劉慧瑩，李文斐，張自麗,2，鄭敬，衡芝芝，李璞媛，苑鑫，牛文凱，柏長(zhǎng)青

1.解放軍307醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100071；2.安徽醫(yī)科大學(xué)，安徽 合肥 230032；

3.第四軍醫(yī)大學(xué) 航空航天醫(yī)學(xué)系，陜西 西安 710032

MSC與S1P聯(lián)用對(duì)急性損傷的肺內(nèi)皮細(xì)胞中S1P代謝相關(guān)酶的表達(dá)調(diào)控

劉慧瑩1，李文斐3，張自麗1,2，鄭敬1，衡芝芝1，李璞媛1，苑鑫1，牛文凱1，柏長(zhǎng)青1

1.解放軍307醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100071；2.安徽醫(yī)科大學(xué)，安徽 合肥 230032；

3.第四軍醫(yī)大學(xué) 航空航天醫(yī)學(xué)系，陜西 西安 710032

目的：探究間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）與鞘氨醇-1-磷酸（S1P）聯(lián)用對(duì)急性肺損傷發(fā)生過程中S1P代謝相關(guān)酶的表達(dá)調(diào)控作用。方法：構(gòu)建脂多糖（LPS）刺激的急性損傷的肺內(nèi)皮細(xì)胞模型，與MSC及S1P非接觸共培養(yǎng)后，利用細(xì)胞實(shí)時(shí)無標(biāo)記系統(tǒng)，考察MSC與S1P聯(lián)用對(duì)損傷細(xì)胞微電子阻抗的增強(qiáng)保護(hù)作用，利用RT-PCR考察兩者對(duì)損傷細(xì)胞中S1P代謝相關(guān)酶的表達(dá)調(diào)控作用。結(jié)果：MSC與S1P聯(lián)用與單獨(dú)使用時(shí)相比，作用靶點(diǎn)和效果有顯著差別，MSC單獨(dú)使用時(shí)僅下調(diào)鞘氨醇激酶1（SphK1）、S1P裂解酶（S1PL）和鞘磷脂合成酶1（SMS1）的表達(dá)，但當(dāng)將MSC和S1P聯(lián)合使用時(shí)，其對(duì)S1PL的下調(diào)作用喪失，而鞘氨醇激酶2（SphK2）和鞘磷脂合成酶2（SMS2）的表達(dá)明顯下調(diào)。結(jié)論：MSC作為一種潛在的治療手段，可以同時(shí)作用于多個(gè)S1P代謝相關(guān)基因，而且其與S1P的聯(lián)用對(duì)相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控并不是簡(jiǎn)單的作用疊加，而是表現(xiàn)出更為顯著的治療結(jié)果。本研究為進(jìn)一步探討MSC與S1P聯(lián)用，通過改善內(nèi)皮屏障的生物學(xué)功能對(duì)急性肺損傷的治療作用及可能的協(xié)同機(jī)理奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合癥；間充質(zhì)干細(xì)胞；鞘氨醇-1-磷酸

急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征（acute lung injury and acute respiratory distress syndrome，ALI/ARDS）在20世紀(jì)60年代首次被公認(rèn)為一種臨床綜合征，表現(xiàn)為低氧血癥、雙肺浸潤(rùn)的嚴(yán)重急性呼吸衰竭，常見于肺炎、膿毒血癥、重大創(chuàng)傷，病死率高達(dá)30%～40%[1]。在迄今為止的臨床試驗(yàn)所評(píng)價(jià)的大批治療藥物中，并沒有哪一種被證實(shí)是有效的，也沒有任何一種可以被推薦為ALI/ARDS的標(biāo)準(zhǔn)治療[2]。ALI/ARDS當(dāng)前的治療方案主要是支持治療，給予肺保護(hù)性通氣以及藥物保守治療[3-4]。機(jī)械通氣是一種必要的和救命的治療手段，但是有可能會(huì)延緩炎癥反應(yīng)，并最終導(dǎo)致肺內(nèi)皮屏障功能障礙。內(nèi)皮屏障功能障礙會(huì)導(dǎo)致通透性增加、富含蛋白質(zhì)的液體外滲和肺水腫，這些都是ALI/ARDS的普遍癥狀[5]。目前尚無旨在改善嚴(yán)重肺水腫患者肺內(nèi)皮屏障功能的臨床治療手段[6]，開發(fā)可保護(hù)內(nèi)皮屏障完整、穩(wěn)定氣體交換的治療手段越來越受到關(guān)注。

鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1-phosphate，S1P）是一種普遍存在的、具有生物活性的神經(jīng)鞘磷脂。它主要存在于血漿和組織中，并具有增強(qiáng)內(nèi)皮屏障抵抗能力的功能，在體內(nèi)是血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性和體液平衡的重要調(diào)節(jié)者。S1P介導(dǎo)的內(nèi)皮屏障增強(qiáng)需要通過S1P受體、激活Gi，以及Rac1這一信號(hào)通路完成[7]。研究發(fā)現(xiàn)S1P在呼吸系統(tǒng)過敏性反應(yīng)中具有重要作用，S1P能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞黏附連接組裝，這是內(nèi)皮屏障保持、避免肺水腫通透性增加的關(guān)鍵[8]。2010年美國(guó)FDA批準(zhǔn)S1P結(jié)構(gòu)類似物FTY720用于治療多發(fā)性硬化。FTY720與S1P在受體結(jié)合活性上略有差異，但二者在高劑量濃度下均有較強(qiáng)的副作用[9]，表明在肺部疾病治療中S1P受體的選擇性以及濃度的穩(wěn)態(tài)控制應(yīng)是需要關(guān)注的焦點(diǎn)。

越來越多的研究表明，生理濃度的S1P對(duì)于維持內(nèi)皮屏障功能具有重要作用，無論是S1P自身還是其結(jié)構(gòu)的類似物，它們?cè)谂R床治療上的局限性都再一次證實(shí)了鞘脂生物穩(wěn)態(tài)的概念，即S1P濃度的穩(wěn)態(tài)平衡決定細(xì)胞的命運(yùn)[10]。S1P作為內(nèi)源性的生物活性分子，是血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性和體液平衡的重要調(diào)節(jié)者，它的合成代謝，以及信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子在ALI/ARDS的治療中依然是潛在的治療靶點(diǎn)和研究熱點(diǎn)。

目前的臨床研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于急性肺損傷產(chǎn)生的嚴(yán)重病理損傷，不太可能有任意單一藥物能逆轉(zhuǎn)這一過程并迅速起到良好的臨床效果。因此，越來越多的目光將ALI/ARDS的治療手段集中在細(xì)胞治療，尤其是間充質(zhì)干細(xì)胞治療方面。

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）是一種多能的，具有自我更新能力的細(xì)胞，最早發(fā)現(xiàn)自骨髓，可以分化為骨、軟骨、脂肪、肌肉等組織。MSC目前已在肝硬化[11]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[12]等疾病的臨床治療中取得了很好的療效，在克羅恩病[13]、外傷性腦損傷[14]、膿毒血癥[15]、急性腎衰竭[16]等疾病的臨床前研究中也取得了治療效果。近年里，也有很多研究報(bào)道了在一些肺部疾病的動(dòng)物模型中，異體移植MSC治療可以減輕肺部病變[17-19]。

近年MSC應(yīng)用于ALI/ARDS的研究大多集中于對(duì)治療效果的評(píng)價(jià)，沒有進(jìn)一步深入討論MSC的免疫調(diào)節(jié)作用對(duì)肺組織細(xì)胞，特別是內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能的影響，MSC對(duì)于S1P代謝的調(diào)控也缺乏系統(tǒng)全面的研究。由于S1P在體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)控制是其改善內(nèi)皮屏障、治療急性肺損傷的前提條件，S1P的合成代謝過程可以受多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，而MSC在多種疾病的應(yīng)用結(jié)果顯示其能夠有效分泌多種生長(zhǎng)因子和炎癥因子，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。此外也有研究表明，S1P能夠促進(jìn)MSC在體外的分化[20]，這就提示我們?cè)贛SC與S1P治療ALI/ARDS過程中是否存在某種協(xié)同作用，一方面發(fā)揮S1P增強(qiáng)內(nèi)皮屏障的生理功能，以及通過MSC的增殖再生及抗炎作用，調(diào)節(jié)宿主對(duì)損傷的免疫應(yīng)答，治療ALI/ARDS；另一方面發(fā)揮S1P對(duì)MSC促分化作用，更好地促進(jìn)MSC的免疫調(diào)節(jié)能力，通過MSC對(duì)S1P相關(guān)受體或代謝酶的表達(dá)，增強(qiáng)S1P功能，促進(jìn)體內(nèi)S1P的穩(wěn)態(tài)平衡，改善內(nèi)皮屏障，治療ALI/ARDS。

