常敏惠，王蘭，張左兵

山西大學 生命科學學院，山西 太原 030006

斑馬魚ID1啟動子體內(nèi)外活性分析

常敏惠，王蘭，張左兵

山西大學 生命科學學院，山西 太原 030006

目的：分析斑馬魚分化抑制因子1（ID1）啟動子在體內(nèi)、外的活性情況，為研究ID1基因表達調(diào)控奠定基礎。方法：通過構(gòu)建斑馬魚ID1啟動子不同長度螢光素酶報告質(zhì)粒，分別以鯉魚上皮瘤細胞（EPC）和斑馬魚胚胎為材料進行體外轉(zhuǎn)染和體內(nèi)注射，并采用雙螢光素酶報告系統(tǒng)對不同長度ID1啟動子活性進行評估。結(jié)果：在體內(nèi)、外實驗中，不同長度ID1啟動子活性均表現(xiàn)出隨啟動子長度變化而變化的情況；啟動子活性變化趨勢在體內(nèi)和體外并不一致，呈現(xiàn)出較大差異性。結(jié)論：ID1啟動子活性隨長度變化而表現(xiàn)不同，說明啟動子上存在許多順式調(diào)控元件，且體內(nèi)、外ID1活性變化可能受多種因素的影響，提示不同細胞中的調(diào)控機制有所不同。

斑馬魚；分化抑制因子1（ID1）；啟動子；雙螢光素酶報告系統(tǒng)

分化抑制因子（inhibitor of differentiation protein，ID）也稱作DNA結(jié)合抑制因子，是螺旋-環(huán)-螺旋（helix-loop-helix，HLH）轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族成員，缺少與DNA結(jié)合所必需的堿性氨基酸序列，可通過與堿性HLH（bHLH）分子形成異二聚體，對bHLH轉(zhuǎn)錄因子起負調(diào)節(jié)作用[1]。ID家族蛋白參與生物體多種發(fā)育過程，并具有促進細胞周期進程，抑制細胞分化、凋亡，誘導細胞增殖，參與腫瘤性血管新生、腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等重要作用，具有癌基因?qū)傩訹2]。截至目前，哺乳動物已知的ID蛋白有ID1、ID2、ID3和ID4，近年來以ID1的研究最多。研究表明，ID1在20多種人類腫瘤中均過量表達，且ID1上調(diào)程度與腫瘤惡化程度及病情復雜性相關(guān)[3-5]。部分與ID1相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子功能及其所結(jié)合ID1啟動子上特異的順式作用元件相繼被發(fā)現(xiàn)。Benezra等發(fā)現(xiàn)，在血清刺激下，Egr-1可與其他蛋白形成復合體，并結(jié)合于ID1基因上游-1.5 kb處，促進ID1表達上調(diào)[6]；Birkebkamp等則發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO3a可以結(jié)合于ID1啟動子，抑制ID1的表達[7]。這些實驗均是在小鼠或人體細胞等哺乳動物細胞中完成的，在其他物種的細胞及整體體內(nèi)活性尚未見報道。斑馬魚（Danio rerio）作為脊椎動物模式物種，具有體型小、子代數(shù)量多、飼養(yǎng)成本低等優(yōu)勢，因為與人類基因具有高度的同源性，被廣泛應用于構(gòu)建人類疾病模型及相關(guān)藥物篩選等研究[8-9]。本研究以斑馬魚為材料，通過構(gòu)建ID1啟動子不同長度的報告質(zhì)粒，并利用雙螢光素酶報告系統(tǒng)對導入EPC細胞及斑馬魚胚胎的ID1啟動子的活性進行檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

鯉魚上皮瘤細胞（endothelial progenitor cells，EPC）由中國科學院水生生物研究所惠贈；M199培養(yǎng)基（Hyclone公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；KOD-plus-neo（ToYoBo公司）；DL5000 DNA marker、LATaq酶（TaKaRa公司）；動物組織基因組提取試劑盒（康為世紀公司）；E.Z.N.A.Endofree Plasmid Mini Kit、E.Z.N.A.Gel Extraction Kit（Omega公司）；Trans5αChemically Competent Cell（全式金公司）；Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega公司）；lipo2000（Invitrogen公司）；PLI-100 Pico-Injector（Harvard公司）；PC-10 Puller（Narishige公司）。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建

取野生型性成熟斑馬魚3～5條，剪取少量腹鰭或尾鰭，用試劑盒提取基因組DNA，以此為模板，通過巢式PCR擴增得到ID1啟動子序列（2818 bp）。反應體系：10×LATaq酶緩沖液Ⅱ5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）8μL、LATaq酶0.5μL、10μmol/L引物0.25μL，用去離子水補充至50 μL。PCR反應程序：94℃預變性1 min；98℃變性10 s，65℃退火30 s，72℃延伸3 min，35個循環(huán)；72℃終延伸10 min；16℃保溫。以第一輪PCR產(chǎn)物的1/100稀釋燁為模板進行第二輪PCR，反應體系及程序同前。PCR產(chǎn)物凝膠電泳后與空載體pGL3同時用KpnⅠ/XhoⅠ于37℃雙酶切過夜，4℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，培養(yǎng)12 h后挑取陽性單克隆進行菌液PCR及測序驗證，用去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，以此質(zhì)粒為模板，將ID1啟動子序列從上游依次截短300 bp構(gòu)建其余質(zhì)粒。

