劉洋，王蘭，孫敏

山西大學 生命科學學院，山西 太原 030006

慢性鎘暴露對斑馬魚卵巢組織的氧化損傷和子代發(fā)育的母源影響

劉洋，王蘭，孫敏

山西大學 生命科學學院，山西 太原 030006

目的：采用半靜態(tài)毒性實驗方法，研究慢性鎘暴露對性成熟斑馬魚卵巢組織抗氧化酶活性、脂質(zhì)過氧化水平的影響及其母源傳遞毒性效應。方法：依據(jù)前期測定的96 hLC50，參考國家漁業(yè)標準，設置5個鎘處理組（0.058、0.116、0.232、0.580、1.160 mg/L）和1個對照組，鎘暴露21 d后，對卵巢組織超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）活性及脂質(zhì)過氧化物丙二醛（MDA）含量進行測定，并對其受精率、F1代胚胎孵化率及96 hpf幼魚體長進行統(tǒng)計分析。結(jié)果：不同濃度鎘暴露均導致卵巢組織SOD、CAT和GPx活性顯著降低、MDA含量顯著升高并呈濃度依賴效應。子代母源毒性分析顯示，與對照組相比，0.232和0.580 mg/L濃度組受精率均顯著下降，0.232 mg/L濃度組F1代胚胎孵化率顯著降低；各濃度組受精后96 h幼魚體長與對照組相比有顯著性差異，且隨著鎘濃度的增加體長顯著變短。結(jié)論：慢性鎘暴露導致斑馬魚卵巢組織抗氧化酶活性受到顯著抑制，對組織和細胞造成嚴重氧化損傷，并通過母源傳遞導致子代發(fā)育的毒性效應。

斑馬魚；卵巢；氧化損傷；母源毒性；鎘

工業(yè)廢水、城市污水的大量排放，導致水環(huán)境重金屬污染問題日益凸顯，使動物和人類的生存、健康受到嚴峻挑戰(zhàn)[1]。重金屬鎘（cadmium，Cd）是工業(yè)上使用廣泛、具高毒性的環(huán)境污染物之一，其半衰期長，可在生物體內(nèi)富集[2]，并可通過不同途徑和方式對生殖、消化、神經(jīng)等系統(tǒng)造成毒害，導致不同組織器官嚴重損傷[3-4]。

水生動物是水環(huán)境中的重要指示生物。對魚類而言，鎘是一種致毒快，損害重的毒物[5]。鎘毒性機制的研究表明，鎘進入機體誘導組織和細胞產(chǎn)生大量自由基和活性氧（reactive oxygen species，ROS），從而導致氧化損傷[6]。ROS水平的升高直接引發(fā)脂質(zhì)過氧化、細胞膜損傷并影響多種酶的活力，對生物體造成威脅。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）等抗氧化酶能夠清除ROS和多種自由基，在體內(nèi)抗氧化防御過程中發(fā)揮重要作用，已成為水生動物毒理學中毒性機制研究的重要指標[7]。研究發(fā)現(xiàn)，急性鎘暴露導致斑馬魚（Danio rerio）幼魚GPx活性顯著降低，丙二醛（malonyldialdehyde，MDA）含量顯著增加，造成氧化損傷[8]；Qu等[9]、Jancsó等[10]認為，鎘脅迫鯉科魚類（鯉和鯽）導致多種組織MDA含量及SOD、CAT、GPx等抗氧化酶發(fā)生變化。急、慢性鎘脅迫食蚊魚（Gambusia holbrooki）的研究表明，CAT活性的變化可作為肝臟和鰓組織氧化損傷的指標[11]。

性腺是鎘積累的重要靶器官之一[12]。近年來，鎘暴露對雄性生殖系統(tǒng)的影響多有研究，但是鎘對雌性生殖系統(tǒng)特別是母源傳遞毒性效應知之甚少。已有研究報道，重金屬鈾、鎘暴露后會對母本斑馬魚產(chǎn)生毒性效應，導致其生殖能力的改變，且會通過母本將毒性效應傳遞到子代，從而間接對子代生長和發(fā)育產(chǎn)生影響[13-14]。

