侯小娟，陳鴻斌，袁旭東，王雙，仇瑋祎，孫志偉

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071；2.北方戰(zhàn)區(qū) 空軍參謀部門(mén)診部，遼寧 沈陽(yáng) 110015

抗人OX40單克隆抗體的制備和初步鑒定

侯小娟1，陳鴻斌1，袁旭東2，王雙1，仇瑋祎1，孫志偉1

1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071；2.北方戰(zhàn)區(qū) 空軍參謀部門(mén)診部，遼寧 沈陽(yáng) 110015

目的：獲得全人源抗人OX40特異性抗體候選株，為相關(guān)藥物開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。方法：依托本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的大容量全合成全人源噬菌體單鏈抗體庫(kù)平臺(tái)，以O(shè)X40為抗原進(jìn)行固相篩選，經(jīng)過(guò)3輪條件漸進(jìn)嚴(yán)苛的篩選后，陽(yáng)性克隆得到富集；將其中富集效果最好的一株單鏈抗體scFv-1改造成全抗體（IgG1）形式，改造成功的重組質(zhì)粒按照一定比例轉(zhuǎn)染HEK293-F細(xì)胞進(jìn)行抗體的瞬時(shí)表達(dá)；基于AKTA系統(tǒng)對(duì)全抗體進(jìn)行純化，將純化得到的全抗體重命名為OX40mab-1。通過(guò)ELISA、間接免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)等試驗(yàn)分別驗(yàn)證OX40mab-1與抗原的結(jié)合活性、特異性、血清穩(wěn)定性；通過(guò)BIAcore 3000初步測(cè)定抗體親和力。結(jié)果：3輪篩選后得到1株富集率達(dá)95%的單鏈抗體，改造成全抗體形式后，與抗原OX40的結(jié)合EC50為0.015μmol/L；該抗體與其他無(wú)關(guān)抗原均不結(jié)合，特異性良好；37℃血清放置15 d后，與抗原依具有較好的結(jié)合活性，血清穩(wěn)定性良好；經(jīng)BIAcore 3000初步測(cè)定該抗體親和力為251 nmol/L。結(jié)論：獲得1株理化性質(zhì)良好、特異性較好的抗OX40全人源單克隆抗體OX40mab-1，具有繼續(xù)開(kāi)發(fā)價(jià)值。

OX40；單克隆抗體；噬菌體抗體；特異性

靶向CTLA-4和PD-1的單克隆抗體在臨床研究中取得重大成功后，研究者開(kāi)始嘗試以其他免疫檢查點(diǎn)為靶標(biāo)研發(fā)藥物，靶向T細(xì)胞表面分子治療性抗體的研發(fā)更是成為熱點(diǎn)。相比于T細(xì)胞表面?zhèn)鹘y(tǒng)的免疫檢查點(diǎn)CTLA-4、PD-1等共抑制分子來(lái)說(shuō)，OX40屬于T細(xì)胞表面的共刺激分子，且廣泛表達(dá)于炎癥和腫瘤部位[1-2]的T細(xì)胞表面。OX40的激活能明顯促進(jìn)CD4+/CD8+T細(xì)胞的增殖、存活、分化及記憶T細(xì)胞的產(chǎn)生和維持，并且能在活化的T、B細(xì)胞間進(jìn)行雙向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，對(duì)OX40/OX40L通路進(jìn)行合理的激活或阻斷干預(yù)有可能達(dá)到治療相關(guān)疾病的效果。因此，以O(shè)X40為靶標(biāo)研發(fā)激活型或阻斷型抗體，對(duì)于腫瘤及自身免疫性疾病的治療都具有廣闊的應(yīng)用前景。

