隋雨彤，趙尊全，王輝，鄭玉玲，劉鵬，姜永強

軍事醫(yī)學科學院 微生物與流行病研究所，北京 100071

豬鏈球菌溶血素對人腦微血管內皮細胞凋亡的影響

隋雨彤，趙尊全，王輝，鄭玉玲，劉鵬，姜永強

軍事醫(yī)學科學院 微生物與流行病研究所，北京 100071

目的：檢測天然豬鏈球菌溶血素（nSLY）對人腦微血管內皮細胞凋亡的影響，從而探討豬鏈球菌致宿主腦膜炎的發(fā)生機制。方法：使用豬鏈球菌野生株05ZYH33上清、sly基因敲除突變株ΔSLY上清、天然SLY蛋白分別與人腦微血管內皮細胞hCMEC/D3作用4 h后收集細胞，分別用流式細胞術和蛋白免疫印跡技術檢測hCMEC/D3細胞凋亡的情況。結果：與對照組比較，天然SLY蛋白可以通過誘導腫瘤壞死因子α（TNF-α）上調顯著促進hCMEC/D3細胞發(fā)生凋亡，同樣含天然SLY的豬鏈球菌2型野生株05ZYH33上清也通過該途徑促進hCMEC/D3細胞凋亡，但突變株ΔSLY上清則不能影響hCMEC/D3細胞的凋亡。結論：豬鏈球菌溶血素可以通過TNF-α促進人腦微血管內皮細胞發(fā)生凋亡，可能是豬鏈球菌致腦膜炎的發(fā)病機制之一。

豬鏈球菌溶血素；腦膜炎；腫瘤壞死因子α；人腦微血管內皮細胞；凋亡

豬鏈球菌（Streptococcus suis）是近年新發(fā)現的人畜共患病的病原菌，可引起人和豬的腦膜炎、鏈球菌中毒休克綜合征（streptoccal toxic shock syndrome，STSS），具有較高的致殘和致死率[1-2]。目前對豬鏈球菌的研究主要側重于新的毒力基因的發(fā)現和鑒定上，已鑒定的毒力因子主要包括莢膜多糖（capsular polysaccharide，CPS）、豬鏈球菌溶血素（suilysin，SLY）、細胞外蛋白因子（extracellular factor，EF）和溶菌酶釋放蛋白（muramidase-released protein，MRP）等[3]。有報道顯示，SLY可以裂解和損傷多種細胞，并且它也是致內皮細胞炎癥的最主要因素，提示其在豬鏈球菌入侵中樞系統(tǒng)和破壞血腦屏障的過程中發(fā)揮著重要作用[4]。因此，研究豬鏈球菌致腦膜炎的致病機理，尋找豬鏈球菌致腦膜炎新的治療靶點具有重要意義和價值。

在本研究中，我們提取了天然SLY，通過實時定量PCR（qRT-PCR）、蛋白免疫印跡（Western blot）和細胞凋亡等實驗，試圖闡明SLY在豬鏈球菌致腦膜炎過程中的致病機制。

1 材料與方法

1.1 材料

豬鏈球菌2型野生株05ZYH33、天然SLY蛋白（nSLY）由本室保存；sly基因敲除突變株ΔSLY由本室構建保存；人腦微血管內皮細胞（human cerebral microvascular endothelial cells，hCMEC）hCMEC/D3由法國國家醫(yī)學衛(wèi)生研究院Pierre-Olivier Couraud教授饋贈。

氯霉素、卡那霉素（Sigma公司）；THB培養(yǎng)基、AnnexinⅤ-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒（BD公司）；EBM-2內皮細胞基礎培養(yǎng)基（LONZA公司）；F-actin Labeling Kit共聚焦熒光染料（BBI Life Sciences公司）；酵母粉（Oxoid公司）；Lenalidomide（Selleck公司）。