已有文獻報道，急性鎘暴露導致稀有鮈鯽（Gobiocypris rarus）生精細胞排列紊亂、發(fā)育停止、精子數(shù)量減少等組織病理學變化[15]。鎘暴露導致羅非魚（Sarotherodon malenotheron）性腺分化發(fā)生紊亂[16]，引起青鳉（Oryzias latipes）、鰷魚（Pimephales promelas）及斑馬魚生精細胞紊亂、精子數(shù)量減少[17]、卵巢萎縮等損傷。急性鎘暴露（72 h）導致斑馬魚生殖能力受阻，造成子代發(fā)育延緩的毒性效應[13]，但鎘暴露導致各種毒性效應的閾值及其毒性效應機制仍待進一步研究。

目前，鎘對雌魚生殖毒性的研究主要集中在急性暴露實驗，而慢性低濃度鎘暴露更能反映環(huán)境條件下的真實狀態(tài)，慢性鎘暴露對雌魚的生殖功能及其母源傳遞的毒性效應及機制仍待探討。鑒于此，我們以模式生物斑馬魚為材料，開展慢性低濃度鎘暴露對雌性斑馬魚卵巢抗氧化系統(tǒng)的影響和子代母源毒性研究，為進一步探討慢性鎘脅迫對魚類卵巢生殖功能和母源傳遞[13]的毒性效應機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

斑馬魚水循環(huán)系統(tǒng)養(yǎng)殖達性成熟的雌性斑馬魚，光照周期為14 h光照∶10 h黑暗，溫度27.0±1℃，每天喂食2次活體豐年蟲。斑馬魚平均體重0.76±0.10 g，平均體長3.6±0.2 cm。

氯化鎘（CdCl2·2.5H2O）（分析純，購自天津市博迪化工有限公司，實驗前用蒸餾水配成20000 mg/L的母液）；氯化鈉（NaCl）（分析純，購自天津市東麗區(qū)天大化學試劑廠）；SOD、CAT、GPx、MDA含量和蛋白含量測定試劑盒（購自南京建成生物工程研究所）；多功能酶標儀（美國MD公司，SpectraMax M5）；冷凍離心機（德國Eppendorf公司，5804R）；電動勻漿儀（德國FLUKO公司，F(xiàn)6/ 10）；體視顯微鏡（日本SZX16+DP71+IPP）；恒溫光照培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司，MGC-450BP）。

1.2 實驗方法

根據(jù)前期鎘對斑馬魚96 hLC50為5.8 mg/L以及《漁業(yè)水質(zhì)標準》（GB11607-89）水中鎘濃度須低于0.005 mg/L的要求，設定6個濃度組：對照組、1/100 LC50組、1/50 LC50組、1/25 LC50組、1/10 LC50組和1/5 LC50組，其對應的Cd2+濃度分別為0、0.058、0.116、0.232、0.580和1.160 mg/L。每個濃度組設3個平行，每個平行組8尾魚，試驗溶液體積2 L，鎘暴露21 d，按半靜態(tài)毒性試驗法，每24 h更換1次試驗溶液，試驗期間每天喂食2次。

1.2.1 樣品制備及酶活性測定 于21 d，每組隨機選取斑馬魚并迅速取出卵巢，每2尾于1管，稱重后液氮速凍，置-80℃冰箱保存。按組織質(zhì)量∶體積1∶4加入0.75%NaCl溶液，電動勻漿器制備20%的組織勻漿液，4℃、2500 r/min離心10 min，取上清待用。采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD，鉬酸銨法測定CAT，DNTB法測定GPx，硫代巴比妥酸（TBA）法測定MDA含量，考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量。采用南京建成生物工程研究所提供的測定試劑盒，用美國MD公司SpectraMax M5酶標儀進行活力與含量的檢測。