在此，我們通過構(gòu)建脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的急性損傷肺內(nèi)皮細(xì)胞模型，考察了MSC在治療急性肺損傷過程中對(duì)S1P代謝相關(guān)酶的表達(dá)調(diào)控作用，探討MSC與S1P聯(lián)用，通過改善內(nèi)皮屏障的生物學(xué)功能對(duì)急性肺損傷的治療作用及可能的協(xié)同機(jī)理，為急性肺損傷的臨床治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

S1P購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，溶解于甲醇中，-20℃保存；LPS（大腸桿菌O55:B5）購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，溶解于生理鹽水中，-20℃保存。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

無菌條件下取新生兒臍帶，浸入含105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的D-Hanks液中，沖洗去除臍靜脈及動(dòng)脈內(nèi)的殘存血，加入膠原酶Ⅳ消化液，37℃消化2 h，過濾獲得MSC單細(xì)胞懸液；細(xì)胞計(jì)數(shù)后按2.5×104～4×104/cm2的密度，用10 mL MSC培養(yǎng)基（Thermo Fisher公司）重懸接種到100 mm的培養(yǎng)皿中，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代培養(yǎng)，7～9 d后根據(jù)細(xì)胞的整體生長(zhǎng)情況和局部密度進(jìn)行第一次傳代；繼續(xù)培養(yǎng)待密度達(dá)80%以上，重復(fù)以上操作，傳代培養(yǎng)至3～5代，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（human pulmonary artery endothelial cells，HPAEC）購(gòu)自ScienCell公司，用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（ScienCell公司），于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5～8代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞的急性損傷

取5～8代HPAEC，按2×104/孔（100μL/孔）接種至16孔E-Plate培養(yǎng)板（ACEA Biosciences公司），同時(shí)加入終濃度分別為0、0.5、1、2、5μmol/ L的LPS，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，通過實(shí)時(shí)檢測(cè)HPAEC微電子阻抗，考察不同濃度LPS對(duì)HPAEC的急性損傷作用效果。

取5～8代HPAEC，按1×105/孔（600μL/孔）接種至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Corning公司），同時(shí)加入終濃度為1μmol/L的LPS，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～12 h，收集不同時(shí)間的細(xì)胞，通過檢測(cè)α腫瘤壞死因子（TNFα）表達(dá)的變化，考察不同時(shí)間條件下LPS對(duì)HPAEC的急性損傷作用效果。

1.4 細(xì)胞共培養(yǎng)

取5～8代HPAEC，按2×104/孔（100μL/孔）接種至16孔E-Plate培養(yǎng)板，加入終濃度為1μmol/ L的LPS，同時(shí)在16孔E-Plate Insert（ACEA Biosciences公司）內(nèi)接種60μL含不同比例（HPAEC∶MSC分別為1∶1、1∶2、1∶4）的MSC，將Insert放入Receiver Plate（含100μL MSC培養(yǎng)基），將EPlate和Receiver Plate置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12 h，棄去E-Plate內(nèi)的培養(yǎng)基，更換為100μL新鮮的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，同時(shí)用對(duì)應(yīng)的Receiver Plate中的MSC培養(yǎng)基將每個(gè)Insert內(nèi)培養(yǎng)基補(bǔ)至60μL，將Insert放置于E-Plate內(nèi)，共培養(yǎng)8～24 h，通過實(shí)時(shí)檢測(cè)HPAEC微電子阻抗，考察MSC對(duì)HPAEC急性損傷的治療效果。