1.3 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

EPC于含10%胎牛血清及1%雙抗（青霉素/鏈霉素）的M199培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25℃、恒溫、恒濕、5%CO2。以1×105～1.5×105/孔的密度鋪布在24孔板中，靜置過夜，待細胞長至70%～80%時進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時,每孔加入0.1μg啟動子質(zhì)粒、0.02μg pRL-TK、0.36μL lipo2000。先將質(zhì)粒和lipo2000分別加入50μL無血清的M199培養(yǎng)基中，混勻后室溫靜置5 min，再將2份培養(yǎng)基混合，室溫靜置20 min，以每孔100μL加入細胞培養(yǎng)板，前后混勻，25℃培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)染24 h后吸凈混合液，每孔加入100 μL 1×PLB裂解液，15 min后將細胞裂解液置于冰上，用于后續(xù)雙螢光素酶活性檢測。

1.4 雙螢光素酶報告系統(tǒng)檢測

對螢光素酶的活性檢測，依據(jù)Promega公司Dual-Luciferase Reporter細胞培養(yǎng)板中的混合液，加入100μL細胞裂解液（1×PLB），室溫裂解15 min，將裂解液∶LARⅡ∶Stop＆Glo按1∶5∶5的比例加入試劑檢測讀數(shù)，設置參數(shù)（reading time：10 s，delay time：2 s，speed：3 s），記錄Firefly Luc/ Renilla Luc比值，以空載體pGL3 basic和pRL-TK共轉(zhuǎn)染檢測值作為對照。所得數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 6軟件進行統(tǒng)計學分析。

1.5 胚胎顯微注射

AB系親魚以雌雄1∶1的比例放入配魚專用缸（每缸4尾），雌雄魚用隔板隔開，次日光周期開始后抽開隔板，待產(chǎn)卵后將卵收集洗凈，在1～2細胞期將外源質(zhì)粒（30 ng/μL）1～2 nL注入胚胎動物極，加入適量養(yǎng)魚水培養(yǎng)至發(fā)育72 h，取4～6個重復（10條/重復）勻漿裂解，檢測螢光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒構(gòu)建

從斑馬魚基因組DNA中擴增到ID1啟動子序列，經(jīng)KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切后插入pGL3-basic質(zhì)粒，構(gòu)建螢光素酶報告質(zhì)粒，測序長度為2818 bp，將此質(zhì)粒命名為ID1pro-2.8k。以ID1pro-2.8k質(zhì)粒為基礎，用同樣方法構(gòu)建其余截短質(zhì)粒（所用引物見表1）ID1pro-2.5k（2523 bp）、ID1pro-2.3k（2280 bp）、ID1pro-2.0k（1947 bp）、ID1pro-1.7k（1670 bp）、ID1pro-1.4k（1399 bp）、ID1pro-1.2k（1104 bp）、ID1pro-0.9k（867 bp）和ID1pro-0.7k（590 bp）。見圖1、2。

2.2 不同長度啟動子在EPC中的活性

表1 擴增ID1啟動子片段所用引物

圖1 構(gòu)建入pGL3.0的ID1啟動子片段截短的示意圖

不同長度ID1啟動子報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EPC 24 h后裂解細胞，檢測螢光素酶基因的表達量（n= 6），經(jīng)SPSS 13.0軟件分析，所有啟動子組表達量相比于對照pGL3-basic組均有顯著升高，依次分別約為對照組的244倍、178倍、225倍、417倍、158倍、184倍、263倍、114倍、76倍和18倍（圖3）。在ID1pro-2.0k處螢光素酶基因的表達量最高，ID1pro-1.2k次之，之后啟動子活性伴隨長度縮短而降低，整體呈現(xiàn)一個“M”形變化趨勢。

2.3 不同長度啟動子在斑馬魚體內(nèi)的活性

將各ID1啟動子質(zhì)粒顯微注射入斑馬魚1～2細胞期胚胎，待魚體發(fā)育至72 h，取10條/重復（n=3），勻漿，檢測螢光素酶活性，經(jīng)SPSS 13.0分析，ID1pro-2.8k組表達量相比于其他組均有顯著性升高。從趨勢上看，除ID1pro-2.8k組之外，表達量較高的2組分別為ID1pro-2.3k和ID1pro-1.4k，與體外實驗比較發(fā)生了左方向偏移（圖4）。