OX40（又稱CD134、TNFRSF4、ACT35）屬于腫瘤壞死因子受體超家族（TNFRSF），于1987年被發(fā)現(xiàn)[3]，是相對(duì)分子質(zhì)量約50×103的Ⅰ型跨膜糖蛋白，共含有277個(gè)氨基酸殘基（胞漿49個(gè)，胞外186個(gè)）[4]。OX40是一個(gè)相對(duì)保守的分子，其胞外段由3個(gè)完整的半胱氨酸富集區(qū)CRD1、CRD2、CRD3和1個(gè)不完整的半胱氨酸富集區(qū)CRD4組成，配體結(jié)合區(qū)主要位于CRD2、CRD3[5]，OX40/ OX40L通路的激活可以顯著促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和存活、相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及記憶T細(xì)胞的產(chǎn)生和維持[6-11]。其配體OX40L以三聚體的形式在抗原提呈細(xì)胞（APC）表面呈誘導(dǎo)性表達(dá)，在協(xié)助激活T細(xì)胞的同時(shí)還能促進(jìn)B細(xì)胞的活化及抗體的產(chǎn)生[12-13]，兩者能夠在活化的T細(xì)胞和B細(xì)胞之間進(jìn)行雙向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

目前，在腫瘤免疫治療方面，至少有4種OX40激動(dòng)劑進(jìn)入臨床研究階段，即MEDI6469、MEDI6383、MEDI0562和9B12，其適應(yīng)癥包括轉(zhuǎn)移性黑素瘤、肝癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌和頭頸癌等。9B12是鼠源IgG，已結(jié)束臨床Ⅰ期試驗(yàn)；其余3個(gè)均是由Med Immune公司研發(fā)的人源化單抗，均在進(jìn)行臨床Ⅰ期試驗(yàn)。AgonOx公司還研發(fā)了一種OX40L-ILZ-hFc重組融合蛋白，可以實(shí)現(xiàn)OX40L的三聚化，模擬體內(nèi)天然狀態(tài)下的受體配體結(jié)合模式。但是，迄今尚無(wú)全人源抗OX40激動(dòng)型抗體進(jìn)入臨床研究階段。

本研究以O(shè)X40為靶標(biāo)，依托本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的全合成人源性噬菌體單鏈抗體庫(kù)固相篩選平臺(tái)，通過(guò)3輪條件逐漸嚴(yán)苛的固相篩選后，得到一株與抗原結(jié)合活性較好，特異性、血清穩(wěn)定性良好，親和力為251 nmol/L的全人源抗OX40候選單抗分子OX40mab-1，具有一定的開(kāi)發(fā)潛力和應(yīng)用價(jià)值，可以進(jìn)一步進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證及其他相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，為相關(guān)疾病的治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

HEK293-F、A549細(xì)胞由本室保存；293T細(xì)胞株由陳惠鵬研究員實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans1-Blue、Top10購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；大容量全合成噬菌體單鏈抗體庫(kù)由本室構(gòu)建并保存；原始輔助噬菌體M13KO7購(gòu)自Invitrogene公司并由本室保存；重組抗原OX40-his、表達(dá)載體pCMV3-OX40-GFP購(gòu)自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司；OX40L-hFc購(gòu)自上海近岸科技有限公司；檢測(cè)抗體anti-M13-HRP為GE公司產(chǎn)品；Goat-anti-human IgG-HRP、Goat-antimouse IgG-FITC購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Goat-anti-human IgG-PE購(gòu)自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司；Prime star DNA聚合酶、T4DNA連接酶為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品；限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ、AflⅡ、NheⅠ、BsrGⅠ為NEB公司產(chǎn)品；其余常規(guī)耗材均購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院條件處；測(cè)序服務(wù)由本所提供。

PCR儀、CO2培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀（Thermo）；顯微鏡（Nikon）；離心機(jī)（Sigma）；核酸電泳儀、分光光度計(jì)、蛋白電泳儀（Bio-Rad）；AKTA蛋白純化儀（Amersham Biosciences）；洗板機(jī)（BioTAK）；BIAcore 3000（GE Healthcare）；流式細(xì)胞儀（BD）。

1.2 抗原鑒定及抗OX40特異性抗體的篩選

PBS稀釋抗原溶液，分別加入還原（還原劑為β巰基乙醇）和非還原蛋白上樣緩沖液（5×），混勻，沸水煮5 min，離心，各取10μL樣品和蛋白marker上樣，電泳采用10%SDS-PAGE。

