凌善鋒,肖漢祥,簡清梅, Nhuan P. Nghiem, 張潤杰，李燕芳

(1.荊楚理工學(xué)院生物工程學(xué)院,湖北 荊門 448000; 2.美國農(nóng)業(yè)部(USDA)東部研究中心(ERRC), 賓夕法尼亞州 費(fèi)城 19038； 3.堪薩斯州立大學(xué)，堪薩斯州 曼哈頓 66506; 4.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,廣東 廣州 510640； 5.中山大學(xué)有害生物控制與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州510275)

白背飛虱可能與吡蚜酮抗性相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)*

凌善鋒1,2,3,肖漢祥4,簡清梅1, Nhuan P. Nghiem2, 3, 張潤杰5，李燕芳4

(1.荊楚理工學(xué)院生物工程學(xué)院,湖北 荊門 448000; 2.美國農(nóng)業(yè)部(USDA)東部研究中心(ERRC), 賓夕法尼亞州 費(fèi)城 19038； 3.堪薩斯州立大學(xué)，堪薩斯州 曼哈頓 66506; 4.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,廣東 廣州 510640； 5.中山大學(xué)有害生物控制與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州510275)

運(yùn)用雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)，分析了白背飛虱吡蚜酮抗性相關(guān)的蛋白質(zhì)。在所有的蛋白點(diǎn)中, 22個蛋白點(diǎn)被PMF成功識別。這些蛋白點(diǎn)展示了各種各樣的細(xì)胞功能，主要包括：①碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和新陳代謝；②蛋白質(zhì)新陳代謝和分子伴侶；③能量的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化；④轉(zhuǎn)錄和翻譯；⑤無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和新陳代謝；⑥氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和新陳代謝；⑦脂質(zhì)新陳代謝。絕大多數(shù)蛋白都沒有報道與吡蚜酮抗性相關(guān)。

白背飛虱；吡蚜酮抗性；雙向電泳；質(zhì)譜

白背飛虱是亞洲國家重要的遷飛性的水稻害蟲,從2005年開始,白背飛虱的再猖獗在亞洲國家出現(xiàn)，包括中國、韓國、越南、日本、泰國，殺蟲劑的抗性跟白背飛虱的爆發(fā)密切相關(guān)[1-3]。吡蚜酮，一種新型吡啶雜環(huán)類殺蟲劑，藥效優(yōu)異，但是，在最近5年中，其抗藥性不斷發(fā)展。2011年，江蘇無錫和鹽城灰飛虱田間種群對吡蚜酮發(fā)展為低水平抗性[4]。隨后，褐飛虱對吡蚜酮的抗藥性激增，其中2012對吡蚜酮達(dá)到34.9～46.8倍，達(dá)到中抗水平[5]。2012年采集自湖北荊門的白背飛虱遷入種群有中等水平抗性(RR=16.07)，遷出種群和回遷種群對田間吡蚜酮農(nóng)藥有高水平抗性(RR=54.35, 51.60)[6]。湖北荊門白背飛虱種群對吡蚜酮的抗性在推進(jìn)性激增?？剐灾卫砥仍诿冀蕖?/p>

吡蚜酮抗性的增加主要是由于吡蚜酮頻繁使用以及吡蚜酮和新煙堿類殺蟲劑的交互抗性，這種現(xiàn)象在溫室粉虱中已有報道[5]。在煙粉虱中吡蚜酮抗性的主要原因是細(xì)胞色素P450酶CYP6CM1超表達(dá)[7]。

本文中，我們通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析了白背飛虱抗性，研究結(jié)果很可能有助于理解遷飛白背飛虱的抗性形成機(jī)制，有助于采取相應(yīng)的抗性治理措施，這將具有較重要的科學(xué)意義。