1.2.2 繁殖試驗 鎘暴露21 d后，每組隨機選取4條雌魚轉(zhuǎn)置清水，與健康性成熟雄魚分別按雌雄1∶2的比例放入產(chǎn)卵缸（每個濃度組設3個平行），進行7 d繁殖實驗[18]。通過控制晝夜節(jié)律，使雌性斑馬魚于每日上午8:00～12:00產(chǎn)卵。每隔半小時，收集胚胎，清洗殘余物，記錄產(chǎn)卵時間并放入恒溫培養(yǎng)箱孵化，光照周期為14∶10。記錄斑馬魚受精及孵化情況，受精后96 h（96 hpf）在體式顯微鏡下拍照并測量斑馬魚幼魚體長，每個濃度選20條測量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

對實驗數(shù)據(jù)，采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），顯著性檢驗通過LSD法比較，所得結(jié)果均為x±s。P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 鎘對斑馬魚卵巢組織的氧化損傷

抗氧化酶SOD是體內(nèi)清除氧自由基的第一道防線，在抗氧化防御中發(fā)揮重要作用。不同濃度鎘暴露21 d后，斑馬魚卵巢組織SOD活性發(fā)生明顯變化。由圖1A可知，與對照組相比，各濃度組卵巢組織SOD活性隨鎘濃度的增加呈極顯著降低，0.580 mg/L鎘濃度對SOD活性影響最嚴重。

圖1 鎘暴露對斑馬魚卵巢組織SOD（A）、CAT（B）、GPx（C）活性和MDA（D）含量的影響（n=4）

由圖1B可見，鎘暴露21 d后，斑馬魚卵巢組織抗氧化酶CAT活性受到抑制。在0.058 mg/L低濃度組卵巢組織CAT活性即出現(xiàn)極顯著差異，且隨鎘濃度的升高CAT活性顯著下降。

觀察圖1C得知，不同濃度鎘暴露21 d后，斑馬魚卵巢抗氧化酶GPx活性發(fā)生顯著變化，0.058 mg/L低濃度組GPx活性受到極顯著抑制。卵巢GPx活性隨鎘濃度的增大而顯著降低，各濃度組與對照組相比均有極顯著差異。

脂質(zhì)過氧化水平的變化被認為是細胞氧化損傷機制的主要標志之一。由圖1D可見，與對照組相比，鎘暴露21 d后，斑馬魚卵巢MDA含量都顯著高于對照組，并隨鎘濃度的增加呈逐漸升高的趨勢；0.580和1.160 mg/L鎘濃度組的MDA含量達最高。

2.2 鎘暴露對斑馬魚的母源毒性效應

2.2.1 鎘對斑馬魚受精率的影響 為研究慢性鎘暴露對斑馬魚生殖能力的影響，21 d鎘暴露結(jié)束后，開展7 d繁殖實驗，并對受精率進行統(tǒng)計分析。鎘脅迫后，最高濃度組（1.160 mg/L）雌性斑馬魚出現(xiàn)不育，其他濃度組斑馬魚受精率隨鎘濃度的升高呈逐漸下降的趨勢，如圖2所示，2個低濃度組（0.058和0.116 mg/L）未出現(xiàn)顯著性變化，但0.232和0.580 mg/L濃度組與對照組相比差異極顯著。

2.2.2 鎘對斑馬魚F1代胚胎孵化率的影響 進一步對鎘暴露后斑馬魚母源毒性效應進行分析，結(jié)果表明，0.580 mg/L濃度組的F1代胚胎在24 hpf全部死亡，其他濃度組鎘暴露21 d后，F(xiàn)1代孵化率明顯下降。由圖3可見，與對照組相比，0.232 mg/L濃度組F1代孵化率出現(xiàn)顯著差異。

