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        霍亂O139血清群多糖結(jié)合疫苗的生物合成研究

        2017-06-09 08:58:14黃競(jìng)董巖潘超胡顯文曾明吳軍朱力王恒樑
        生物技術(shù)通訊 2017年3期
        關(guān)鍵詞:血清

        黃競(jìng),董巖,潘超,胡顯文,曾明,吳軍,朱力,王恒樑

        1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所,北京 100071;

        2.中國(guó)食品藥品檢定研究院 衛(wèi)生部生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100050

        霍亂O139血清群多糖結(jié)合疫苗的生物合成研究

        黃競(jìng)1,董巖2,潘超1,胡顯文1,曾明2,吳軍1,朱力1,王恒樑1

        1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所,北京 100071;

        2.中國(guó)食品藥品檢定研究院 衛(wèi)生部生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100050

        目的:霍亂是由霍亂弧菌引起的一種烈性傳染病,其防治已成為一個(gè)全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題。其中1992年出現(xiàn)的O139血清群是除O1外另一種病原體,發(fā)病數(shù)日益增多。因此,有必要尋找一種安全有效適用于各種人群的疫苗。方法:敲除霍亂弧菌O139血清群93-3株脂多糖合成途徑中O抗原連接酶基因waaL,在周間質(zhì)產(chǎn)生游離的多糖,之后轉(zhuǎn)入包含來(lái)自腦膜炎奈瑟球菌的糖基轉(zhuǎn)移酶和霍亂毒素B亞單位(CTB)編碼序列的共表達(dá)載體,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后制備全菌蛋白樣品,利用抗His抗體檢測(cè)糖蛋白的表達(dá),利用Ni柱和離子交換柱對(duì)糖蛋白進(jìn)行純化,并對(duì)其進(jìn)行糖定量和蛋白定量。結(jié)果:以未糖基化、相對(duì)分子質(zhì)量約為14×103的底物蛋白CTB為對(duì)照,當(dāng)共表達(dá)CTB和糖基轉(zhuǎn)移酶PglL時(shí),通過(guò)Western印跡可檢測(cè)到相對(duì)分子質(zhì)量約為20×103的糖基化蛋白,經(jīng)Ni柱及陽(yáng)離子交換柱純化,得到純度較高的O139群霍亂O抗原多糖結(jié)合蛋白,其純度約為84.2%,并計(jì)算得其糖-蛋白比為0.103∶1。結(jié)論:通過(guò)生物法合成了一種霍亂O139血清群的多糖結(jié)合疫苗,為后續(xù)進(jìn)行動(dòng)物評(píng)價(jià)打下了基礎(chǔ)。

        霍亂弧菌;多糖結(jié)合疫苗;O-糖基化;糖蛋白

        霍亂是因感染霍亂弧菌而引起的烈性傳染病,臨床主要表現(xiàn)為急性腹瀉,被世界衛(wèi)生組織(WHO)定為必須國(guó)際檢疫的傳染病。在我國(guó),霍亂和鼠疫是僅有的2種甲類傳染病。歷史上,霍亂有過(guò)7次世界大流行。根據(jù)表面O抗原的不同,霍亂弧菌被分為200多個(gè)血清群,WHO腹瀉控制中心認(rèn)定O1和O139血清群是引起霍亂的病原體。O139血清群霍亂是自1992年從印度半島開(kāi)始流行的一種新型霍亂,在抗原性方面與O1血清群無(wú)交叉[1]。近年來(lái)O139群霍亂發(fā)病數(shù)日益增多,2002年度O139群霍亂的發(fā)病例數(shù)占同年霍亂發(fā)病總例數(shù)的36.0%,我國(guó)于1993年5月首次在新疆阿克蘇地區(qū)發(fā)現(xiàn)O139群霍亂病例[2]。

