李靜，徐建余，寧年智，劉傳杰，黃潔，劉雪超，李濤，王慧

1.華北理工大學，河北 唐山 063009；

2.軍事醫(yī)學科學院 微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071

TEM-1型β內(nèi)酰胺酶的原核表達純化及活性驗證

李靜1，徐建余1，寧年智2，劉傳杰2，黃潔2，劉雪超2，李濤2，王慧2

1.華北理工大學，河北 唐山 063009；

2.軍事醫(yī)學科學院 微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071

目的：產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶是大腸桿菌、肺炎克雷伯菌等對β內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的主要機制之一，該酶能水解青霉素、頭孢菌素、碳青酶烯類等多種抗生素，其中TEM型是發(fā)現(xiàn)最早且種類最多的β內(nèi)酰胺酶。探討TEM-1型β內(nèi)酰胺酶原核表達載體的構(gòu)建、酶的純化及活性驗證。方法：利用PCR技術(shù)，以大腸桿菌全基因組為模板釣取TEM-1基因，構(gòu)建pET22b（+）-TEM-1表達質(zhì)粒，經(jīng)測序鑒定后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌Transetta（DE3），IPTG誘導表達、親和純化，并通過抗生素水解實驗驗證其酶活性。結(jié)果：構(gòu)建了可溶性表達TEM-1的工程菌，通過親和純化最終獲得純度達90%以上的TEM-1型β內(nèi)酰胺酶，該酶可水解氨芐西林。結(jié)論：獲得了對氨芐西林具有水解活性的TEM-1型β內(nèi)酰胺酶，并對其進行了酶動力學參數(shù)檢測，驗證其抗生素水解特性，有利于對臨床抗生素的合理應(yīng)用做出指導。

TEM-1；β內(nèi)酰胺酶；表達；純化；酶動力學

自從1965年英國首次報道至今，已發(fā)現(xiàn)900余種β內(nèi)酰胺酶[1]，其中TEM型是發(fā)現(xiàn)最早且種類最多的，在世界范圍內(nèi)廣泛流行，國內(nèi)的檢出率亦較高。產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶是大腸桿菌、肺炎克雷伯菌等對β內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥的主要機制之一[2]，該酶能水解青霉素、頭孢菌素、碳青酶烯類等多種抗生素。同時，產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶的細菌常常還帶有氨基苷類、喹諾酮類等抗菌藥物的多重耐藥基因[3]，增加了臨床用藥和抗感染治療的難度。β內(nèi)酰胺酶的表達純化，是研究抗生素最小抑菌濃度、了解其耐藥規(guī)律的基礎(chǔ)，有利于指導臨床抗生素的合理應(yīng)用。在本研究中，我們對TEM-1型β內(nèi)酰胺酶進行了原核表達、純化及活性驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌為臨床分離菌株；pET-22b（+）質(zhì)粒購自Novagen公司；NdeⅠ、XhoⅠ限制性核酸內(nèi)切酶購自 New England Biolab公司；大腸桿菌Trans5α、Transetta（DE3），質(zhì)粒pEASY-T1，高保真TaqDNA聚合酶，T4DNA連接酶，Trans2K DNA ladder，Protein RulerⅠ（12～80 kD）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；PCR引物由北京天一輝遠公司合成。

1.2 TEM-1的基因克隆與鑒定

根據(jù)GenBank中TEM-1序列設(shè)計引物P1（5'-CATATGCACCCAGAAACGCTGGTG-3'）、P2（5'-C TCGAGCCAATGCTTAATCAGTGA-3'），引入的酶切位點為NdeⅠ、XhoⅠ（分別為P1、P2的下劃線部分）。以臨床分離的經(jīng)VITEK 2 GN鑒定的大腸桿菌為模板，PCR擴增獲得目的基因TEM-1。50μL PCR體系擴增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸1 min，35次循環(huán)；72℃終延伸10 min。

1.3 pET-22b（+）-TEM-1表達質(zhì)粒的構(gòu)建與誘導表達

利用NdeⅠ和XhoⅠ分別雙酶切鑒定正確的TEM-pEASY-T1 Trans5α克隆菌，抽提質(zhì)粒和表達載體pET-22b（+），在T4DNA連接酶的作用下進行連接，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌Trans5α感受態(tài)細胞，經(jīng)藍白斑實驗初步篩選后，挑取白色陽性菌株進行PCR鑒定及酶切鑒定，產(chǎn)物送北京天一輝遠公司進行測序鑒定。