2.2.3 鎘對斑馬魚F1代96 hpf幼魚體長的影響

鎘脅迫21 d，各處理組F1代96 hpf幼魚體長均發(fā)生顯著變化，如圖4所示，F(xiàn)1代的體長隨鎘濃度的增加呈逐漸下降的趨勢。與對照組相比，0.058 mg/L低濃度組F1代幼魚體長出現(xiàn)極顯著差異。

3 討論

3.1 慢性鎘暴露對斑馬魚卵巢組織的氧化損傷

氧化普遍存在于生物體的新陳代謝過程中，機體通過一系列的抗氧化酶維持平衡，當受到環(huán)境污染物脅迫時，體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)和活性氧生成之間失衡，導致抗氧化防御系統(tǒng)被破壞，引起組織和細胞發(fā)生氧化損傷[19]，最終造成永久性毒害[20]。

圖2 鎘暴露對斑馬魚受精率的影響（n=20）

圖3 鎘暴露對斑馬魚子代胚胎孵化率的影響（n=20）

圖4 鎘暴露對斑馬魚子代96 hpf幼魚體長的影響（n=20）

諸多研究表明，鎘可以誘導生物體產(chǎn)生活性氧，干擾機體氧化與抗氧化之間的平衡，從而導致機體內(nèi)抗氧化酶活性和脂質(zhì)過氧化物含量發(fā)生變化[21-23]。SOD主要分布在胞漿和線粒體的基質(zhì)內(nèi)[24]，是生物體抗氧化防御系統(tǒng)中重要的抗氧化酶之一，也是清除超氧陰離子自由基O2-的專一性酶。SOD在生物體內(nèi)最先與O2-作用，將其分解為O2和H2O2[25]，保持體內(nèi)自由基代謝平衡，從而保護細胞免受損傷。鎘是SOD強有力的抑制劑[26]。文獻報道顯示，低濃度鎘（0.112 mg/L）可誘導SOD活性升高，而高濃度鎘（1.120 mg/L）抑制SOD活性[8]，可能是低濃度鎘在短時間內(nèi)引起大量積累，從而誘導機體SOD活性增強來清除，防止細胞膜系統(tǒng)過氧化作用的發(fā)生；而鎘濃度過高，可能置換出SOD中的金屬離子，導致SOD活力下降或消失。與多數(shù)急性鎘暴露對性腺組織SOD活性先誘導后抑制的影響不同[27-28]，本研究在21 d鎘暴露后，各濃度組卵巢組織SOD活性均受到極顯著抑制（圖1）。這可能與暴露時間有關，隨著暴露時間的延長，卵巢中鎘積累量增加，機體對于SOD的誘導跟不上體內(nèi)O2-增加的速度，同時隨著體內(nèi)鎘的增加，改變了SOD原有的分子構象或抑制其基因表達，導致SOD因消耗而活性降低或喪失。如果細化鎘暴露時間，可能在較短時間內(nèi)會檢測到SOD活性被誘導的時間點，但進一步結(jié)論有待后續(xù)研究。

