引起的。2014年秋季，H5N8亞型高致病性禽流感病毒隨鳥(niǎo)類(lèi)遷徙傳播到了西伯利亞[4-5]，之后從西伯利亞傳播到亞洲、歐洲和北美洲，導(dǎo)致了第一波疫情的發(fā)生。2016年秋季，H5N8亞型高致病性禽流感病毒隨候鳥(niǎo)遷徙傳播到了南亞、歐洲、中東、非洲，導(dǎo)致了第二波疫情的發(fā)生。該病毒能很好地適應(yīng)某些水禽，并隨著這些水禽的長(zhǎng)距離遷徙開(kāi)始跨洲傳播?；蚪M序列分析結(jié)果表明，導(dǎo)致第二波疫情的H5N8病毒是一種新的重組病毒[6]。

5 H5亞型禽流感病毒譜系分析

5.1 第2.3.4.4分支H5亞型禽流感病毒譜系分析

該分支于2013年下半年開(kāi)始出現(xiàn)，包括N1、N2、N6、N8等亞型。利用Mega 6軟件，對(duì)H5N8亞型禽流感病毒HA基因片段進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)第2.3.4.4分支病毒HA基因可以分為四個(gè)大的分支：一是Group A分支（以A/broiler duck/Korea/ Buan2/2014為代表），主要包括2014—2015年導(dǎo)致全球疫情的H5N8病毒，還包括少量國(guó)內(nèi)分離的H5毒株。二是Group B分支，主要包括2014—2015年流行的少量H5亞型病毒。三是Group C分支，主要包括2014—2017年全球流行的H5亞型病毒（包括N1、N2、N6等亞型）。我國(guó)2016年開(kāi)始使用的Re-8疫苗屬于此分支。四是Group D分支（以A/ breeder duck/Korea/Gochang1/2014為代表），主要包括2016—2017年導(dǎo)致全球疫情的H5N8病毒，還包括少量2013—2014年從中國(guó)和韓國(guó)分離的毒株。相對(duì)Group A、B、D分支，Group C分支的病毒數(shù)量更多，可進(jìn)一步分為4個(gè)小分支（圖2）。與Re-8疫苗株相比，各分支中出現(xiàn)了一些變異株，應(yīng)引起足夠重視。

5.2 第2.3.2.1分支H5亞型禽流感病毒譜系分析

該分支于2009年開(kāi)始流行，病毒主要?jiǎng)澐譃閍、b、c 3個(gè)小分支。2012年我國(guó)推出Re-6疫苗（b小分支）來(lái)防控該分支的病毒。隨著病毒的進(jìn)化，2014年下半年之后，出現(xiàn)了一些變異較大的毒株，其分別位于d和e兩個(gè)新的小分支（圖3）[7]。研究表明，現(xiàn)有Re-6疫苗對(duì)d和e分支病毒的保護(hù)有限。2017年3月20日，農(nóng)業(yè)部發(fā)布第2501號(hào)公告，用Re-10疫苗替代Re-6疫苗。

5.3 第7.2分支H5亞型禽流感病毒譜系分析

圖2第2.3.4.4分支H5亞型禽流感病毒HA基因遺傳進(jìn)化分析

該分支于2011年開(kāi)始出現(xiàn)，其前身為2006年在我國(guó)北方出現(xiàn)的第7分支。2006年我國(guó)使用Re-4疫苗來(lái)防控第7分支病毒。隨著病毒的進(jìn)化，Re-4疫苗的保護(hù)率出現(xiàn)下降，2014年我國(guó)又推出Re-7疫苗替代Re-4疫苗來(lái)防控第7.2變異株（圖4）。隨著疫苗使用，從2015年開(kāi)始很少監(jiān)測(cè)到該分支病毒。

6 結(jié)語(yǔ)