        O139群霍亂弧菌產(chǎn)生的O抗原莢膜較薄,莢膜多糖(capsule polysaccharide,CPS)由較長(zhǎng)的糖單位聚合而成,其結(jié)構(gòu)與脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)的O糖單位相同,但不連接于LPS的核心結(jié)構(gòu)[3]。當(dāng)一個(gè)O抗原多糖(O-antigen polysaccharide,OPS)單位連接于脂質(zhì)A核心多糖結(jié)構(gòu),形成LPS,而未連接于LPS的O139側(cè)鏈重復(fù)單位則構(gòu)成莢膜多糖[4]。研究表明,O139血清群中與脂質(zhì)核心連接的OPS在免疫應(yīng)答中對(duì)于誘導(dǎo)血清抗體具有最重要的作用,而CPS僅具有很微弱的免疫原性[5]。

        霍亂弧菌的主要毒力因子是霍亂毒素(cholera toxin,CT),它包括A和B亞單位。其中,霍亂毒素B亞單位(CTB)是無(wú)毒的同源五聚體,能與大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面都有的神經(jīng)節(jié)苷脂GM1特異性結(jié)合,刺激機(jī)體產(chǎn)生黏膜IgA。CTB可以誘導(dǎo)強(qiáng)烈的體液免疫,中和體內(nèi)的霍亂毒素,而且最近的研究表明,CTB可以在體內(nèi)引起抗炎癥機(jī)制[6]。已經(jīng)證實(shí)CTB是一種很好的黏膜佐劑,能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生黏膜免疫反應(yīng),具有加強(qiáng)抗原表位抗原性的特點(diǎn)。因此,CTB常被選作多肽疫苗的佐劑,特別是作為黏膜免疫的佐劑[7]。

        腦膜炎奈瑟球菌糖基轉(zhuǎn)移酶PglL可單獨(dú)催化腦膜炎奈瑟球菌Ⅳ型菌毛蛋白PilE發(fā)生O糖基化,它有著寬松的底物特異性,并可以轉(zhuǎn)移多種外源的聚糖,其糖基化過(guò)程與細(xì)菌LPS合成具有很大的相似性,均是在酶的催化下對(duì)糖的轉(zhuǎn)移:LPS合成中,多糖在O抗原連接酶催化下與脂質(zhì)A核心相連;而蛋白糖基化則是在糖基轉(zhuǎn)移酶催化下將多糖轉(zhuǎn)移至底物蛋白[8]。因此,我們可以通過(guò)改造其LPS合成路徑,并轉(zhuǎn)入蛋白糖基化系統(tǒng),使OPS轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)牡孜锏鞍?,從而制備多糖結(jié)合疫苗。相比于傳統(tǒng)的化學(xué)合成方法,生物法能夠一步合成,合成效率高,產(chǎn)品均一性強(qiáng)。

        我們通過(guò)同源雙交換方法敲除了霍亂弧菌O139血清群93-3株LPS合成途徑中的O抗原連接酶waaL,使其產(chǎn)生游離的OPS,之后轉(zhuǎn)入含有PglL和底物蛋白CTB編碼序列的融合表達(dá)載體,誘導(dǎo)表達(dá)合成霍亂糖蛋白,并對(duì)其進(jìn)行初步純化分析,為下一步的動(dòng)物評(píng)價(jià)打下了基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        霍亂弧菌O139血清群93-3株(CMCC編號(hào),Smr)由中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心提供;大腸桿菌DH5αλpir(含有λpir系統(tǒng),用于克隆和富集重組自殺質(zhì)粒)、SM10λpir(含有λpir系統(tǒng)及性菌毛,可作為接合轉(zhuǎn)移的供體菌,Kmr),自殺質(zhì)粒pWM91(含有sacB位點(diǎn),Apr)由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心惠贈(zèng);低拷貝質(zhì)粒pAK(Kmr)、O-糖基轉(zhuǎn)移酶PglL和底物蛋白CTB的融合表達(dá)載體pET28atac-pgIL-tac-CTB4573N(Kmr)、底物蛋白CTB表達(dá)載體pET28a-tac-CTB(Kmr)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建;快速DNA產(chǎn)物純化試劑盒、高純度質(zhì)粒小提試劑盒、純化柱Ni-agarose Resin購(gòu)自康為世紀(jì)公司;2× TransTaqHiFi PCR Super MixⅠ、ProteinRulerⅡ(12~120 kD)、Blue PlusⅡProtein Marker(14~120 kD)購(gòu)自全式金生物公司;限制性內(nèi)切酶SpeⅠ、XhoⅠ、BamH I、SalⅠ,10×緩沖液,除鹽柱Zeba Spin Desalting Columns,蛋白定量試劑盒Micro BCA Protein Assay Kit購(gòu)自Thermo Scientific公司;T4DNA連接酶、10×T4DNA連接酶緩沖液購(gòu)自TaKaRa公司;氨芐西林、卡那霉素、鏈霉素購(gòu)自Sigma公司。