取5～8代HPAEC，按1×105/孔（600μL/孔）接種至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，加入終濃度為1μmol/L的LPS，同時(shí)在24孔Transwell培養(yǎng)板（0.4μm Polyester Membrane，Corning公司）上室內(nèi)接種100μL含不同比例（HPAEC∶MSC分別為1∶1、1∶2、1∶4）的MSC，下室內(nèi)放置600μL的MSC培養(yǎng)基，將24孔細(xì)胞培養(yǎng)板和Transwell培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12 h，棄去細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)的培養(yǎng)基，更換600μL新鮮的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，同時(shí)用對(duì)應(yīng)的Transwell培養(yǎng)板下室的MSC培養(yǎng)基將每個(gè)Transwell上室內(nèi)培養(yǎng)基補(bǔ)齊至100μL，然后將Transwell上室放置于含造模損傷HPAEC的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，共培養(yǎng)8～24 h，收集HPAEC，通過TNFα表達(dá)的變化，考察MSC對(duì)HPAEC急性損傷的治療效果。

1.5 細(xì)胞微電子阻抗檢測(cè)

將16孔E-Plate培養(yǎng)板放置于Xcelligence RTCA DP（ACEA Biosciences公司）系統(tǒng)上，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按照制造商說明書進(jìn)行操作檢測(cè)。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR

收集HPAEC，用RNeasy Mini Kit（Qiagen公司）提取總 RNA，取 1μg RNA為模板，用QuantScript RT Kit（TIANGEN公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后用 SuperReal PreMix SYBR Green（TIANGEN公司）和Bio-Rad iQ 5 Multicolor Real-Time PCR Detection System，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)，所需引物見表1。mRNA相對(duì)表達(dá)水平采用2-ΔΔCt方法計(jì)算。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，多組結(jié)果比較采用單因素方差分析 one-way ANOVA（Dunnett tes），應(yīng)用GraphPad Prism 6.0軟件系統(tǒng)分析。若P＜0.05，則定義為有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 1μmol/L LPS作用于HPAEC后12 h可形成急性損傷

LPS被廣泛用于急性肺損傷模型的制備，但尚無標(biāo)準(zhǔn)方法。已有文獻(xiàn)表明，LPS所致急性損傷會(huì)引起明顯的內(nèi)皮細(xì)胞屏障紊亂、通透性增加，同時(shí)伴隨多種生長(zhǎng)因子和炎癥因子的異常表達(dá)，尤其是TNFα的表達(dá)會(huì)顯著上調(diào)[21]。我們以終濃度分別為0、0.5、1、2、5μmol/L的LPS刺激HPAEC 12 h，利用實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞檢測(cè)（real time cellular analysis，RTCA）系統(tǒng)實(shí)時(shí)檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞微電子阻抗（microelectrode resistance）的變化，以此來反映內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能的變化。結(jié)果表明，與其他濃度相比，1μmol/L的LPS作用于HPAEC后，細(xì)胞的微電子阻抗明顯下降，說明1 μmol/L的LPS對(duì)HPAEC的急性損傷效果更為顯著（圖1）。進(jìn)一步，我們用終濃度為1μmol/L的LPS刺激HPAEC不同時(shí)間后，收集細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TNFα的表達(dá)變化。結(jié)果表明，1μmol/L的LPS刺激HPAEC 12 h后，TNFα的表達(dá)明顯上調(diào)（圖2）。上述結(jié)果說明1μmol/L的LPS刺激HPAEC 12 h后可形成明顯的急性損傷細(xì)胞模型，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

2.2 不同比例的MSC作用于HPAEC對(duì)急性損傷的治療效果不同

在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)接種HPAEC，利用LPS造模損傷后，按細(xì)胞治療時(shí)間不同分為4組，即對(duì)照組和8、16、24 h治療組，分別與MSC進(jìn)行非接觸共培養(yǎng)后收集各組細(xì)胞，RT-PCR考察不同條件下HPAEC內(nèi)TNFα的表達(dá)變化。結(jié)果表明，MSC治療在內(nèi)皮細(xì)胞模型上對(duì)急性損傷的有效治療時(shí)間窗為8 h（圖3）。在此基礎(chǔ)上，按照細(xì)胞治療劑量不同分為4組，即對(duì)照組，HPAEC與MSC接種比例分別為1∶1、1∶2、1∶4治療組，與LPS造模損傷后HPAEC非接觸共培養(yǎng)8 h后收集細(xì)胞，RT-PCR考察不同條件下HPAEC內(nèi)TNFα的表達(dá)變化。結(jié)果表明，細(xì)胞移植劑量并非越多越好，HPAEC與MSC的比例為1∶2時(shí)治療效果最佳（圖4）。同時(shí)細(xì)胞實(shí)時(shí)無標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果也表明，HPAEC與不同數(shù)量比例的MSC共培養(yǎng)后，與對(duì)照組相比，HPAEC的微電子阻抗顯著升高，在10 h左右達(dá)到峰值，HPAEC與MSC比例為1∶2治療組的微電子阻抗值最高。但在15 h后對(duì)照組細(xì)胞的微電子阻抗則明顯高于各治療組（圖5），這一結(jié)果也與TNFα的表達(dá)變化一致，說明不同劑量的MSC作用于HPAEC對(duì)急性損傷的治療效果不同，而且治療時(shí)間為8～10 h最佳。