CAT和GPx是繼SOD之后，生物體氧化防御系統(tǒng)中抵抗氧化損傷的第二道防線[28]，CAT能進一步將SOD產(chǎn)生的H2O2轉(zhuǎn)化為H2O和O2，具有保護酶的作用；GPx催化H2O2的還原反應，對由ROS誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化物及過氧化氫有極強的清除能力。文獻報道，CAT和GPx協(xié)同作用，共同清除由SOD催化超氧陰離子產(chǎn)生的H2O2，從而保護生物膜結(jié)構和生物大分子免受氧化損傷[29]。CAT活力對重金屬離子引發(fā)的氧化損傷極其敏感。本研究顯示，在低濃度（0.058 mg/L）鎘暴露下，CAT活性極顯著降低，并隨鎘濃度的升高呈顯著差異，這可能是由于鎘暴露時間較長，CAT活性受到過量活性氧的抑制，并由此改變了CAT亞單位的裝配[27]或抑制CAT分子的合成。GPx的活性中心硒代半胱氨酸可以結(jié)合Cd2+，使生物體內(nèi)Cd2+濃度降低，從而消減鎘的毒性。但是GPx與Cd2+的結(jié)合會導致Se-Cys結(jié)構遭到破壞而使GPx失去生物活性[30]。已有文獻報道，在急性鎘暴露下，7.25 mg/L鎘濃度組GPx合成途徑被激活，酶活力增強；但隨著鎘濃度的增大，鎘的累積毒性增加，原有GPx活性中心遭到嚴重破壞，同時新的GPx難以合成[26]，致使116 mg/L鎘濃度組GPx活力顯著低于對照組。在本研究慢性鎘暴露中，隨著鎘暴露時間的延長，鎘在體內(nèi)積累量增加，導致0.058 mg/L低濃度組卵巢組織GPx活性被顯著抑制，與急性高濃度鎘暴露結(jié)果相似。

MDA是脂質(zhì)過氧化反應的終產(chǎn)物，能交聯(lián)脂類、蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子，破壞膜的結(jié)構。研究顯示，MDA的含量與膜結(jié)構的損傷程度呈正相關[28]，因此，MDA含量的變化可以間接反映重金屬對機體氧化損傷的程度，常作為環(huán)境污染脅迫的標志物[27]。本研究中卵巢在鎘暴露21 d后，從0.058 mg/L的低濃度組到1.160 mg/L的高濃度組，MDA含量均極顯著升高。推測可能是由于鎘暴露時間較長，鎘在體內(nèi)緩慢而持續(xù)積累，導致抗氧化酶活性或酶結(jié)構遭到破壞甚至喪失，使得體內(nèi)自由基濃度迅速升高，造成細胞膜結(jié)構破壞而引起。

急性鎘暴露結(jié)果顯示[31]，1 mg/L鎘暴露24 h，斑馬魚卵巢SOD、CAT活性及MDA含量沒有發(fā)生顯著變化，但SOD基因的表達量顯著升高；而鎘暴露96 h，斑馬魚卵巢SOD活性及其基因表達量、MDA含量均未發(fā)生顯著變化，但CAT活性及其基因表達量顯著升高。這與本研究1.160 mg/L慢性鎘脅迫后SOD、CAT活性及MDA含量的變化明顯不同。研究表明，急、慢性鎘暴露均可引起斑馬魚卵巢抗氧化酶活性及MDA含量發(fā)生變化，但慢性鎘暴露導致斑馬魚卵巢抗氧化酶活性受到顯著抑制，有關其基因表達情況仍待探討。

3.2 慢性鎘暴露引起斑馬魚生殖毒性和母源傳遞毒性

魚類的繁殖對重金屬暴露非常敏感[32]，其受精率、孵化率是研究生殖毒理的重要指標[19]。Sellin等[33]揭示了鎘脅迫嚴重影響鰷魚的生殖能力，使其受精率顯著降低。Bourrachot等[34]認為20～250μg/L重金屬鈾暴露14 d，斑馬魚的生殖能力受到顯著影響。本研究表明，斑馬魚在不同濃度鎘暴露21 d后其受精率呈下降趨勢，并呈濃度依賴效應，0.058和0.116 mg/L濃度組受精率沒有發(fā)生顯著性變化。與此結(jié)果相似，Sellin等[35]對繁殖前的鰷魚開展21 d鎘暴露，結(jié)果顯示，同樣50μg/L鎘暴露后其排卵量和受精率等均沒有受到明顯影響。導致此類結(jié)果的原因可能是由于在繁殖前結(jié)束鎘暴露，且隨后清水中21 d的繁殖過程使得魚體內(nèi)鎘逐漸被清除，從而降低了鎘的毒性作用。