挑取PCR、酶切和測序鑒定均正確的陽性菌落擴大培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒pET-22b（+）-TEM-1轉(zhuǎn)入大腸桿菌Transetta（DE3）感受態(tài)細胞，經(jīng)PCR鑒定后，將陽性菌株接種至含有氨芐西林的新鮮LB培養(yǎng)基中（氨芐西林終濃度為0.1 mmol/L），37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至D600nm為0.6，取部分菌液作為未誘導對照后，加入IPTG（終濃度為0.1 mmol/ L），18℃、150 r/min振蕩過夜誘導表達（實驗摸索的最適表達條件）。

4℃、5000 r/min離心菌液20 min，棄上清，用蒸餾水洗滌菌體后，用A液（Na3PO47.6 g，NaCl 29.2 g，咪唑 4.08 g，溶于800 mL蒸餾水，用HCl滴定pH值至6.5，定容至1 L）重懸菌體，超聲波破碎（工作2 s、間隔5 s，循環(huán)99次）至清亮，離心收集上清。

1.4 TEM-1蛋白的純化

采用親和層析方法。將帶有組氨酸標簽的TEM-1蛋白用鎳柱吸附后，用含高濃度咪唑的B液（Na3PO47.6 g，NaCl 29.2 g，咪唑 27.2 g，溶于800 mL蒸餾水，用HCl滴定pH值至7.4,定容至1 L）洗脫，將吸附于鎳柱上的TEM-1洗脫下來。

1.5 TEM-1蛋白的透析濃縮

公路橋梁建設(shè)過程中，設(shè)計方案、工程計量、設(shè)計變更等都是其施工檔案的重要組成部分。確保這些基礎(chǔ)資料的充分、完善，能夠為具體養(yǎng)護的實施提供有效的指導。在檔案完善中，實現(xiàn)檔案內(nèi)容的精確性和完善性保證是其管理的內(nèi)容在要求，工程管理人員只有注重這些材料的規(guī)范，并以其為指導，進行養(yǎng)護工作的有效開展，才能確保工程養(yǎng)護質(zhì)量的有效提升。

純化的蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測純度，剔除含有較多雜蛋白和蛋白含量較少的管，其余各管合并，加入100倍樣本體積的PBS，于4℃進行透析（透析袋前處理：透析袋放入蒸餾水中，沸水煮5～10 min，煮3次），12 h換一次PBS，共計3次。

1.6 TEM-1蛋白的活性驗證

根據(jù)TEM-1的酶特性，用0.01 mmol/L、pH7.2的PBS配置0.25 mmol/L氨芐西林溶液，以終濃度為70 ng/mL的TEM-1溶液在37℃下進行氨芐西林水解實驗（實驗摸索的最佳反應(yīng)條件），用Gen5軟件測定D229nm值（本實驗室儀器測定的最大吸收波長）隨時間的變化，并計算其酶動力學參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 TEM-1基因的調(diào)取、擴增

釣取基因PCR擴增后，以1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在約792 bp處有單一條帶，與設(shè)計的目的條帶一致（圖1）。

2.2 TEM-1基因連接pEASY-T1克隆載體后的酶切鑒定

將TEM-1-pEASY-T1酶切后，以1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，在約792 bp處有單一條帶，與目的片段大小相符（圖2）。

2.3 構(gòu)建TEM-1-pET-22b表達質(zhì)粒并鑒定

圖1 釣取TEM-1基因的瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 TEM-1-pEASY-T1酶切鑒定

挑取TEM-1-pET22b Trans5α單克隆，經(jīng)PCR擴增后行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，可見在792 bp處有單一條帶，與目的片段大小相符（圖3）。TEM-1連接pET22b后的測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫對比，一致性為100%。

2.4 將測序正確的TEM-1-pET-22b轉(zhuǎn)入表達菌Transetta（DE3）中IPTG誘導前后SDS-PAGE對照

15%的SDS-PAGE檢測表達菌誘導前后的表達情況，蛋白相對分子質(zhì)量約為31×103（圖4）。

2.5 目的蛋白TEM-1的純化

12%的SDS-PAGE檢測親和純化洗脫后的各管蛋白，結(jié)果如圖5。

2.6 酶活性驗證

圖3 目的基因連接表達載體后PCR鑒定

圖4 IPTG誘導前后克隆的表達情況

圖5 目的蛋白TEM-1洗脫后鑒定

以氨芐西林為底物進行酶蛋白溶液最適反應(yīng)濃度篩選，選擇氨芐西林的終濃度為0.25mmol/L，TEM-1終濃度為70 ng/mL，并以此進行酶蛋白水解抗生素實驗。緩沖液為PBS（pH7.2），37℃檢測10 min，結(jié)果如圖6，TEM-1對氨芐西林呈現(xiàn)較強的催化活性，其催化常數(shù)Kcat為2.12。