表1 引物序列

圖1 1μmol/L LPS作用于HPAEC不同時(shí)間后TNFα的表達(dá)變化（*P＜0.05）

圖2 不同濃度LPS作用于HPAEC后細(xì)胞微電子阻抗的變化

圖3 MSC與急性損傷的HPAEC共培養(yǎng)不同時(shí)間后HPAEC內(nèi)TNFα的表達(dá)變化（*P＜0.05，**P＜0.01）

圖4 不同比例的MSC與急性損傷的HPAEC共培養(yǎng)不同時(shí)間后TNFα的表達(dá)變化（*P＜0.05，**P＜0.01）

圖5 不同比例的MSC與急性損傷的HPAEC共培養(yǎng)后微電子阻抗的變化

2.3 0.5μmol/L S1P作用于HPAEC對(duì)急性損傷的治療效果最為明顯

S1P生理濃度為0.2～1.1μmol/L時(shí)，可有效增強(qiáng)血管內(nèi)皮屏障功能。我們利用HPAEC為靶細(xì)胞建立急性損傷模型，在培養(yǎng)環(huán)境中并不存在S1P。為了更好地考察S1P對(duì)急性損傷的保護(hù)作用，及其與MSC在治療急性損傷過程中可能存在的協(xié)同作用，我們將HPAEC接種于16孔E-Plate培養(yǎng)板中，在給予終濃度為1μmol/L LPS刺激的同時(shí)，分別給予終濃度為0、0.5、1、2、5μmol/L的S1P，利用RTCA實(shí)驗(yàn)考察LPS對(duì)HPAEC的急性損傷效果，結(jié)果表明，生理濃度下的S1P（0.5和1 μmol/L）可以有效增強(qiáng)HPAEC的微電子阻抗（圖6）。在此基礎(chǔ)上，我們將HPAEC接種于16孔EPlate培養(yǎng)板中，加入終濃度為1μmol/L的LPS損傷造模，同時(shí)在16孔E-Plate Insert內(nèi)接種2倍數(shù)量的MSC，在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12 h后棄去含LPS的培養(yǎng)基，上下室內(nèi)均加入終濃度為0、0.5、1、2、5μmol/L的S1P共培養(yǎng)，利用RTCA實(shí)驗(yàn)考察對(duì)HPAEC急性損傷的治療效果。結(jié)果表明，生理濃度下的S1P（0.5和1μmol/ L）可以有效增強(qiáng)HPAEC的微電子阻抗，改善LPS對(duì)HPAEC的損傷作用（圖7），而且這2組數(shù)據(jù)都表明，無論是單獨(dú)使用還是與MSC聯(lián)合使用，0.5 μmol/L的S1P對(duì)細(xì)胞微電子阻抗的增強(qiáng)作用均優(yōu)于 1 μmol/L。此外，利用 Transwell實(shí)驗(yàn)，將 1μmol/L LPS損傷12 h后的 HPAEC與2倍數(shù)量的MSC，在終濃度為0.5μmol/L S1P的體系中共培養(yǎng)8 h，收集HPAEC，檢測(cè)TNFα的表達(dá)變化情況，發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)使用MSC相比，MSC與S1P聯(lián)用對(duì)TNFα表達(dá)的下調(diào)作用更為明顯（圖8）。