1.2 天然SLY的活性分析

用PBS洗過的紅細胞（實驗所用的健康人全血取自志愿獻血人，且獻血者在2周內未服用抗凝藥物，全血用3.2%枸櫞酸鈉抗凝，倫理委員會批準通過）制備成2%紅細胞懸液，然后加入不同濃度的nSLY蛋白，37℃下旋轉孵育1 h，取200 μL加入96孔酶聯板，用酶聯儀測定D540nm值作為溶血活性判斷的標準。

1.3 細胞與細菌培養(yǎng)

hCMEC/D3用含5%胎牛血清的EBM-2培養(yǎng)基，在5%CO2培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)；豬鏈球菌2型野生株05ZYH33用THB培養(yǎng)基培養(yǎng)；sly基因敲除突變株ΔSLY用含5μg/mL氯霉素的THB培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.4 RT-PCR檢測

用 Viia7 PCR反應儀對腫瘤壞死因子α（TNF-α）基因的表達進行實時定量分析，反應體系使用SYBR PrimeScript RT-PCR KitⅡ。檢測所用上游引物為5'-TATGAGCCCATCTATCTG-3'，下游引物為5'-AATGATCCCAAAGTAGAC-3'。

1.5 蛋白免疫印跡實驗

豬鏈球菌2型野生株05ZYH33上清、sly基因敲除突變株ΔSLY上清、nSLY蛋白分別與hCMEC/ D3細胞作用4 h后收集細胞上清，沸水浴5 min使蛋白充分變性，然后進行SDS-PAGE，用半干法將分離的蛋白轉移到PVDF膜上，用封閉液室溫封閉1 h，加入對應的一抗，4℃旋轉振蕩過夜；用TBST洗滌3次，5 min/次，之后加入HRP標記的二抗，室溫孵育1 h；用TBST洗滌5次，5 min/次；顯色，光密度掃描定量分析。

1.6 細胞凋亡檢測

采用AnnenxinⅤ/FITC細胞凋亡檢測試劑盒進行。細胞收集后1000～2000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1次，棄上清，加入結合緩沖液重懸細胞，取100μL用AnnenxinⅤ標記，室溫下避光孵育15 min，然后加入PI，室溫避光孵育5 min，用流式細胞儀進行定量檢測。

1.7 統(tǒng)計分析

實驗數據用t檢驗統(tǒng)計分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SLY蛋白溶血活性分析

為了評價天然SLY蛋白的活性，確定合適的蛋白濃度來刺激人腦微血管內皮細胞，用2%紅細胞檢測其溶血活性[5]，37℃作用1 h溶解1%細胞定義為一個溶血單位（HU）。根據結果（圖1），我們選用終濃度125 ng/mL的SLY蛋白作為本實驗合適的濃度。

2.2 SLY蛋白誘導人腦微血管內皮細胞凋亡

流式細胞檢測結果顯示（圖2），與對照組相比，天然SLY蛋白可導致hCMEC/D3細胞凋亡，提示SLY蛋白可誘導人腦微血管內皮細胞凋亡。

2.3 SLY蛋白引起hCMEC/D3細胞凋亡依賴于TNF-α

我們以前的研究發(fā)現，豬鏈球菌2型野生株05ZYH33可誘導hCMEC/D3產生較高水平的TNF-α[6]，提示豬鏈球菌2型野生株05ZYH33可能通過TNF-α破壞血腦屏障的完整性，引發(fā)腦膜炎。通過本研究我們發(fā)現SLY可引起人腦微血管內皮細胞的凋亡，因此推測SLY蛋白可能是通過TNF-α促進人腦微血管內皮細胞凋亡。qRT-PCR與Western印跡結果均顯示（圖3A），天然SLY蛋白刺激hCMEC/D3細胞后可引起TNF-α上調。為了確定SLY蛋白是否通過TNF-α引起細胞凋亡，我們加入TNF-α抑制劑Lenalidomide對細胞進行預處理，qRT-PCR與Western印跡結果提示（圖3A），TNF-α抑制劑可以顯著抑制TNF-α的表達?；谝陨辖Y果，我們進一步探討TNF-α與細胞凋亡間的關系。細胞凋亡檢測結果顯示（圖3B），TNF-α抑制劑可以極大地降低細胞凋亡率。同時我們用Western印跡檢測凋亡的關鍵執(zhí)行分子caspase-3的活性，結果表明（圖3C），與SLY蛋白刺激hCMEC/D3細胞后caspase-3的活性相比，用TNF-α抑制劑預處理的hCMEC/D3細胞的caspase-3的活性明顯降低。上述結果提示我們SLY蛋白引起hCMEC/D3細胞凋亡依賴于TNF-α。