        1.2 霍亂93-3株waaL基因缺失株與回復(fù)株的構(gòu)建與驗(yàn)證

        以NCBI霍亂弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株El Tor N16961基因組waaL基因及上、下游序列作為模板設(shè)計(jì)引物,采用Primer 5.0軟件完成(表1)。b和c引物包含10~20 bp互補(bǔ)序列,之后進(jìn)行融合PCR連接waaL上、下游基因片段,純化片段經(jīng)SpeⅠ、XhoⅠ雙酶切后連入經(jīng)相同酶切的pWM91質(zhì)粒,利用同源雙交換方法構(gòu)建突變株93-3ΔwaaL。之后利用引物waaLout-P1和waaLout-P2,以93-3基因組DNA為模板擴(kuò)增waaL基因、自身啟動(dòng)子和上下游序列,通過(guò)BamHⅠ和SalⅠ酶切,連接構(gòu)建回復(fù)質(zhì)粒pAK-waaL,并電擊轉(zhuǎn)化93-3ΔwaaL感受態(tài),從而構(gòu)建回復(fù)株93-3waaLH。用waaL基因內(nèi)部引物(waaLin-P1/waaLin-P2)、外部引物(waaLout-P1/waaLout-P2)、霍亂弧菌毒素協(xié)同調(diào)節(jié)菌毛基因引物(tcpA-P1/tcpA-P2)進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

        1.3 霍亂O-連接糖基化修飾途徑工程菌的構(gòu)建與IPTG誘導(dǎo)表達(dá)及檢測(cè)

        將質(zhì)粒pET28a-tac-pgIL-tac-CTB4573N、pET28atac-CTB分別電擊轉(zhuǎn)化93-3ΔwaaL感受態(tài)細(xì)胞,用卡那霉素抗性平板篩選陽(yáng)性克隆,獲得重組菌93-3ΔwaaL/pET28a-pgIL-CTB4573N和 93-3ΔwaaL/ pET28a-CTB。將上述重組菌株及缺失株按1∶100接種于LB液體培養(yǎng)基中,37℃搖床培養(yǎng)至D600nm達(dá)0.5左右,再加入終濃度為1 mmol/L的IPTG,30℃搖床培養(yǎng)12 h后收菌。參照《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》收集菌液制備SDS-PAGE樣品,各取10 μL上樣,經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色和Western印跡檢測(cè)。

        表1 引物及序列

        1.4 霍亂O-糖蛋白復(fù)合物的初步分離純化

        將30℃誘導(dǎo)12 h的93-3ΔwaaL/pET28a-tacpgIL-tac-CTB4573N離心收菌,用A1液[20 mmol/L Tris-HCl(pH7.5),0.5 moL/L NaCl,10 mmol/L咪唑]重懸菌體,超聲破菌(超聲4 s暫停5 s,累計(jì)超聲2 h),離心收集上清,即為含霍亂弧菌O139血清群OPS修飾的CTB融合蛋白CTB4573N-OPS的粗提液。用Ni-agarose Resin初步純化樣品并除鹽,用陽(yáng)離子交換柱進(jìn)一步純化,考馬斯亮藍(lán)染色及Western印跡檢測(cè),用Image J軟件對(duì)考馬斯亮藍(lán)染色圖進(jìn)行灰度分析,以確定樣品純度。