用PBS稀釋OX40至30μg/mL，1 mL/管，4℃過(guò)夜包被免疫管；次日，用2%牛血清白蛋白（BSA）于37℃封閉免疫管2 h，噬菌體抗體庫(kù)用封閉液（與免疫管封閉液相同，另加0.1%Tween-20）于37℃封閉30 min；4℃結(jié)合過(guò)夜；PBS、PBST洗滌數(shù)次；加入1 mL Glycine-HCl（pH2.2）洗脫；向洗脫液中加入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌Trans1-Blue，37℃、150 r/min感染1 h；取1%感染后的菌液涂于2YT-CTG平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，次日收集全部菌落；取適量菌液投入100 mL 2YT-CTG液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)至D600nm為0.5時(shí)，按M13KO7∶Trans1-Blue=20∶1加入輔助噬菌體M13KO7，37℃、150 r/min感染 1 h，加入 0.15 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；次日，離心收取培養(yǎng)上清，加入1/5體積的PEG8000沉淀劑，沉淀噬菌體；沉淀重懸于PBS緩沖液中，取少量測(cè)定噬菌體滴度，其余凍存于-80℃?zhèn)溆谩５?、3輪篩選過(guò)程與第1輪篩選步驟基本一致，不同之處在于：①OX40包被濃度分別降低為10和1μg/mL；②洗滌強(qiáng)度提高；③OX40篩選封閉劑1%酪蛋白和2% BSA交替使用。

1.3 篩選后單克隆鑒定

挑取經(jīng)3輪篩選后的單克隆于96孔深孔板中，37℃搖床培養(yǎng)至D600nm為0.5，加入輔助噬菌體M13K07感染后，加入等體積2YT培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡那霉素，0.15 mmol/L IPTG），30℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜，次日離心收取上清。PBS稀釋抗原至5 μg/mL，50μL/孔，4℃包被過(guò)夜。次日，加入5%脫脂奶粉，37℃封閉2 h；加入5%脫脂奶粉預(yù)封閉的單克隆噬菌體抗體上清，37℃靜置結(jié)合l h；PBST洗滌數(shù)次后加入HRP標(biāo)記的小鼠抗M13抗體，37℃靜置40 min；PBST洗滌數(shù)次；加入OPD顯色液，室溫靜置顯色；用2 mol/L H2SO4終止顯色；酶標(biāo)儀檢測(cè)D492nm值，630 nm作為參考波長(zhǎng)。

1.4 陽(yáng)性克隆的全抗體改造

對(duì)陽(yáng)性單鏈抗體測(cè)序，分析測(cè)序結(jié)果并進(jìn)行全抗體改造，即將單鏈抗體輕、重鏈可變區(qū)基因克隆到人全抗體表達(dá)載體中。全抗體真核表達(dá)載體分別為pABG1（γ1重鏈）和pABL（λ輕鏈）。通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增單鏈抗體VH和VL基因，重鏈、輕鏈特異性擴(kuò)增正反向引物分別為H3F（5'-GCGCCCCTTAAGGGCGTGCAGTGCGAAGTGCAATTG GTGGAAAGC-3'，酶切位點(diǎn)是AflⅡ）、HR（5'-CG GTGCTAGCGCTCGACACGGTCACCAGAGT-3'，酶切位點(diǎn)是NheⅠ）和L3F（5'-CGCGTGTACAGGAA GCTGGGCCAGCTACGAACTGACCCAGCCGC-3'，酶切位點(diǎn)是BsrGⅠ）、LR（5'-CGCGAAGCTTGGTGC CACCGCCAAACACAT-3'，酶切位點(diǎn)是HindⅢ）；雙酶切后連接到人全抗體真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒后送測(cè)序。

1.5 抗體在HEK293-F細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)及純化

將測(cè)序正確的全抗體輕重鏈質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Top10，37℃培養(yǎng)過(guò)夜；挑取單克隆37℃培養(yǎng)過(guò)夜，用去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑提取輕重鏈質(zhì)粒，并用分光光度計(jì)定量；吸取輕重鏈質(zhì)粒、轉(zhuǎn)染試劑293fectin、Opti-MEM制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物并轉(zhuǎn)染HEK293-F細(xì)胞；培養(yǎng)4 d后離心收集培養(yǎng)上清，0.45μm濾膜過(guò)濾上清，用Protein A純化柱純化，純化后進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。

