李光宗，曾喜歡，劉英富，霍景瑞，郁碩，張益，侯世科，陳小義，陳鋒

1.武警后勤學(xué)院 附屬醫(yī)院救援醫(yī)學(xué)研究所，天津 300162；2.錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121001；

3.武警后勤學(xué)院 細胞生物與醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，天津 300309

接種密度對C57BL/6小鼠CIK細胞增殖、分化及殺瘤作用的影響

李光宗1，曾喜歡2，劉英富3，霍景瑞3，郁碩1，張益2，侯世科1，陳小義3，陳鋒1

1.武警后勤學(xué)院 附屬醫(yī)院救援醫(yī)學(xué)研究所，天津 300162；2.錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121001；

3.武警后勤學(xué)院 細胞生物與醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室，天津 300309

目的：探討不同接種密度對C57BL/6小鼠細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞（CIK細胞）增殖分化及殺瘤作用的影響，進一步優(yōu)化CIK細胞培養(yǎng)方法。方法：按照1×106/mL（A組）、4×106/mL（B組）、8×106/mL（C組）、12×106/mL（D組）4種接種密度培養(yǎng)細胞，加入必要的細胞因子，14 d后收獲細胞，通過流式細胞術(shù)、CCK-8法對細胞增殖、分化、殺瘤作用進行分析。結(jié)果：培養(yǎng)過程中，C組細胞形態(tài)及增殖能力優(yōu)于A、B組，在14 d時收獲細胞并對其進行檢測時發(fā)現(xiàn)，C組CD3+/NK1.1+細胞所占比例明顯高于A、B組，殺瘤活性也優(yōu)于A、B組；D組細胞密度過大，在7 d細胞進入快速增殖期后出現(xiàn)大面積死亡。結(jié)論：適當(dāng)提高C57BL/6小鼠CIK細胞的接種密度利于細胞增殖、分化及殺瘤作用的形成，選擇8×106/mL的接種密度是較為合適的。

細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞；密度；細胞培養(yǎng)；增殖；殺瘤作用

細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞（cytokine-induced killer cells，CIK細胞）是細胞毒T細胞中表達CD3+和CD56+的獨特類型，其不僅有強大的抗腫瘤活性，還具有非MHC限制細胞毒性。它對多種腫瘤細胞具有殺傷作用，且對正常組織的毒性較低，因而廣泛應(yīng)用于臨床過繼性免疫治療[1]。目前針對腫瘤的體內(nèi)實驗研究多在小鼠腫瘤模型中開展[2-4]，而建立一種實用、高效的小鼠CIK細胞培養(yǎng)方法對于腫瘤細胞免疫治療研究顯得尤為重要。近年來，國內(nèi)外相關(guān)研究已培養(yǎng)出小鼠CIK細胞[5-7]，但均未探討接種密度對CIK細胞生長的影響，而筆者在培養(yǎng)過程中卻發(fā)現(xiàn)接種密度對于CIK細胞生長起很關(guān)鍵的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

SPF級雄性C57BL/6小鼠（6～8周）購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK-（軍）-2012-0004。小鼠IL-1、IL-2、γL-22購自Peprotech公司；抗CD3單抗、抗鼠CD3-FITC、抗鼠NK1.1-PE購自Ebioscience公司；X-VIVO15培養(yǎng)基購自Lonza公司；胎牛血清、青霉素、鏈霉素購自Gibco公司；紅細胞裂解液購自Sigma公司；CCK-8試劑盒購自貝博生物公司；流式細胞儀購自Millipore公司；離心機購自Eppendorf公司。

1.2 小鼠CIK細胞的制備

脫頸處死C57BL/6小鼠，在無菌環(huán)境中取出脾臟，用400目篩網(wǎng)分離脾細胞，加入紅細胞裂解液90 s后加入PBS終止反應(yīng)，離心收集細胞，用含10%胎牛血清的X-VIVO15完全培養(yǎng)基分別將細胞濃度調(diào)整為1×106/mL（A組）、4×106/mL（B組）、8×106/mL（C組）和12×106/mL（D組），接種于24孔板中，加入IFN-F（1000 U/mL），于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后加入抗CD3單抗（1 μg/mL）、IL-1（100 U/mL）、IL-2（300 U/mL），以后視生長情況傳代，使細胞密度始終與接種密度一致，并半量換液含IL-2（300 U/mL）的X-VIVO15完全培養(yǎng)基，14 d后收集細胞。