圖3第2.3.2.1分支H5亞型禽流感病毒HA基因遺傳進(jìn)化分析

圖4我國(guó)H5亞型禽流感病毒進(jìn)化歷程

自1 9 9 6年我國(guó)首次在廣東省的鵝中分離到H5N1高致病性禽流感病毒（A/goose/ Guangdong/1/1996）以來(lái)，我國(guó)的H5亞型高致病性禽流感病毒的流行呈現(xiàn)出復(fù)雜的態(tài)勢(shì)。最重要是病毒在不斷變異，由最初的第0分支（GS/GD/1/96）逐步進(jìn)化為第2和第7分支，前者繼續(xù)進(jìn)化為第2.3.4和第2.3.2.1a、b、c分支，后者繼續(xù)進(jìn)化為第7.1和7.2分支。第2.3.4分支又進(jìn)一步進(jìn)化為第2.3.4.4a、b、c分支，第2.3.2.1分支又進(jìn)一步進(jìn)化為d和e分支。病毒的不斷變異進(jìn)化，造成了H5亞型禽流感疫情的復(fù)雜性，增加了防控難度。隨著病毒的變異，疫苗也隨之更新?lián)Q代，由最初的Re-1到Re-4、Re-5，再到后來(lái)的Re-6、Re-7、Re-8和Re-10。但是，疫苗的研發(fā)和使用，永遠(yuǎn)落后于病毒的變異和進(jìn)化。一些疫情的發(fā)生也是由于現(xiàn)有疫苗不能對(duì)流行毒提供足夠的保護(hù)。

要解決這個(gè)問(wèn)題，一是要鼓勵(lì)有條件的單位加大疫苗的研發(fā)投入力度，研發(fā)針對(duì)性強(qiáng)、更加有效的疫苗，加快符合生產(chǎn)實(shí)際疫苗的審批。二是促進(jìn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的專(zhuān)業(yè)升級(jí)，政府要加大出臺(tái)相關(guān)措施和政策的力度，大力鼓勵(lì)和扶持養(yǎng)殖企業(yè)向標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)?；⒓s化、現(xiàn)代化方向發(fā)展，對(duì)登記備案、動(dòng)物防疫條件合格、養(yǎng)殖檔案齊全、生物安全水平和防疫水平合格的養(yǎng)殖企業(yè)進(jìn)行獎(jiǎng)勵(lì)。三是重點(diǎn)解決水禽的免疫問(wèn)題。監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)水禽的帶毒率和發(fā)病率較雞的要高，而且由于我國(guó)的水網(wǎng)密集、水禽養(yǎng)殖量大、養(yǎng)殖方式落后，導(dǎo)致水禽的免疫覆蓋率和合格率較低，帶毒率和發(fā)病率較高。由于水禽對(duì)禽流感病毒的天然耐受，很多水禽帶毒而不表現(xiàn)任何癥狀，又可繼續(xù)排毒繼而感染其他家禽。因此，要改進(jìn)水禽的養(yǎng)殖模式，提高水禽的免疫覆蓋率和合格率，從而降低其感染和排毒的風(fēng)險(xiǎn)。

[1] HOFFMANN E，STECH J，GUAN Y，et al. Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses[J]. Arch Virol，2001，146（12）：2275-2289.

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（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

Analysis of Swan H5N8 Avian Inf l uenza in Holy Lake of Shanxi Province and the Current Virus Lingeage of H5 Subtype Avian Inf l uenza

Jiang Wenming1，Tian Wenxia2，Hou Guangyu1，Li Jinping1，Cheng Long2，Wang Suchun1，Peng Cheng1，Wang Zhongbing2，Chen Jiming1
（1. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032；2. Shanxi Animal Disease Prevention and Control Center，Taiyuan，Shanxi 033000）

In December 2016，18 white swans died in the scenic area of Holy Lake in Ruicheng county of Shanxi province. It was conf i rmed that the outbreak was caused by the H5N8 subtype highly pathogenic avian inf l uenza virus through virus isolation，genome sequencing and analysis. The homology between the strain and the prevalent H5N8 viruses was high. The homology between HA and NA genes was 99.1%～99.6% and 98.7%～99.6%，respectively. During the same period，the HA gene，which was prevalent in Europe，evolved mainly from viruses prevalented in South Korea，Bulgaria，Thailand，and Vietnam （H5N8）in 2010—2013. Genome sequence analysis showed that the prevalent H5N8 virus in 2016 was a new recombinant virus. The complexity of the global H5 subtype avian inf l uenza epidemic was created by the continuous evolution of the virus，increasing the diff i culty of its prevention and control，and the vaccine needs to be updated accordingly. Suggestions of increasing investment and efforts in vaccine research and development，improving the waterfowl farming model，and improving the coverage rate and pass rate of waterfowl were put forward，in order to reduce the risk of infection and detoxif i cation.

avian inf l uenza；wild bird；H5；prevention and control

S852.65

：A

：1005-944X（2017）06-0014-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.06.004

科技部科技基礎(chǔ)性工作專(zhuān)項(xiàng)（2012FY111000）；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFD0501609）