圖6 TEM-1對氨芐西林的水解作用

3 討論

進入抗生素時代以來，在不同的抗生素選擇壓力下，細菌形成了不同的耐藥機制，以逃避抗生素的攻擊。為了控制耐藥菌的感染，人們不斷開發(fā)和使用新型抗生素，但耐藥菌的產(chǎn)生不但沒有得到預(yù)期的控制，反而出現(xiàn)愈演愈烈之勢。細菌對抗生素的耐藥機制主要包括以下幾點[4-5]：①產(chǎn)生滅活酶或鈍化酶，通過水解乙?；?、磷酸化等修飾抗生素從而使之失活，如β內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷類鈍化酶等；②作用靶位改變，使細菌逃避或減弱抗生素作用，如喹諾酮類靶位基因突變；③細菌主動外排機制，加強了細菌在抗生素壓力下的生存能力；④細菌膜通透性改變，影響細菌對抗生素的敏感性；⑤細菌生物被膜的形成。這些適應(yīng)當前環(huán)境的有利突變在抗生素的壓力下被選擇出來，并經(jīng)過各種方式傳播。分析這些突變，對耐藥基因的分子進化、流行病學及耐藥機制等研究都具有重要意義。

自1965年TEM-1在英國被報道以后[1]，在世界范圍內(nèi)陸續(xù)出現(xiàn)了許多關(guān)于TEM-1的流行病學及其亞型的報道。目前，由TEM-1編碼基因突變而來的超廣譜β內(nèi)酰胺酶（extended spectrum β-lactamases，ESBL）已達155種以上。TEM型β內(nèi)酰胺酶是革蘭陰性菌中最常見的β內(nèi)酰胺酶[6]，在國內(nèi)外普遍存在。因此，研究其導致的各種突變等對其本身耐藥機制的改變具有重要意義。

TEM型β內(nèi)酰胺酶是由廣譜酶TEM-1和TEM-2的編碼基因發(fā)生突變造成若干氨基酸改變而形成的一系列酶，活性部位均為絲氨酸殘基。TEM-2型是TEM-1的第1個衍生物，區(qū)別在于4094位置上堿基A突變?yōu)镃，兩者的生化特性幾乎完全相同。目前發(fā)現(xiàn)的TEM酶至少有183種（http://www.lahey.org/studies/temtable.asp），其中 90余種明確具有超廣譜酶活性，均為TEM-1或TEM-2的衍生物，其突變位點主要集中在104位谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼帷?64位精氨酸突變?yōu)榻z氨酸或組氨酸、238和240位谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼?。突變可以同時發(fā)生在1～5個位點，使酶的等電點升高，同時發(fā)生構(gòu)象改變，從而擴大了原有底物譜，提高了其對三代頭孢菌素類抗生素的親和力，使其能水解頭孢噻肟、頭孢他啶等三代頭孢菌素類及單環(huán)類抗生素[7-11]。在TEM-1高表達聯(lián)合膜孔蛋白缺失時，亦可引起對酶抑制劑（如頭孢哌酮/舒巴坦）耐藥。鑒于TEM型ESBL的許多亞型都是由TEM-1突變而來，因此對TEM-1蛋白的研究較為深入[12-14]。我們將TEM-1基因克隆到原核表達載體，為下一步通過定點突變研究β內(nèi)酰胺酶水解頭孢菌素藥物的關(guān)鍵位點，以及探索應(yīng)用反義核酸、核酶等技術(shù)干擾耐藥基因表達，逆轉(zhuǎn)細菌對第三代頭孢菌素的耐藥性等研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

TEM-1為質(zhì)粒介導的耐藥基因，極易在細菌間傳播，引起醫(yī)院感染的暴發(fā)流行，甚至水平播散至腸桿菌科以外的細菌而導致耐藥，給臨床抗感染治療帶來嚴峻挑戰(zhàn)。TEM-1型ESBL為胞內(nèi)酶且表達有限，目前TEM-1型β內(nèi)酰胺酶的原核表達方式基本都是包涵體表達，本研究實現(xiàn)了其可溶性表達，且純化效果較好，活性實驗證明純化后的蛋白具有較高活性，可很好地用于后續(xù)對于抗生素及抑制劑的篩選等，指導臨床合理用藥，在青霉素酶的應(yīng)用上，如青霉素過敏的治療，替代辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶在酶聯(lián)反應(yīng)上的應(yīng)用等都有一定的價值[15]。

[1]Datta N,Kontomichalou P.Penicillinase synthesis con-trolled by infectious R factors in Enterobacteriaceae [J].Nature,1965,208(208):239-241.

[2]Crowder M W,Spencer J,Vila A J.Metallo-beta-lactamases:novel weaponry for antibiotic resistance in bacteria[J].Acc Chem Res,2006,39(10):721-728.