1.3 流式細胞儀檢測

將收集的CIK細胞用含1%牛血清白蛋白（BSA）的FACS緩沖液重懸，調(diào)整細胞濃度為1× 105/mL，加入熒光標(biāo)記抗體（CD3-FITC、NK1.1-PE），混勻，于4℃避光反應(yīng)30 min，然后用FACS緩沖液洗滌2次，最后用100μL FACS緩沖液重懸，上流式細胞儀分析

1.4 小鼠CIK細胞殺瘤活性檢測

應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測CIK細胞對小鼠骨髓瘤細胞Sp20的體外毒性試驗。細胞接種10 000/孔，效應(yīng)細胞（CIK細胞）與靶細胞（Sp20細胞）分別按5∶1、10∶1、20∶1的比例加入96孔板，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，37℃孵育4 h，測定各孔的D450nm值。殺瘤活性（%）=［1-（混合細胞D450nm-效應(yīng)細胞D450nm）/效應(yīng)細胞D450nm］×100

1.5 統(tǒng)計分析

計量資料用x±s表示，多組間比較用單因素方差分析，率的比較用χ2檢驗。P＜0.05時表示有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 不同接種密度對CIK細胞形態(tài)學(xué)的影響

剛從脾臟分離出的細胞呈單個分布，表現(xiàn)為圓形且體積較小，折光性弱，4組細胞形態(tài)無差別。當(dāng)在24 h后加入抗CD3單抗，IL-1、IL-2細胞因子后，細胞開始形成集落，但集落體積小，且散在分布，C、D組較A、B組集落稍大，且折光性更好。3 d后，C、D組集落明顯擴大并增多，立體感變強；A、B組集落也有增大，但明顯不如前者。7 d后，C組細胞增殖速度明顯加快，短期就能布滿培養(yǎng)板孔，細胞集落呈片狀，單個細胞大而飽滿，折光性強；B組細胞增殖速度稍慢，集落小于C組，但細胞形態(tài)與C組無明顯；A組則生長較為緩慢，集落小而分散，單個細胞體積不如B、C組，折光性較差；D組細胞密度過大，布滿整個視野，細胞出現(xiàn)大面積死亡（圖1）。14 d后，細胞增殖速度減慢，部分細胞呈不規(guī)則形狀，細胞碎片增多。

2.2 不同接種密度對CIK細胞增殖的影響

圖1 培養(yǎng)至7 d各組CIK細胞的形態(tài)特征（×100）

分別于0、3、7、14 d通過臺盼藍染色對細胞進行計數(shù)。如圖2所示，在3 d內(nèi)，細胞增殖較為緩慢，細胞數(shù)量甚至還有輕度下降，4組增殖速度無差別。3 d后細胞增值速度明顯加快，C、D組增殖速度（分別由3 d的5×106/mL擴增為7 d的40×106/mL，3 d的9×106/mL擴增為7 d的74×106/ mL）快于A、B組（分別由0.7×106/mL增長到1.9× 106/mL和由2×106/mL增長到12×106/mL）。7 d后，CIK細胞進入快速增長期，B、C組增殖較快，且C組（由7 d的40×106/mL增長到14 d的387×106/ mL，較0 d擴增48倍）增殖速度快于B組（由7 d的12×106/mL增長到14 d的132×106/mL，較0 d擴增33倍），A組增殖則較為緩慢（由7 d的1×106/ mL增長到14 d的17×106/mL，較0 d擴增17倍），D組則由于細胞增值速度過快、密度過大，導(dǎo)致細胞出現(xiàn)大面積死亡，直至14 d收集細胞時細胞所剩無幾。

2.3 不同接種密度對CIK細胞表型的影響

培養(yǎng)2周后，對收集的細胞進行流式分析，顯示不同接種密度對細胞免疫表型產(chǎn)生影響，C組中CD3+/NK1.1+細胞占到38.79%，明顯高于其他2組（A組為22.84%，B組為32.22%），見圖3。

2.4 不同接種密度對CIK細胞殺瘤活性的影響

圖2 各組CIK細胞增殖情況比較

圖3 培養(yǎng)至14 d各組CIK細胞的表型比較

隨著效應(yīng)細胞和靶細胞比例的不斷增大，CIK細胞對Sp20細胞的殺瘤活性也越大。對于相同效靶比，不同組之間存在差異。在效靶比為5∶1時，C組的殺瘤活性為74.0%±3.6%，高于A組（49.6%±2.9%，P＜0.01）和B組（61.0%±5.1%，P＜0.05），B組殺瘤活性高于A組（P＜0.05）；在效靶比為10∶1時，C組的殺瘤活性為81.0%±2.2%，高于A組（52.1%±3.2%，P＜0.01）和B組（63.3%±3.9%，P＜0.01）；在效靶比為20∶1時，C組的殺瘤活性為82.8%±2.8%，高于A組（70.3%±5.1%，P＜0.01）和B組（56.8±%1.7%，P＜0.01）。見表1。