3 討論

豬鏈球菌溶血素是膽固醇依賴型的細胞成孔毒素，是革蘭陽性菌在感染宿主時分泌的一種重要的毒力因子[7-8]，可在富含膽固醇的細胞膜表面發(fā)生寡聚，進而在細胞膜表面打孔，通過改變細胞膜的通透性而破壞細胞[9-10]，提示豬鏈球菌溶血素SLY可能通過引起內皮細胞死亡破壞血腦屏障，但這一過程的具體分子機制有待進一步研究。本研究表明，豬鏈球菌2型野生株05ZYH33上清可以明顯促進人腦微血管內皮細胞凋亡，但sly基因敲除突變株ΔSLY上清則不能影響人腦微血管細胞的凋亡。同時，我們用提取的天然SLY蛋白直接刺激人腦微血管內皮細胞，發(fā)現人腦微血管內皮細胞的凋亡明顯增強，提示天然SLY蛋白可促使內皮細胞凋亡。由此我們推測，天然SLY蛋白通過誘導人腦微血管內皮細胞凋亡，破壞了血腦屏障的完整性，從而導致豬鏈球菌通過血腦屏障，引起炎癥、水腫及神經損傷。

圖1 SLY蛋白活性分析

圖2 細胞凋亡檢測結果

作為血腦屏障的最重要的組成成分，人腦微血管內皮細胞發(fā)揮著較為重要的作用。血腦屏障是機體的一道重要屏障，其主要功能為阻止病原體和其他大分子物質通過血液循環(huán)進入腦組織，是一種具有選擇性通透作用的屏障[11-13]。雖然近年對豬鏈球菌的研究關注度明顯加強，但豬鏈球菌致腦膜炎的機制還未完闡明，多數研究針對影響血腦屏障毒力因子的篩選和功能發(fā)掘，而對豬鏈球菌是通過何種方式穿過血腦屏障到達中樞神經系統(tǒng)，破壞腦組織，導致腦膜炎的機制的研究較少。從感染豬鏈球菌到最終引發(fā)細菌性腦膜炎的過程中，其關鍵在于通過血腦屏障到達中樞神經系統(tǒng)的方式。由于hCMEC/D3是血腦屏障的最關鍵組成部分，因此，研究豬鏈球菌與腦微血管內皮細胞的相互作用，及其在此過程中引起腦微血管內皮細胞膜的變化，有助于我們發(fā)現其導致細菌性腦膜炎的機制。