1.6 全抗體的結(jié)合活性鑒定

1.6.1 ELISA驗(yàn)證OX40mab-1與重組融合蛋白OX40的結(jié)合活性 以O(shè)X40L為參照，ELISA驗(yàn)證OX40mab-1與OX40在分子水平上的結(jié)合活性。稀釋抗原OX40至5μg/mL，4℃過(guò)夜包被酶聯(lián)板，加入稀釋好的OX40mab-1，終濃度從低到高依次為0.15、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20μg/mL，每孔各做1個(gè)復(fù)孔；以Goat-anti-human IgG-HRP為二抗檢測(cè)全抗體與OX40的結(jié)合活性。

1.6.2 免疫熒光驗(yàn)證OX40mab-1與細(xì)胞表面抗原的結(jié)合活性 首先用表達(dá)載體pCMV3-OX40-GFP瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后顯微鏡下觀察OX40-GFP的表達(dá)情況，加入稀釋好的OX40mab-1，全抗體濃度為10μg/mL，以Goat-anti-human IgG-PE為二抗檢測(cè)OX40mab-1與細(xì)胞表面OX40的結(jié)合活性。

1.6.3 流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證OX40mab-1與細(xì)胞表面抗原的結(jié)合活性和特異性 向轉(zhuǎn)染了pCMV3-OX40-GFP的 293T細(xì) 胞 中 加 入 稀 釋 好 的OX40mab-1，106細(xì)胞/樣品，OX40mab-1梯度稀釋到終濃度分別為0.4、0.08、0.016μg/mL，二抗為Mouse-anti-human IgG-APC，特異性對(duì)照細(xì)胞為293T（未轉(zhuǎn)染pCMV3-OX40-GFP）、Nalm6、A549，以平均熒光強(qiáng)度（MFI）表示OX40mab-1與細(xì)胞表面OX40的結(jié)合活性和特異性強(qiáng)度。

1.7 全抗體OX40mab-1的特異性鑒定

采用ELISA方法檢測(cè)抗體OX40mab-1的特異性。以O(shè)X40為抗原，EGFR、VEGF、CD47、PDL1、TNF、PLGF、TIM3為對(duì)照抗原，4℃過(guò)夜包被酶聯(lián)板，加入純化的OX40mab-1抗體，以Goat-anti-human IgG-HRP為二抗檢測(cè)全抗體的特異性。

1.8 全抗體的血清穩(wěn)定性研究

在超凈工作臺(tái)內(nèi)用0.22μm濾膜過(guò)濾高濃度抗體樣品，用無(wú)菌胎牛血清（未滅活）稀釋抗體樣品至100μg/mL，分裝，封口膜封口，置于濕盒內(nèi)，37℃溫箱放置，分別于第0、3、6、9、12、15 d取出樣品于-20℃凍存以備檢測(cè)。采用ELISA檢測(cè)，OX40mab-1稀釋濃度從低到高依次為0.75、1.5、3.125、6.25、12.5、25、50、100μg/mL，每孔做1個(gè)復(fù)孔，以第0 d（分裝后即-20℃凍存）樣品為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.9 全抗體的親和力測(cè)定

將抗原用緩沖液稀釋至1μg/mL，偶聯(lián)至預(yù)先包被有Prot-G的CM5芯片上；抗體OX40mab-1作為流動(dòng)相，用HBS-EP緩沖液做1/2濃度梯度稀釋，濃度范圍為25～800μg/mL，進(jìn)行測(cè)試；完成一個(gè)反應(yīng)后，對(duì)芯片進(jìn)行再生；再生后繼續(xù)偶聯(lián)同樣目標(biāo)值的待檢測(cè)抗體，進(jìn)行下一輪反應(yīng)；實(shí)驗(yàn)完畢，扣除空白對(duì)照和無(wú)關(guān)抗體對(duì)照響應(yīng)值，用BIA evaluation軟件分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 抗原鑒定及全合成人源性噬菌體抗體庫(kù)的篩選

挑選適當(dāng)?shù)目乖抢檬删w抗體庫(kù)進(jìn)行固相篩選的關(guān)鍵步驟，抗原的質(zhì)量、純度均會(huì)對(duì)篩選造成巨大影響。