表1 各組CIK細胞殺瘤活性比較

3 討論

CIK細胞是單個核細胞在抗CD3抗體和IL-1、IL-2、IFN等許多細胞因子共誘導(dǎo)下形成的，其增殖速度快、殺瘤范圍廣且不受免疫抑制藥物影響，殺瘤作用依賴于分泌細胞因子、穿孔素及Fas-Fas配體相互作用等途徑。在過去20年中，大量臨床實驗證實其在腫瘤病人中的安全性和有效性，因此被認為是一種理想的殺瘤細胞[8]。近年來，相關(guān)學(xué)者試圖通過優(yōu)化CIK細胞的培養(yǎng)方法，或?qū)⒓毎委熍c手術(shù)、化療、放療協(xié)同作用來進一步提高其殺瘤效率，因而迫切需要大量的基礎(chǔ)研究為其提供數(shù)據(jù)支持。目前，雖然相關(guān)實驗研究已培養(yǎng)出小鼠CIK細胞，但接種密度存在差異，更多采用1×106/mL的接種密度[5,7,9]，而筆者在研究過程中發(fā)現(xiàn)該密度培養(yǎng)效果并不十分理想，適當(dāng)提高密度更有利于細胞增殖、分化及殺瘤作用的形成。

本實驗結(jié)果顯示，在接種3 d后，不同密度組細胞無論在細胞形態(tài)和增殖速度上均存在明顯不同，第7 d時接種密度8×106/mL組細胞大而飽滿，折光性強，并且聚集成較大集落，細胞狀態(tài)良好，增殖能力強，擴增倍數(shù)為48倍，而接種密度1×106/mL組細胞體積小且細胞集落分散，擴增能力較差，擴增倍數(shù)僅為17倍，兩者差異明顯，由此可見適當(dāng)增大細胞接種密度能顯著提高細胞的活力狀態(tài)及增殖能力。但細胞接種密度也不宜過大，接種密度12×106/mL組細胞因其過于擁擠，導(dǎo)致生長空間相對不足，在第7 d出現(xiàn)大量細胞死亡。不同接種密度對CIK細胞的表型及殺瘤活性同樣有重要影響，在14 d時收集細胞并對其進行表型及殺瘤活性檢測發(fā)現(xiàn)，起主要殺瘤作用的CD3+/NK1.1+細胞在接種密度8×106/mL組中所占比例達到38.79%，遠高于接種密度1×106/mL組的22.84%。在用CCK-8法對CIK殺瘤活性進行檢測時，同樣發(fā)現(xiàn)接種密度8×106/mL組在各種效靶比中殺瘤活性高于1×106/mL組。有研究證實，CIK細胞能夠表達多種細胞因子，包括IFN-F、IL-2、TNF、IL-2R、IL-10R等[10]，適當(dāng)增加接種密度可提高培養(yǎng)基中的細胞因子水平，利于細胞增殖和功能形成。IL-2促進CIK細胞增殖、存活及殺瘤功能的形成，基于它能夠上調(diào)CIK細胞CD40LG和IFR7的表達[11]。CD40LG是CD40的配體，兩者結(jié)合后可抑制腫瘤生長并誘導(dǎo)其凋亡[12]；IFR7則是調(diào)節(jié)Ⅰ型IFN表達的轉(zhuǎn)錄因子，IFN能夠提高單核細胞的自噬和抗原呈遞功能[1]。此外，由于CIK細胞結(jié)團生長，各細胞之間的相互作用是否影響其增殖還待進一步研究。

綜上所述，我們初步探討了接種密度對小鼠CIK細胞增殖、分化及殺瘤作用的影響，對CIK細胞生長特性的研究有一定的啟迪，也為小鼠CIK細胞培養(yǎng)方式的優(yōu)化和進一步探索免疫細胞治療提供了新的思路。

[1]Jiang J,Wu C,Lu B.Cytokine-induced killer cells promote antitumor immunity[J].J Transl Med,2013,11: 83.

[2]Liu S,Wang X,Lu Y,et al.The combined use of cytokine-induced killer cells and cyclosporine a for the treatment of aplastic anemia in a mouse model[J].J Interferon Cytokine Res,2015,35(5):401-410.

[3]Kim J S,Chung I S,Lim S H,et al.Preclinical andclinical studies on cytokine-induced killer cells for the treatment of renal cell carcinoma[J].Arch Pharm Res,2014,37(5):559-566.