1 材料和方法

1.1 昆蟲品系和殺蟲劑

敏感品系: 2015年9月由荊門市農(nóng)業(yè)病蟲害測報站提供多年室內(nèi)飼養(yǎng)的白背飛虱，經(jīng)室內(nèi)在不接觸任何農(nóng)藥的條件繼續(xù)飼養(yǎng)繁育而成,吡蚜酮的具體抗性是1.00。

田間品系: 2014年9月, 白背飛虱采自湖北荊門市稻田。

抗性品系: 吡蚜酮 (w=25%) 構(gòu)自江蘇風(fēng)山集團(tuán)公司，吡蚜酮用丙酮和水稀釋成雙倍系列濃度, 吡蚜酮抗性白背飛虱品系在實(shí)驗(yàn)室用吡蚜酮對田間品系連續(xù)篩選7代培育而成,對吡蚜酮的具體抗性是33.33。

1.2 方法

雙向電泳，膠內(nèi)消化和質(zhì)譜。

蛋白抽提和雙向電泳按照Sharma等[8]進(jìn)行, 膠內(nèi)消化和質(zhì)譜按照Ge等[10]進(jìn)行。每組蛋白質(zhì)抽提方法改進(jìn)的地方如下: 52頭長翅型雌成蟲用作白背飛虱的蛋白質(zhì)樣品抽提，稱取92 mg雌成蟲放在1 mL裂解液(9 mol/L尿素;φ=5% CHAPS; 36 mmol/L Tris-HCl; 3 mol/L 硫脲;φ=1% β-巰基乙醇;蛋白酶抑制劑雞尾酒)中,置于冰上，用研棒進(jìn)行充分勻漿。然后在冰上超聲,4 ℃ 13 600 r/min離心50 min,用-20 ℃的冷丙酮沉淀蛋白2.2 h后,重新溶解在重泡脹緩沖液(10 mol/L尿素; 3 mol/L 硫脲;φ=5% CHAPS; 90 mmol/L二硫蘇糖醇和w=2%兩性電解質(zhì))中,備用。蛋白濃度用Bradford方法進(jìn)行測定[9]。

1.3 數(shù)據(jù)庫搜索

蛋白點(diǎn)的數(shù)據(jù)庫搜索的詳細(xì)方法按照Ge等[10]進(jìn)行。

2 結(jié) 果

跟對照相比，抗性種群細(xì)胞的雙向電泳圖譜發(fā)生了明顯的變化。一些蛋白點(diǎn)被明顯誘導(dǎo)，很可能涉及到吡蚜酮抗性。圖1：(A)和圖1：(B)是吡蚜酮抗性種群和對照的雙向電泳圖譜，對于表達(dá)水平明顯變化的點(diǎn)，我們用胰蛋白酶進(jìn)行消化，質(zhì)譜進(jìn)行了分析，數(shù)據(jù)庫(包括昆蟲、細(xì)菌、人)搜索，他們的相對分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、細(xì)胞功能列在表1。22個吡蚜酮抗性相關(guān)的蛋白點(diǎn)被成功識別。我們認(rèn)為細(xì)胞色素P450單加氧酶直接參與了吡蚜酮抗性，表1是鑒定出的重要的其它差異表達(dá)蛋白點(diǎn)，但是它們與抗藥性的真正關(guān)系很難解釋。