基于之前的報道[36]，本實驗進一步證明母源鎘積累通過卵巢傳遞到胚胎，導致子代胚胎孵化率顯著下降，該結(jié)果與急性（72 h）鎘及重金屬鈾暴露斑馬魚的母源毒性效應一致[13-14]。此外，鎘的母源毒性導致子代胚胎發(fā)育嚴重畸形，體長縮短，這一結(jié)果與35.6μmol/L即3.98 mg/L急性鎘暴露以及氟化物——全氟辛烷磺酸（PFOS）暴露斑馬魚胚胎的研究結(jié)果相互佐證[37-38]。這些現(xiàn)象可能是由于鎘暴露的母源毒性，導致胚胎凋亡細胞明顯增多，子代發(fā)育相關基因的表達量發(fā)生變化[39]，進而引起幼魚出現(xiàn)畸形且體型變短，其相關機制有待深入研究。

因此，我們推測可能是由于鎘暴露引起組織氧化脅迫，導致卵巢和卵母細胞結(jié)構功能受到損傷，卵巢抗氧化酶及子代發(fā)育相關基因表達量發(fā)生變化，進而造成斑馬魚卵巢生殖毒性和子代發(fā)育的母源毒性，即鎘對斑馬魚的毒性影響從卵巢傳遞到了子代。本研究為進一步探討鎘對魚類卵巢生殖功能的毒性效應及機制研究提供了科學依據(jù)。

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Oxidative Damage on Ovary of Mature Zebrafish and Maternal Toxicity Effects on Their Embryos After Chronic Cadmium Exposure

LIU Yang,WANG Lan*,SUN Min*
School of Life Science,Shanxi University,Taiyuan 030006,China

Objective:The effects of chronic cadium（Cd）exposure on the activities of antioxidant enzymes and the level of lipid peroxidation in ovaries of mature zebrafish,as well as the maternal toxicity effects on offspring were studied by using semi-static toxic test method.Methods:According to 96 hLC50values and the National Fisheries Standards of China,we set five Cd treatment groups（0.058,0.116,0.232,0.580,1.160 mg/L）and one control group without Cd.After Cd exposure for 21 d,the activities of superoxide dismutase（SOD）,catalase（CAT）and glutathione peroxidase（GPx）,and the level of malonyldialdehyde（MDA）in zebrafish ovaries were investigated. Moreover,the fertilization success rate,hatching rate and 96 hpf-body length of their offspring（F1larvae）were studied.Results:Compared with those in the control group,the activities of antioxidant enzymes SOD,CAT and GPx were decreased significantly,and the content of MDA was increased significantly in each Cd-treated groupwith a concentration-dependent manner.The fertilization success rates were reduced significantly in the 0.232 and 0.580 mg/L Cd-treated groups and the larvae hatching rate was decreased significantly in the 0.232 mg/L Cd-treated group compared with that in the control group.The body length was shorter in each Cd-treated group compared with that in the control group.Conclusion:These data indicated that the activities of antioxidant enzymes were significantly inhibited after Cd exposure for 21 d,resulting in severe oxidative damage in ovary of mature zebrafish.The exposure history of mothers caused toxic effects on the fertilization and hatching as well as growth of the next non-exposed generation of embryos and larvae.

zebrafish;ovary;oxidative damage;maternal toxicity;cadmium

Q492

A

1009-0002（2017）03-0301-07

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.012

2016-12-19

教育部高等學校博士學科點專項科研基金（20131401120009）

劉洋（1991-），女，碩士研究生，（E-mail）1530354168@qq.com

王蘭，（E-mail）lanwang@sxu.edu.cn；孫敏，（E-mail）sunm1112@163.com

*Co-corresponding authors,WANG Lan,E-mail:lanwang@sxu.edu.cn;SUN Min,E-mail:sunm1112@163.com