[4]Zhang L,Zhao G,Hou Y,et al.The experimental study on the treatment of cytokine-induced killer cells combined with EGFR monoclonal antibody against gastric cancer[J].Cancer Biother Radiopharm, 2014,29(3):99-107.

[5]Bach M,Schimmelpfennig C,Stolzing A.Influence of murine mesenchymal stem cells on proliferation,phenotype,vitality,and cytotoxicity of murine cytokine-induced killer cells in coculture[J].PLoS One,2014,9(2): e88115.

[6]Baker J,Verneris M R,Ito M,et al.Expansion of cytolytic CD8+natural killer T cells with limited capacity for graft-versus-host disease induction due to interferon gamma production[J].Blood,2001,97(10):2923-2931.

[7]Zhu X L,Lin Z B.Effects of Ganoderma lucidum polysaccharides on proliferation and cytotoxicity of cytokine-induced killer cells[J].Acta Pharmacol Sin, 2005,26(9):1130-1137.

[8]Guo Y,Han W.Cytokine-induced killer(CIK)cells: from basic research to clinical translation[J].Chin J Cancer,2015,34(3):99-107.

[9]Zou Y,Li F,Hou W,et al.Manipulating the expression of chemokine receptors enhances delivery and activity of cytokine-induced killer cells[J].Br J Cancer, 2014,110(8):1992-1999.

[10]Wang Y,Bo J,Dai H R,et al.CIK cells from recurrent or refractory AML patients can be efficiently expanded in vitro and used for reduction of leukemic blasts in vivo[J].Exp Hematol,2013,41(3):241-252.

[11]Wang W,Meng M,Zhang Y,et al.Global transcriptome-wide analysis of CIK cells identify distinct roles of IL-2 and IL-15 in acquisition of cytotoxic capacity against tumor[J].BMC Med Genomics,2014,7:49.

[12]Eliopoulos A G,Davies C,Knox P G,et al.CD40 induces apoptosis in carcinoma cells through activation of cytotoxic ligands of the tumor necrosis factor superfamily[J].Mol Cell Biol,2000,20(15):5503-5515.

Effects of Different Inoculation Density on the Proliferation,Differentiation and Anti-Tumor Capability of CIK Cells in C57BL/6 M ice

LI Guang-Zong1,ZENG Xi-Huan2,LIU Ying-Fu3,HUO Jing-Rui3, YU Shuo1,ZHANG Yi2,HOU Shi-Ke1,CHEN Xiao-Yi3,CHEN Feng1*

1.Institute of Rrescue Medicine,Affiliated Hospital,Logistics University of Chinese People's Armed Police Forces, Tianjin 300162;2.Jinzhou Medical University,Jinzhou 121001;3.Department of Cell Biology,Logistics University of Chinese People's Armed Police Forces,Tianjin 300309;China

*Corresponding author,E-mail:chenfeng_tj@126.com

Objective:To investigate the effects of different inoculation densities on proliferation,differentiation and anti-tumor capability of cytokine-induced killer（CIK）cells in C57BL/6 mice,and to further optimize CIK cells culture method.Methods:The cells were cultured in the density of 1×106/mL（group A）,4×106/mL（group B）,8×106/mL（group C）and 12×106/mL（group D）,and after 14 days,the cells were harvested and analyzed by microscope,flow cytometry and CCK-8 for cell proliferation,differentiation and anti-tumor capability.Results:The cell morphology and proliferation ability of group C were superior to those of group A and B.Whencells were har-vested and detected on 14 d,the percentage of CD3+/NK1.1+cells in C group was significantly higher than the proportion of group A and B,anti-tumor capability was better than that of group A and B.Cell density of group D cell density was too large,in the 7 d cells into the rapid proliferation phase,the cells appear large area of death.Conclusion:It is appropriate to increase the inoculation density of CIK cells in C57BL/6 mice,which is beneficial to the proliferation,differentiation and anti-tumor capability of C57BL/6 mice,and the inoculation density of 8×106/mL is more appropriate

cytokine-induced killer cells;density;cell culture;proliferation;anti-tumor capability

Q25

A

1009-0002（2017）03-0342-05

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.020

2016-11-23

天津市科技計劃（14ZCDZSY00033）；全軍重點實驗室開放基金（JY1402）；武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院科研平臺開放基金（WYFKFM201602，WYKFZ201603）

李光宗（1990-），男，碩士研究生，（E-mail）384018843@qq.com

陳鋒，（E-mail）lchenfeng_tj@126.com