3 討 論

在所有的蛋白點(diǎn)中, 22個蛋白點(diǎn)被PMF成功識別。這些蛋白點(diǎn)展示了各種各樣的細(xì)胞功能，主要包括:①碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和新陳代謝;②蛋白質(zhì)新陳代謝和分子伴侶;③能量的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化;④轉(zhuǎn)錄和翻譯;⑤無機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和新陳代謝;⑥氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和新陳代謝;⑦脂質(zhì)新陳代謝。絕大多數(shù)蛋白都沒有報道與吡蚜酮抗性相關(guān)，它們與抗藥性的真正可能關(guān)系需要進(jìn)一步解釋。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)(雙向電泳和質(zhì)譜)在稻飛虱抗藥性機(jī)理和農(nóng)藥毒理學(xué)方面研究較少。由氨基甲酸酯類殺蟲劑(BPMC)中毒的褐飛虱的蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果表明：10個蛋白點(diǎn)(即HSP 90、β微管蛋白、ATP合成酶、肌動蛋白、原肌球蛋白、副肌球蛋白、鈣網(wǎng)蛋白、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶等)表達(dá)上升，β-線粒體加工肽酶、二氫硫辛酰胺脫氫酶、烯醇化酶、?；o酶A 脫氫酶表達(dá)下降[8]。管家蛋白如細(xì)胞色素b、NADH脫氫酶、延伸因子EF、ATP合成酶、肌球蛋白和微管蛋白等報道與稻飛虱抗藥性有關(guān)[9]。方琦[9]通過研究報道了白背飛虱對田間農(nóng)藥馬拉硫磷抗性的蛋白質(zhì)組學(xué)基礎(chǔ)：酚氧化酶、烯醇化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、肌鈣蛋白、細(xì)胞色素氧化酶等是與白背飛虱對馬拉硫磷的抗性相關(guān)的蛋白。其中，酚氧化酶、烯醇化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶在抗性品系中的表達(dá)量高于敏感品系。所以，白背飛虱對馬拉硫磷的抗性機(jī)制不僅僅與其體內(nèi)酯酶的擴(kuò)增有關(guān)，而是涉及諸多生理過程，可能包括: 血淋巴黑化及凝結(jié)、糖酵解途徑變化(磷酸戊糖途徑開啟，糖異生發(fā)生)等，這些生理機(jī)制共同協(xié)調(diào)控制抗性機(jī)制。酚氧化酶是導(dǎo)致白背飛虱血淋巴黑化與凝結(jié)的重要因子，血淋巴黑化與凝結(jié)是白背飛虱防御有害物質(zhì)農(nóng)藥入侵的有效手段，是白背飛虱體液免疫的重要組成部分。一些跟生殖相關(guān)的新蛋白如精子發(fā)生相關(guān)蛋白5、睪丸發(fā)育蛋白NYD-SP6、精氨酸激酶、肌動蛋白5C、卵黃蛋白、卵巢的絲氨酸蛋白酶Nudel被發(fā)現(xiàn)，這6個新蛋白點(diǎn)均上調(diào)[10]。在我們的研究中，在吡蚜酮抗性種群中，16個差異表達(dá)的新蛋白點(diǎn)上調(diào)，6個新蛋白點(diǎn)下調(diào)，這將有助于理解遷飛白背飛虱的抗性形成機(jī)制，有助于更新相應(yīng)的抗性治理策略。第20個點(diǎn)鑒定為細(xì)胞色素P450單加氧酶，細(xì)胞色素單加氧酶(P450)活性提高在一些殺蟲劑抗性中起重要的作用，如乙蟲腈、吡蟲啉、撲虱靈、殺蟲雙、擬除蟲菊酯、氰戊菊酯、銳勁特[5,11]。

圖1 白背飛虱抗性種群(B)和敏感種群(A)雙向電泳圖譜Fig.1 Representative two-dimensional electrophoresis (2-DE) maps of the susceptible population (A) and pymetrozine resistance population (B) in Sogatella furcifera箭頭表示不同差異表達(dá)的蛋白，識別的蛋白用不同的阿拉伯?dāng)?shù)字表示，并且列在表1中Arrows indicate differently expressed proteins that were detected. Numbers correlate with the protein identification listed in Table 1