        1.5 霍亂O-糖蛋白復(fù)合物的糖定量和蛋白定量

        收集純度較好的樣品濃縮,稀釋至1/20后用蒽酮-硫酸法測(cè)定樣品中的糖含量,用蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白含量,并計(jì)算糖-蛋白比。

        2 結(jié)果

        2.1 霍亂93-3株O抗原連接酶缺失株的構(gòu)建

        用waaL基因內(nèi)部引物、外部引物及霍亂弧菌特有的毒素協(xié)同調(diào)節(jié)菌毛基因引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證,結(jié)果如圖1。用內(nèi)部引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證時(shí),僅野生株和回復(fù)株可以擴(kuò)增得到483 bp片段;用外部引物驗(yàn)證時(shí),野生株93-3的擴(kuò)增產(chǎn)物為1271 bp,缺失株93-3ΔwaaL由于缺失了waaL基因,其擴(kuò)增產(chǎn)物為591 bp,而93-3ΔwaaLH由于在缺失株的基礎(chǔ)上導(dǎo)入包含waaL基因及上、下游調(diào)控序列的質(zhì)粒,所以擴(kuò)增產(chǎn)物含有1271和591 bp片段。用霍亂弧菌毒素協(xié)同調(diào)節(jié)菌毛基因引物驗(yàn)證時(shí),野生株、缺失株和回復(fù)株的擴(kuò)增產(chǎn)物均為675 bp。PCR結(jié)果表明waaL缺失株構(gòu)建成功。

        2.2 霍亂弧菌中建立O-糖基化系統(tǒng)

        圖1 93-3野生株、缺失株和回復(fù)株的PCR驗(yàn)證M:DNA marker;1:93-3;2:93-3ΔwaaL;3:93-3ΔwaaLH

        經(jīng)IPTG誘導(dǎo)糖基化途徑表達(dá)后,對(duì)重組菌93-3ΔwaaL/pET28a-pgIL-CTB4573N、93-3ΔwaaL/ pET28a-CTB和缺失株93-3ΔwaaL中的糖蛋白進(jìn)行檢測(cè),Western印跡結(jié)果如圖2。93-3ΔwaaL由于不含糖基化系統(tǒng),因此在Western印跡中無(wú)條帶;而93-3ΔwaaL/pET28a-CTB只表達(dá)帶有His標(biāo)簽的CTB,相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)約為14×103;93-3ΔwaaL/pET28a-pgIL-CTB4573N在表達(dá)CTB的同時(shí)表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶PglL,使多糖轉(zhuǎn)移到底物蛋白,93-3的LPS僅含一個(gè)多糖重復(fù)單位,可看到Mr增大,且?guī)缀跛械孜锏鞍拙惶腔T贛r約20×103處出現(xiàn)2條帶,可能是由于糖基化干擾影響信號(hào)肽的切割。此結(jié)果表明,在重組菌93-3ΔwaaL/pET28a-pgIL-CTB4573N中,可以由IPTG誘導(dǎo)糖基化途徑表達(dá)并生成糖蛋白。

        2.3 霍亂O-糖蛋白復(fù)合物的初步純化及檢測(cè)

        鎳柱純化后的糖蛋白再經(jīng)離子交換,考馬斯亮藍(lán)染色及灰度分析結(jié)果表明目標(biāo)蛋白兩峰的純度約為84.2%,說(shuō)明目標(biāo)蛋白經(jīng)Ni純化柱和離子交換柱后分離效果較好,除去了大部分雜蛋白。對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行Anti-His Western印跡,蛋白純度較高,均一性較好。結(jié)果見(jiàn)圖3。