圖6 不同濃度的S1P與LPS共同作用對(duì)急性損傷后HPAEC微電子阻抗的影響

圖7 不同濃度的S1P與MSC共同作用對(duì)急性損傷后HPAEC微電子阻抗的影響

2.4 MSC與S1P對(duì)急性損傷的協(xié)同治療與MSC單獨(dú)治療的作用靶點(diǎn)不同

為了進(jìn)一步考察MSC與S1P聯(lián)合使用治療HPAEC急性損傷可能存在的協(xié)同機(jī)制，我們利用RT-PCR探討了MSC與S1P單獨(dú)或聯(lián)合使用后，急性損傷的HPAEC中S1P合成代謝關(guān)鍵酶基因的表達(dá)變化。首先收集LPS損傷12 h后的HPAEC，利用RT-PCR考察LPS損傷對(duì)HPAEC內(nèi)鞘氨醇激酶（sphingosine kinase，SphK）SphK1和SphK2，S1P裂解酶（S1P lyase，S1PL），鞘磷脂合成酶（sphingomyelin synthase，SMS）SMS1和SMS2的表達(dá)變化，結(jié)果表明LPS損傷會(huì)明顯上調(diào)上述目的基因的表達(dá)，但它們的表達(dá)上調(diào)水平并無顯著差別（圖9）。這一方面提示我們，在急性肺損傷過程中，S1P相關(guān)基因的表達(dá)變化有可能成為潛在的治療靶點(diǎn)，同時(shí)也說明急性肺損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，針對(duì)單一靶點(diǎn)的治療手段并不能取得最佳治療效果，將MSC的多能作用以及S1P的生理功能聯(lián)合使用，有可能成為一種切實(shí)有效的治療手段。

圖8 MSC與S1P聯(lián)用作用于急性損傷的HPAEC后TNFα的表達(dá)變化（**P＜0.01）

進(jìn)一步，我們將LPS損傷12 h后的HPAEC換液后分組，按照共培養(yǎng)條件區(qū)別，分別為對(duì)照組、MSC治療組和聯(lián)合治療組（其中S1P的終濃度為0.5μmol/L，MSC的數(shù)量是HPAEC的2倍），非接觸共培養(yǎng)8 h后收集細(xì)胞，提取總RNA，RT-PCR檢測(cè)S1P相關(guān)基因的表達(dá)變化情況，結(jié)果表明，與單獨(dú)使用MSC相比，MSC與S1P聯(lián)用對(duì)TNFα表達(dá)的下調(diào)作用更為明顯，提示MSC與S1P聯(lián)用對(duì)治療急性損傷可能具有協(xié)同作用（圖10A）。

圖9 1μmol/L LPS作用于HPAEC 12 h后,RT-PCR檢測(cè)目的基因的表達(dá)變化

圖10 1μmol/L LPS作用于HPAEC 12 h后，換液按共培養(yǎng)條件分組，非接觸共培養(yǎng)8 h后RT-PCR檢測(cè)S1P相關(guān)基因的表達(dá)變化

研究表明，S1P在細(xì)胞內(nèi)的水平是通過其合成與降解之間的平衡來緊密調(diào)節(jié)的，在體內(nèi)神經(jīng)鞘磷脂（sphingomyelin，SM）被催化生成神經(jīng)酰胺，再進(jìn)一步水解生成鞘氨醇，而鞘氨醇可以被鞘氨醇激酶（SphK1和SphK2）催化磷酸化生成S1P。此外S1PL可裂解不可逆降解S1P，通過對(duì)神經(jīng)鞘磷脂合成酶、鞘氨醇激酶和S1PL表達(dá)的調(diào)控，實(shí)現(xiàn)S1P濃度的穩(wěn)態(tài)控制，有望成為急性肺損傷的治療靶點(diǎn)。我們的研究表明，LPS損傷后HPAEC中上述神經(jīng)鞘磷脂合成酶（SMS1、SMS2）、鞘氨醇激酶（SphK1、SphK 2）和S1PL的表達(dá)均有不同程度的上調(diào)，MSC單獨(dú)使用時(shí)，其主要作用于SphK1、S1PL和SMS1，能夠明顯下調(diào)這3個(gè)基因的表達(dá)，但當(dāng)將MSC和S1P聯(lián)合使用時(shí)，對(duì)S1PL的下調(diào)作用喪失，而SphK2和SMS2的表達(dá)明顯下調(diào)（圖10B、C）。通過對(duì)上述幾種S1P相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控結(jié)果的分析，不難發(fā)現(xiàn)，當(dāng)MSC和S1P聯(lián)合使用時(shí)，對(duì)目的基因的表達(dá)調(diào)控結(jié)果并不是簡(jiǎn)單的MSC或S1P單獨(dú)使用時(shí)調(diào)控結(jié)果的疊加，而是表現(xiàn)出更為明顯的下調(diào)結(jié)果。這就提示我們，MSC和S1P在治療急性損傷的過程中可能存在某種協(xié)同作用機(jī)制，進(jìn)一步揭示這種協(xié)同作用機(jī)制有望為急性肺損傷的創(chuàng)新治療提供新的思路。