圖3 SLY蛋白引起hCMEC/D3細胞凋亡依賴于TNF-α

我們以前的研究表明豬鏈球菌2型野生株05ZYH33可以促進TNF-α的表達上調[6]，提示SLY蛋白可能是通過TNF-α引起細胞凋亡，從而破壞血腦屏障的完整性。TNF-α這一促炎細胞因子在誘發(fā)腦膜炎中的重要作用已得到越來越多的關注。作為一種重要的多效性細胞因子[14]，TNF-α被認為是與腦膜炎發(fā)生和發(fā)展關系較為密切的介質。在此基礎上，我們發(fā)現天然SLY蛋白刺激hCMEC/D3細胞后可誘導其凋亡，同時發(fā)現天然SLY蛋白刺激hCMEC/D3細胞后可顯著促進TNF-α表達上調。作為一個多效性細胞因子，TNF-α可以啟動與細胞凋亡相關的級聯反應[14]。有研究表明TNF-α可以激活NF-κB信號通路[6]，從而誘導大量與細胞凋亡相關基因的表達，這提示我們SLY蛋白刺激hCMEC/D3細胞后可能通過改變TNF-α的表達水平，從而激活NF-κB信號通路，引發(fā)一些與凋亡相關基因的過表達，最終導致內皮細胞凋亡。為了證明這一推理，我們用TNF-α抑制劑檢測TNF-α對hCMEC/D3細胞凋亡的影響，發(fā)現用TNF-α抑制劑進行預處理后可以極大地降低凋亡率。在細胞凋亡過程中，caspase家族起著十分重要的作用，同時caspase-3作為細胞凋亡的關鍵執(zhí)行分子，在凋亡信號傳導的多種途徑中都發(fā)揮著重要功能。正常情況下caspase-3以酶原（相對分子質量為32 000）形式存在，但在細胞凋亡的早期階段可被激活，活化的caspase-3由2個大亞基（相對分子質量為19 000）和2個小亞基（相對分子質量為17 000）組成，通過裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡[14-16]。為了進一步證明TNF-α誘導的凋亡過程，我們采用Western印跡檢測caspase-3的活性，證明SLY確實可以活化caspase-3，而TNF-α抑制劑可以降低caspase-3的活性。由此說明SLY引起hCMEC/D3細胞凋亡依賴于TNF-α。但這一過程的具體分子機制有待進一步研究。

通過我們的實驗，首次證明天然豬鏈球菌溶血素可以通過TNF-α誘導人腦微血管內皮細胞凋亡，表明天然SLY蛋白是通過誘導細胞凋亡從而穿過血腦屏障，并引起腦膜炎的。這為豬鏈球菌致腦膜炎患者臨床治療提供了新的治療靶點，具有重要意義。

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Effects of Suilysin on Apoptosis of Human Cerebral Microvascular Endothelial Cells

SUI Yu-Tong,ZHAO Zun-Quan,WANG Hui, ZHENG Yu-Ling,LIU Peng*,JIANG Yong-Qiang*

State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity,Institute of Microbiology and Epidemiology,Beijing 100071,China

*Co-corresponding authors,JIANG Yong-Qiang,E-mail:jiangyq@bmi.ac.cn;LIU Peng,E-mail:ammsliupeng@163.com

Objective:To explore the mechanism of meningitis caused byStreptococcus suis,we detect the effect of nativeS.suishemolysin（nSLY）on the apoptosis of human brain microvascular endothelial cells.Methods:We used wild strainsS.suis05ZYH33 supernatant,slyknockout mutant strains supernatant and native SLY protein to stimulate the human cerebral microvascular endothelial cells hCMEC/D3 respectively,and collected the cell after 4 h.Furtermore,flow cytometry and protein immunoblot technology were used to observe the apoptosis of the hCMEC/ D3.Results:Compared with control group,the natural SLY protein could promote significantly hCMEC apoptosis by inducing the expression of TNF-α.Consisting with the natural SLY protein,the wild strainsS.suis05ZYH33 supernatant also promote hCMEC/D3 apoptosis by the same way,butslyknockout mutant strains supernatant could not affect hCMEC/D3 apoptosis.Conclusion:Suilysin can promote the brain microvascular endothelial cells apoptosis induced by TNF-α,which may be one of the pathogenesis of meningitis caused byS.suis.

Streptococcus suissuilysin;meningitis;TNF-α;human brain microvascular endothelial cells;apoptosis

Q25

A

1009-0002（2017）03-0290-05

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.010

2016-12-13

國家自然科學基金（81371766）

隋雨彤（1991-），女，碩士研究生，（E-mail）929199468@qq.com

姜永強，（E-mail）jiangyq@bmi.ac.cn；劉鵬，（E-mail）ammsliupeng@163.com