        2.4 霍亂O-糖蛋白復(fù)合物的糖定量和蛋白定量

        圖2 CTB及糖基化修飾的SDS-PAGE與Anti-His Western印跡

        對(duì)純化濃縮的糖蛋白進(jìn)行糖定量和蛋白定量,標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖4,曲線R2均大于0.99,可用于定量分析。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算,CTB4573N-OPS樣品中糖濃度約為150μg/mL,蛋白濃度約為1450 μg/mL。由于天然的CTB并沒(méi)有O-糖基化位點(diǎn),因此當(dāng)融合1個(gè)糖基化位點(diǎn)后產(chǎn)生1個(gè)糖蛋白,故純化產(chǎn)物中糖和蛋白的摩爾比為1∶1;而93-3株的OPS僅1個(gè)單位,因此產(chǎn)物中糖與蛋白的質(zhì)量比為0.103∶1。

        3 討論

        目前,國(guó)際上已獲批準(zhǔn)的霍亂疫苗中,只有Shanchol(包括霍亂O1群埃爾托型和O139群菌株滅活全細(xì)胞的口服二價(jià)疫苗)對(duì)O139群霍亂有保護(hù)性,臨床試驗(yàn)表明,此疫苗對(duì)于O1和O139血清群的血清殺弧菌抗體滴度分別為91%和11%[9],證明O1血清群的免疫原性強(qiáng)于O139血清群。盡管嬰幼兒是霍亂的高發(fā)群體,但在印度加爾各答的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Shanchol在所有年齡段的受試群體中保護(hù)作用為45%,在5歲以下兒童中的保護(hù)作用僅為17%[10]。有報(bào)道,目前獲得許可的口服霍亂疫苗對(duì)兒童的免疫效果和持續(xù)時(shí)間都明顯低于成年人[11]。因此,有必要研發(fā)一種保護(hù)時(shí)間長(zhǎng)、效果好,且能在5歲以下嬰幼兒中產(chǎn)生保護(hù)作用的霍亂O139血清群的疫苗。

        圖3 CTB4573N-OPS純化結(jié)果的SDS-PAGE、灰度分布圖及Anti-His Western印跡

        圖4 糖定量和蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

        對(duì)于霍亂而言,LPS既是毒力因子,又是重要的保護(hù)性抗原,霍亂弧菌O1血清群的LPS在人體和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中被證明可以誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答,因此將LPS作為保護(hù)性免疫原用于霍亂疫苗的思路被廣泛認(rèn)可。但LPS是Ⅰ類T細(xì)胞非依賴性抗原,在高水平時(shí),純化的LPS可以激活B細(xì)胞,產(chǎn)生多種抗體;低水平時(shí),僅在霍亂全細(xì)胞或外膜囊泡存在的情況下,LPS才會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生LPS特異性的IgM和IgG抗體[12-13]。O抗原多糖是LPS中最重要的免疫原性結(jié)構(gòu),它可以產(chǎn)生一種基于抑制菌體運(yùn)動(dòng)性的保護(hù)性機(jī)制,以阻止霍亂的成功克隆?;魜y弧菌有一個(gè)單極的鞭毛,鞭毛外部包被著包含LPS分子的外膜護(hù)鞘。在其他實(shí)驗(yàn)中,有學(xué)者證明只有抗O抗原的抗體,而非直接針對(duì)主要的鞭毛亞基FlaA和外膜蛋白的抗體,能有效抑制霍亂弧菌的運(yùn)動(dòng)性[13]。LPS在動(dòng)物模型中產(chǎn)生的抗體有明顯的保護(hù)作用,在志愿者試驗(yàn)中也獲得證實(shí),此抗體是主要的殺弧菌抗體[3]。因此我們將O抗原與底物蛋白CTB以生物法連接,其中底物蛋白CTB既是黏膜佐劑,又是抗原。因?yàn)樵诨魜y弧菌的所有血清群中,僅有O1和O139血清群會(huì)產(chǎn)生與傳染性霍亂相關(guān)的霍亂毒素,所以CTB也能刺激機(jī)體產(chǎn)生重要的抗毒抗體。此CTB4573N-OPS糖蛋白作為疫苗可以提供更好的保護(hù)性并延長(zhǎng)了保護(hù)時(shí)間,且能在5歲以下的嬰幼兒中產(chǎn)生免疫保護(hù)。