3 討論

S1P主要存在于血漿和組織中，是一種激動(dòng)劑，具有增強(qiáng)內(nèi)皮屏障的功能，在體內(nèi)是血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性和體液平衡的重要調(diào)節(jié)者。S1P在體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)是通過其合成與降解之間的平衡來緊密調(diào)節(jié)的，在體內(nèi)神經(jīng)鞘磷脂被神經(jīng)磷脂酶催化生成神經(jīng)酰胺（ceramide，Cer），Cer很快被神經(jīng)酰胺酶催化水解生成鞘氨醇，而鞘氨醇可以被鞘氨醇激酶催化磷酸化生成S1P。生理濃度的S1P對(duì)于維持內(nèi)皮屏障功能具有重要作用，研究發(fā)現(xiàn)SphK1的活性與S1P濃度的動(dòng)態(tài)平衡，即SphK1/ S1P軸對(duì)于炎癥信號(hào)的上調(diào)是必需的，而且還涉及先天免疫和適應(yīng)性免疫等各種免疫細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)。已有研究表明SphK1與/或S1P的異常變化會(huì)導(dǎo)致許多炎癥和自身免疫疾病，如哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、敗血癥和炎癥性腸疾病等。

也有研究發(fā)現(xiàn)S1PL能不可逆地降解S1P[22]，急性肺損傷可增強(qiáng)S1PL的表達(dá)、降低肺內(nèi)S1P水平、增強(qiáng)炎癥和導(dǎo)致內(nèi)皮屏障功能障礙。在人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（human lung microvascular endothelial cells，HLMVEC）中通過siRNA下調(diào)S1PL的表達(dá)，可以提高細(xì)胞內(nèi)S1P水平，通過激活Rac1改善急性損傷導(dǎo)致的內(nèi)皮屏障功能障礙[23]。此外，S1P代謝的上游途徑在肺損傷中的作用尚不明確，可能的作用機(jī)制是通過調(diào)節(jié)SMS1和SMS2的活化及神經(jīng)鞘磷脂合成途徑來實(shí)現(xiàn)的[24]。研究發(fā)現(xiàn)SMS2的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑（D609）可迅速增強(qiáng)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能，抑制LPS刺激的內(nèi)皮細(xì)胞通透性的增高，并具有一定的量效關(guān)系[25]。上述研究表明通過調(diào)控S1P代謝相關(guān)酶的活性及S1P穩(wěn)態(tài)，能夠有效改善肺內(nèi)皮細(xì)胞屏障。

我們發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)HPAEC損傷后，SphKs、S1PL和SMSs的表達(dá)顯著上調(diào)，當(dāng)MSC單獨(dú)使用時(shí)僅下調(diào)SphK1的表達(dá)，對(duì)SphK2的表達(dá)并無顯著影響，而當(dāng)MSC與S1P聯(lián)用時(shí)會(huì)同時(shí)下調(diào)SphK1和SphK2的表達(dá)，這說明MSC能夠通過調(diào)控SphKs的表達(dá)及其活性，發(fā)揮治療急性肺損傷的作用。此外MSC單獨(dú)使用時(shí)，其主要作用于S1PL和SMS1，能夠明顯下調(diào)這2個(gè)基因的表達(dá)，但當(dāng)將MSC和S1P聯(lián)合使用時(shí)，對(duì)S1PL的下調(diào)作用喪失，而SMS2的表達(dá)明顯下調(diào)。這些結(jié)果提示我們，MSC和S1P在治療急性損傷的過程中可能存在某種協(xié)同作用機(jī)制。