SpotNoIdentifiedprotein(a)Function(b)TheoreticalpI(Mw)/103Coverage/%Expressionievel(c)Carbohydratetransportandmetabolism1Phosphofructokinase8.37(86.723)17↑2Pyruvatekinase4.63(42.22)23↑Proteinmetabolismandchaperone3Peptidase-relatedprotein5.85(28.216)12↓4heatshockprotein,HSP20family4.13(82.533)15↑Signaltransductionmechanisms5Responseregulator6.49(21.752)9↑135-hydroxytryptamine(serotonin)receptor1A5.82(84.636)23↓215-hydroxytryptamine(serotonin)receptor6.20(72.156)27↓22serotonintransporter,isoformA3.98(68.126)29↓Energyproductionandconversion6Succinatedehydrogenase7.84(35.641)18↑7SuccinylCoAsynthetasebetachain5.47(46.853)14↑8Malatedehydrogenase6.20(63.667)13↑9ferredoxin9.71(18.665)16↑Transcriptionandtranslation10translationinitiationfactorIF-24.70/66.12527↑11elongationfactorTu,mitochondrial-likeisoform17.72/543358↓Inorganiciontransportandmetabolism15calciumactivatedpotassiumchannel8.02/72.21517↑20cytochromeP450monooxygenase8.71/76.33327↑12Catalase6.29/56.66611↑Aminoacidtransportandmetabolism14putativeglutamatedehydrogenase7.37/57.8299↑Lipidmetabolism16L-3-hydroxyacyl-CoAdehydrogenaseprecursor8.07/29.91322↑17acylCoAdehydrogenase5.96/44.16329↑18β-ketoacylACPsynthasePrecursor7.16/43.69911↓19Biotincarboxylcarrierprotein9.48/11.23513↑

(a) 在MASCOT 數(shù)據(jù)庫中，識別到的差異表達(dá)的新蛋白點(diǎn)變化明顯(P<0.05) ； Identified new protein scores in MASCOT database are all significant (P<0.05)

(b) 蛋白質(zhì)功能分類根據(jù)NCBI’s clusters of orthologous groups； Protein function classification is based on NCBI’s clusters of orthologous groups

(c) 吡蚜酮抗性種群中，↑和↓分別表示這些差異表達(dá)的新蛋白點(diǎn)上調(diào)和下調(diào)； The downward and upward arrows represent those spots which were newly appeared or increased respectively in pymetrozine resistance population

總而言之，細(xì)胞色素P450單加氧酶在吡蚜酮去毒和抗性發(fā)展中起著關(guān)鍵的作用，與多功能氧化酶的抑制劑的混合使用是白背飛虱種群敏感性恢復(fù), 延緩吡蚜酮的抗性發(fā)展的重要方法。

[1] 張梅,陳佳林,周曉穗,等. MSAP在水稻害蟲白背飛虱中的應(yīng)用研究 [J]. 中山大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2015, 54(1): 98-102. ZHANG M，CHEN J，ZHOU X，et al. The application of MSAP inSogatellafurcifera(Horvath) [J]. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Sunyatseni, 2015,54 (1): 98-102.

[2] 梁梓強(qiáng),梁士可,張梅,等. 褐飛虱可溶性蛋白SDS-PAGE電泳分析 [J]. 中山大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2015, 54(6) :27-30. LIANG Z，LIANG S，ZHANG M，et al. Soluble Proteins inNilaparvatalugens(St?l) by SDS-PAGE [J]. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Sunyatseni,2015,54(6) :27-30.

[3] TSUJIMOTO K, SUGII S, SANADAMORIMURA S, et al. A new method for monitoring the susceptibility of the brown planthopper,Nilaparvatalugens(Hemiptera:Delphacidae), to pymetrozine by combining topical applicationand measurement of offspring number [J]. Applied Entomology and Zoology, 2015, 51:1-6.

[4] BAN L，ZHANG S，HUANG Z，et al. Resistance monitoring and assessment of resistance risk to pymetrozine inLaodelphaxstriatellus(Hemiptera: Delphacidae) [J]. Journal of Economic Entomology, 2012, 105(6): 2129-2135.

[5] ZHANG X, LIU X, ZHU F, et al. Field evolution of insecticide resistance in the brown planthopper(NilaparvatalugensSt?l) in China [J]. Crop Protection, 2014; 58: 61-66.