[3]陳淑貞,石蓉林,姚芬,等.肺炎克雷伯菌產(chǎn)ESBLs基因型分析[J].中國感染與化療雜志,2006,6(4):236-239.

[4]夏永祥,陳杰.細菌耐藥性分子機制的研究進展[J].中國實驗診斷學,2010,11:1866-1869.

[5]呂吉云,曲芬.多重耐藥微生物及防治對策[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,2011.

[6]Bradford P A.Extended-spectrum beta-lactamases in the 21st century:characterization,epidemiology,and detection of this important resistance threat[J].Clin Microbiol Rev,2001,14(4):933-951.

[7]李虹玲,劉文恩.SHV型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的研究進展[J].實用預(yù)防醫(yī)學,2007,14(1):253-255.

[8]Poirel L,Mammeri H,Nordmann P.TEM-121,a novel complex mutant of TEM-type beta-lactamase from Enterobacter aerogenes[J].Antimicrob Agents Chemother,2004,48(12):4528-4531.

[9]Schenk M F,Witte S,Salverda M L,et al.Role of pleiotropy during adaptation of TEM-1 β-lactamase to two novel antibiotics[J].Evol Appl,2015,8(3):248-260.

[10]Dellus-Gur E,Elias M,Caselli E,et al.Negative epistasis and evolvability in TEM-1 β-lactamase--The thin line between an enzyme's conformational freedom and disorder[J].J Mol Biol,2015,427(14):2396-2409.

[11]S?ndergaard A,N?rskov-Lauritsen N.Contribution of PBP3 substitutions and TEM-1,TEM-15,and ROB-1 beta-lactamases to cefotaxime resistance in Haemophilus influenzae and Haemophilus parainfluenzae [J].Microb Drug Resist,2016,22(4):247-252.

[12]Bratulic S,Gerber F,Wagner A.Mistranslation drives the evolution of robustness in TEM-1β-lactamase[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2015,112(41):12758-12763.

[13]Stiffler M A,Hekstra D R,Ranganathan R.Evolvability as a function of purifying selection in TEM-1βlactamase[J].Cell,2015,160(5):882-892.

[14]Figliuzzi M,Jacquier H,Schug A,et al.Coevolutionary landscape inference and the context-dependence of mutations in beta-lactamase TEM-1[J].Mol Biol Evol,2016,33(1):268-280.

[15]Yolken R H,Wee S B,van Regenmortel M.The use of beta-lactamase in enzyme immunoassays for detection of microbial antigens[J].J Immunol Methods, 1984,73(1):109-123.

Prokaryotic Expression,Purification and Biological Activity ofβ-Lactamase TEM-1

LI Jing1,XU Jian-Yu1,NING Nian-Zhi2,LIU Chuan-Jie2, HUANG Jie2,LIU Xue-Chao2,LI Tao2*,WANG Hui2*

1.North China University of Science and Technology,Tangshan 063009;2.State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity,Institute of Microbiology and Epidemiology,Beijing 100071;China

*Co-corresponding authors,WANG Hui,E-mail:geno0109@vip.sina.com;LI Tao,E-mail:litaobmi@126.com

Objective:The production of hydrolytic enzymeβ-lactamase is one of the most important mechanisms ofEscherichia coliandKlebsiella pneumoniaeto resistβ-lactam antibiotics.TEM is the first reportedβ-lactamase and has most varieties of subtypes.Our study aim at the construction of TEM-1 prokaryotic expression vector,the purification and the biological activity measurement of this enzyme.Methods:By using microbiological technology,we amplified TEM-1 gene from a clinicalE.colistrain and constructed the expression plasmid pET22b（+）-TEM-1.The expression vector was confirmed by sequencing and was then transformed intoE.coliTransetta（DE3）strain.The recombinant TEM-1 expressed by induction of IPTG,and then the product was purified.We investigated the activity of this enzyme by performing antibiotic hydrolyzing experiment.Results:TEM-1 was expressed in prokaryotic expression system.After purification,the purity of the target protein is up to 90%and the protein could hydrolyze ampicillin efficiently.Conclusion:We obtained the TEM-1 protein withe the verified ability of hydrolyzing ampicillin,and calculated its hydrolysis dynamical parameter.Studies about the characteristics ofTEM-1 enzyme will contribute to the reasonable use of clinical antibiotics.

TEM-1;β-lactamase;expression;purification;enzyme kinetics

Q78

A

1009-0002（2017）03-0319-05

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.015

2016-12-12

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（2015CB554202）

李靜（1984-），女，碩士研究生，主管檢驗師，（E-mail）lijing_lab@163.com

王慧，（E-mail）geno0109@vip.sina.com；李濤，（E-mail）litaobmi@126.com