臨床研究表明，對(duì)于ALI/ARDS產(chǎn)生的嚴(yán)重病理損傷，不太可能有單一靶點(diǎn)或藥物可以逆轉(zhuǎn)這一過程，并迅速起到良好的臨床效果，創(chuàng)新的多靶點(diǎn)協(xié)同治療機(jī)制可能是解決該難題的有效方案。而干細(xì)胞治療從本質(zhì)上而言，并不是像單一藥物那樣作為一種療法作用于單一靶點(diǎn)，而是作為多種療法一起對(duì)來自患病組織的生物遇險(xiǎn)信號(hào)做出多種反應(yīng)而發(fā)揮作用。我們發(fā)現(xiàn)MSC作用于LPS損傷的HPAEC后，可影響多個(gè)S1P代謝相關(guān)酶基因的表達(dá)，改善內(nèi)皮屏障，治療急性肺損傷。同時(shí)S1P作為內(nèi)源性生物活性分子，是血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性和體液平衡的重要調(diào)節(jié)者。在急性肺損傷過程中，對(duì)S1P合成代謝過程中關(guān)鍵酶的表達(dá)調(diào)控，對(duì)于改善內(nèi)皮屏障機(jī)制具有重要作用。我們的研究表明MSC與S1P都具有改善急性肺損傷的作用，但MSC與S1P聯(lián)用對(duì)S1P代謝相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控并不是MSC或S1P單獨(dú)使用時(shí)調(diào)控結(jié)果的簡(jiǎn)單疊加，而是更為明顯的下調(diào)結(jié)果，這就提示我們MSC和S1P在治療急性損傷的過程中可能存在某種協(xié)同作用機(jī)制。進(jìn)一步探討MSC與S1P聯(lián)用、通過改善內(nèi)皮屏障的生物學(xué)功能對(duì)急性肺損傷的治療作用及可能的協(xié)同機(jī)理，有望為急性肺損傷的臨床治療提供新思路。

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Expression Regulation of S1P Metabolic Related Enzymes in Acute Injury HPAECs by MSC Combined with S1P

LIU Hui-Ying1,LI Wen-Fei3,ZHANG Zi-Li1,2,ZHENG Jing1,HENG Zhi-Zhi1, LI Pu-Yuan1,YUAN Xin1,NIU Wen-Kai1,BAI Chang-Qing1*
1.Department of Respiratory and Critical Care Diseases,307th Hospital of PLA,Beijing 100071;2.Anhui Medical University,Hefei 230032;3.School of Aerospace Medicine，F(xiàn)ourth Military Medical University,Xi'an 710032; China

Objective:To explore the regulatory effect of mesenchymal stem cells（MSC）combined with sphingosine 1-phosphate（S1P）in regulating the expression of S1P metabolic related enzymes during the pathogenesis of acute lung injury.Methods:LPS-stimulated acute injury model of pulmonary endothelial cells was developed,followed by non-contact co-cultured with MSC and S1P,and then the protective effects and expression regulation roles of MSC and S1P on the microelectronic impedance of injury cells and the S1P metabolic related enzymes were investigated by real-time cellular analysis system and RT-PCR respectively.Results:Compared with theMSC alone,the combination treatment showed significantly impact on regulatory targets.The expression of SphK1, S1PL and SMS1 was downregulated by MSC alone,while the downregulation of S1PL was completely lost and the expression of Sphk2 and SMS2 was markedly reduced during the combined use of MSC and S1P.Conclusion:As a potential treatment of acute lung injury,MSC can act on multiple S1P metabolic related genes simultaneously. S1P combination has a synergistic expression regulation effect on the related genes and hence shows a more promising therapy way.This study laid the experimental foundation for the further investigation of the therapeutic effect and potential synergistic mechanism of MSC and S1P combinatory treatment of acute lung injury by improving the biological function of endothelial barrier.

acute lung injury and acute respiratory distress syndrome;mesenchymal stem cells;sphingosine 1-phosphate

R25;Q78

A

1009-0002（2017）03-0256-09

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.005

2016-11-21

北京市自然科學(xué)基金（7164284）

劉慧瑩（1982-），女，博士，主治醫(yī)師，（E-mail）liuhuiying1982@sina.com

柏長(zhǎng)青，（E-mail）baicq307@163.com

*Corresponding author,E-mail:baicq307@163.com