        綜上,我們介紹了一種O139群霍亂多糖-蛋白結(jié)合疫苗的構(gòu)建思路,并對(duì)糖蛋白進(jìn)行了初步分析和純化,獲得了純度較高的樣品。但目前看來(lái),仍有必要對(duì)其進(jìn)一步改造和探索。O抗原糖鏈能夠影響致病菌的抗原性并不同程度地刺激免疫系統(tǒng),一般來(lái)說(shuō),O抗原糖鏈越長(zhǎng),其免疫原性越高[14]??赡苷怯捎诨魜y弧菌O1血清群包含12~18個(gè)OPS單糖重復(fù)單位,而O139血清群的O抗原僅有1個(gè)糖單位,所以O(shè)139血清群的免疫原性更弱。本文所介紹的糖蛋白疫苗因?yàn)榫瓯旧碓?,糖鏈過(guò)于短,糖-蛋白比過(guò)低。后續(xù),可以通過(guò)導(dǎo)入外源的控制LPS合成中O抗原糖鏈延長(zhǎng)的基因,嘗試增加O抗原糖鏈的長(zhǎng)度,并通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察疫苗的效果差異,以提高霍亂弧菌O139血清群疫苗的保護(hù)效果。

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        Study of Vibrio cholerae O139 Serotype Polysaccharides Bio-Conjugated Vaccine

        HUANG Jing1,DONG Yan2,PAN Chao1,HU Xian-Wen1, ZENG Ming2,WU Jun1,ZHU Li1,WANG Heng-Liang1*

        1.Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100071;
        2.Institute for Biological Product Control,National Institutes for Food and Drug Control,Beijing 100050;China

        *Corresponding author,E-mail:wanghl@nic.bmi.ac.cn

        Objective:Cholera is still a major global health problem,Vibrio choleraeO139 serotype emerged as a second aetiologic agent of cholera in 1992.It is necessary to find a safe and effective vaccine to control it.Methods:We constructedV.choleraeO139 group 93-3 strain containing a delection in O-antigen ligasewaaL, and free polysaccharides were produced in the periplasm.Then introduced the co-expression plasmid ofNeisseria meningitidisO-oligosaccharyltransferase PglL and cholerae toxin B subunit(CTB)to the genetically modified strain. After IPTG induction,the samples were prepared and the expression of glycoprotein was detected by anti His antibody.The target protein was further purified by Ni affinity column and cationic exchange column and quantify polysaccharide and protein content.Results:The substrate protein CTB,which was non glycosylation and relative molecular weight of about 14 kD,was used as control.When the co-expression of CTB and glycosyltransferasePglL,through the Western blot can detect the relative molecular weight of glycosylated protein is about 20 kD.Purified by Ni affinity column and cationic exchange column,we obtained O139 group of cholera O antigen polysaccharide binding protein with purity of 84.2%,and calculate the sugar protein ratio was 0.103∶1.Conclusion:We synthesized a polysaccharide conjugate vaccine by biological method,which laid the foundation for the subsequent animal evaluation.

        Vibrio cholerae;polysaccharide conjugate vaccine;O-linked glycosylation;glycoprotein

        Q78

        A

        1009-0002(2017)03-0281-05

        10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.008

        2017-01-03

        國(guó)家自然科學(xué)基金(81373316);國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(2013CB910804)

        黃競(jìng)(1991-),女,碩士研究生,(E-mail)1041526187@qq.com

        王恒樑,(E-mail)wanghl@nic.bmi.ac.cn

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