[6] 凌善鋒，張潤杰. 白背飛虱遷入和遷出種群湖北荊門吡蚜酮抗性的最新監(jiān)測 [J]. 中山大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2013,52 (5):127 -129. LING S，ZHANG R. New Pymetrozine resistance monitoring of the immigration and emigration population ofSogatellafurciferacollected from the rice fields of Jingmen City，Hubei Province in 2012[J]. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Sunyatseni,2013,52 (5):127 -129.

[7] NAUEN R, VONTAS J, KAUSSMANN M，et al. Pymetrozine is hydroxylated by CYP6CM1, a cytochrome P450 conferring neonicotinoid resistance inBemisiatabaci[J]. Pest Management Science, 2013, 69: 457-461.

[8] SHARMA R, KOMATSU S, NODA H. Proteomic analysis of brown planthopper: application to the study of carbamate toxicity [J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology，2004，34: 425-432.

[9] 方琦. 白背飛虱抗藥性相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D]. 杭州: 浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院, 2006. FANG Q. Proteomie analysis of inseetieide resistanee of the white-backed planthopper,Sogatellafurcifera(Horvath)[D]. Hangzhou: College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, 2006.

[10] GE L Q, CHENG Y, WU J C, et al. Proteomic analysis of insecticide triazophos-induced mating-responsive proteins ofNilaparvatalugensSt?l (Hemiptera: Delphacidae) [J]. Journal of Proteome Research，2011, 10: 4597-4612.

[11] XU L, WU M, HAN Z. Overexpression of multiple detoxification genes in deltamethrin resistantLaodelphaxstriatellus(Hemiptera: Delphacidae) in China [J]. PLoS One, 2013, 8 :1-16.

Proteomic analysis of inseetieide resistance ofSogatellafurciferato pymetrozine

LINGShanfeng1,2,3,XIAOHanxiang4,JIANQingmei1,NhuanP.Nghiem2,3,ZHANGRunjie5,LIYanfang4

(1. Jingchu University of Technology，Jingmen 448000，China; 2. The United States Department of Agriculture, ERRC， Philadelphia 19038, Pennsylvania， USA; 3. Kansas State University, Manhattan 66506, Kansas, USA; 4.Plant Protection Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Science, Guangzhou 510640, China; 5. State Key Laboratory for Biocontrol and Institute of Entomology，Sun Yat-sen University， Guangzhou 510275，China)

In order to reveal the mechanism of pymetrozine resistance inSogatellafurciferaweperformedtheproteomicanalysisusing2-DPAGEseparationandMALDI-TOFMS.Ofthesespots, 22proteinswereidentifiedbyPMF.Theseproteinsdisplayvariouscellularfunctions,including：①carbohydratetransportandmetabolism; ②proteinmetabolismandchaperone; ③energyproductionandconversion; ④transcriptionandtranslation；⑤inorganiciontransportandmetabolism；⑥aminoacidtransportandmetabolism;and⑦lipidmetabolism.Mostoftheseproteinshavenotpreviouslybeenreportedtoberelevanttopymetrozineresistance.

Sogatellafurcifera；pymetrozine resistance; 2-D PAGE; MALDI-TOF MS

2016-05-16 基金項(xiàng)目： 湖北省教育廳省屬高校青年教師出國留學(xué)項(xiàng)目 (鄂教外函[2014]59號);國家科技支撐計劃項(xiàng)目(2016BAD19B07,2012BAD19B03);荊楚理工學(xué)院引進(jìn)博士科研啟動經(jīng)費(fèi)(2013BK05)

凌善鋒(1971年生),男; 研究方向：昆蟲生態(tài)學(xué)與害蟲防治；E-mail: shanfeng86@163.com

10.13471/j.cnki.acta.snus.2017.02.004

Q78;Q96

A

0529-6579(2017)02-0022-04