3 討論

圖2 含ID1啟動子質(zhì)粒的雙酶切鑒定

圖3 不同長度ID1啟動子在EPC中的活性變化

圖4 不同長度ID1啟動子在斑馬魚體內(nèi)活性變化

ID1是HLH蛋白家族V型亞家族中的一員，此亞家族在哺乳動物有ID1～ID4等4個蛋白成員，以ID1的研究最多，它們對一些生物發(fā)育進程常常會起負調(diào)節(jié)作用，如細胞的分化、衰老、凋亡，神經(jīng)的形成，血管生成等[10-17]。ID蛋白家族缺乏堿性DNA結(jié)合區(qū)，通過高度保守的HLH結(jié)構(gòu)域與bHLH蛋白形成異二聚體，從而抑制一些bHLH轉(zhuǎn)錄因子的功能。目前已知的有肌源性調(diào)節(jié)因子（MyoD、Myf5、MRF4/Myf6）、E蛋白（E12、E47、E2-2、TCF12）[18-22]。此外，還有一些非HLH蛋白，如Ets2、MIDA1。

ID1是癌癥研究中的明星分子，很多癌癥的發(fā)生與進程均有ID1參與。啟動子作為決定基因活動的開關(guān)而備受關(guān)注。許多研究證實，在一些癌癥相關(guān)的信號通路中，特殊的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合于ID1啟動子上的順式元件作用位點，從而啟動或抑制ID1表達[23-25]。斑馬魚是一個很好的用于研究這些作用的物種。我們通過逐步截短斑馬魚ID1啟動子片段，構(gòu)建了9個具有5'端不等、3'端平齊的啟動子的雙螢光素酶報告基因重組質(zhì)粒，通過體內(nèi)、外實驗檢測了ID1啟動子活性，所構(gòu)建的質(zhì)粒均包含ID1啟動子活性區(qū)，定位了ID1啟動子關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控位置為-1.2k～-2.0k（～800 bp）處，并且還發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)、外實驗中，ID1啟動子活性呈現(xiàn)出不同的變化趨勢和規(guī)律，提示ID1啟動子活性所受調(diào)控的機制比較復雜，不同細胞間可能存在差異。Kang等[6]在研究TGFβ調(diào)節(jié)ID1基因的表達時發(fā)現(xiàn)，TGFβ對人ID1基因表達的影響在不同細胞中隨刺激時間的變化而出現(xiàn)促進和抑制的雙向效應；Liang等[26]則進一步發(fā)現(xiàn)，這種雙向調(diào)節(jié)效應取決于TGFβ所引起的ID1啟動子上組蛋白的乙?；潭?。這2項研究說明，ID1啟動子活性除了受到特定的反式作用因子調(diào)節(jié)外，還可能受到一些轉(zhuǎn)錄后修飾作用的影響；斑馬魚胚胎顯微注射為在體內(nèi)分析啟動子活性提供了可能性，且內(nèi)參質(zhì)粒極大地避免了注射量不同帶來的組內(nèi)個體差異。但是，由于外源質(zhì)粒只能短暫表達，因此此法只能檢測一些短期作用因子的變化[27]。此外，斑馬魚在胚胎發(fā)育過程中基因表達的時空差異性及相互作用也可能導致ID1啟動子活性發(fā)生變化。具體的調(diào)控機制、重要的順式作用元件還有待于進一步研究。

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Avtivity Analysis of Zebrafish ID1 Promoter Through In Vitro and In Vivo Study

CHANG Min-Hui,WANG Lan*,ZHANG Zuo-Bing*

School of Life Sciences,Shanxi University,Taiyuan 030006,China

*Co-corresponding authors,WANG Lan,E-mail:lanwang@sxu.edu.cn;ZHANG Zuo-Bing,E-mail:zbzhang@sxu.edu.cn

Objective:To explore the biological activity of zebrafish ID1（inhibitor of differentiation/DNA binding protein 1）promoter throughin vitroandin vivostudy,and to provide basis for expression regulation study for ID1 gene.Methods:A set of zebrafish ID1 promoter with different length were amplified from genomic DNA and inserted to luciferase vector pGL3-basic,and subsequently were transfected into endothelial progenitor cells（EPC）and microinected into zebrafish embyo at 1～2 cell stage.The promoter activity was determined with the dual-luciferase reporter system assay.Results:The ID1 promoter activity varied as the length change,and thein vivoandin vtrostudies presented great different paterns.Conclusion:The different promoter activity betweenin vitroandin vivostudy indicate that there are a lot of cis-acting element located at the ID1 promoter,and the regulatory mechanism of ID1 promoter are different in different types of cells.

zebrafish;ID1（inhibitor of differentiation/DNA binding protein 1）;promoter;dual-luciferase reporter

Q78

A

1009-0002（2017）03-0308-05

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.013

2016-12-22

國家自然科學基金（31672293）；高等學校博導類基金（20111401110010）；山西省特色學科重點項目（2011-SXDX-SWX-003）；山西省留學基金（2014-013）；山西省高等學校優(yōu)秀青年學術(shù)帶頭人支持計劃

常敏惠（1990-），女，碩士研究生，（E-mail）1085972754@qq.com

王蘭，（E-mail）lanwang@sxu.edu.cn；張左兵，（E-mail）zbzhang@sxu.edu.cn