為獲得可用于篩選的抗原，通過(guò)SDS-PAGE鑒定抗原大小及純度，結(jié)果顯示購(gòu)買(mǎi)所得的重組人OX40-his融合蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為45×103，符合理論值且純度較高（圖1），可用于篩選。

以O(shè)X40為抗原，對(duì)噬菌體單鏈抗體庫(kù)進(jìn)行3輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”固相篩選，特異性噬菌體抗體在篩選過(guò)程中得到富集。在篩選過(guò)程中，抗原包被量逐輪遞減，由第1輪的30μg/mL遞減到第3輪的1μg/mL。洗滌條件第l輪為PBST洗10次、PBS洗5次，第2輪為PBST洗15次、PBS（含0.2 mol/L NaCl）洗10次、PBS洗5次，在洗滌時(shí)間和力度上都有所增加，以進(jìn)一步增加篩選壓力。

采用ELISA對(duì)第3輪篩選獲得的單鏈抗體進(jìn)行鑒定，共挑取288個(gè)克隆，經(jīng)鑒定得到ELISA顯色值大于1.0的169株陽(yáng)性克?。▓D2），這些陽(yáng)性克隆在噬菌體水平上特異性結(jié)合OX40而與無(wú)關(guān)抗原（1%酪蛋白）不結(jié)合。測(cè)序結(jié)果顯示scFv-1的富集率高達(dá)95%，框架為λ3H3，其輕、重鏈CDR3區(qū)的序列分別為L(zhǎng)-CDR3（AQDSDHVPW）和H-CDR3（HYIYSTSFDD）。

2.2 全抗體改造及表達(dá)、純化

圖1 OX40篩選前蛋白大小及純度鑒定

圖2 λ3H3噬菌體單鏈抗體庫(kù)第3輪篩選所獲克隆ELISA檢測(cè)結(jié)果

本室構(gòu)建的噬菌體抗體庫(kù)是單鏈抗體庫(kù)，抗體以單鏈抗體的形式展示在噬菌體表面，因此需要將單鏈抗體改造為全抗體（IgG1）的形式，以進(jìn)一步對(duì)抗體進(jìn)行鑒定。PCR擴(kuò)增輕重鏈可變區(qū)得到600～700 bp的片段（圖3），再通過(guò)酶切、連接克隆到人全抗真核表達(dá)載體中，測(cè)序表明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確；轉(zhuǎn)染HEK293-F細(xì)胞，表達(dá)上清經(jīng)Protein A柱純化，純化后樣品經(jīng)SDS-PAGE證實(shí)獲得了OX40mab-1全抗體樣品（圖4）。

2.3 全抗體結(jié)合活性鑒定

2.3.1 ELISA驗(yàn)證OX40mab-1與重組融合蛋白OX40-his在分子水平上的結(jié)合活性 為驗(yàn)證所得抗體與抗原在分子水平上的結(jié)合活性，以O(shè)X40L-hFc融合蛋白為對(duì)照，以二者的結(jié)合曲線表示OX40mab-1、OX40L-hFc與OX40的結(jié)合活性，并進(jìn)行比較，結(jié)果如圖5，兩者與OX40的結(jié)合活性基本相當(dāng)，并沒(méi)有數(shù)量級(jí)上的差異，其EC50分別為0.015、0.024μmol/L。

圖3 單鏈抗體輕重鏈可變區(qū)PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果

圖4 OX40mab-1純化后的SDS-PAGE鑒定

圖5 OX40mab-1與抗原OX40結(jié)合的ELISA鑒定結(jié)果

2.3.2 間接免疫熒光驗(yàn)證OX40mab-1與細(xì)胞表面抗原的結(jié)合活性 為檢測(cè)所得抗體與細(xì)胞表面抗原的結(jié)合活性，用OX40表達(dá)載體pCMV3-OX40-GFP瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，以GFP熒光為指示，獲得OX40+293T細(xì)胞，進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)，結(jié)果如圖6，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的pCMV3-OX40-GFP在293T表面表達(dá)良好，且OX40mab-1、OX40L-hFc均與293T表面的OX40有良好結(jié)合，huIgG組和空白對(duì)照組細(xì)胞熒光強(qiáng)度極弱，幾乎檢測(cè)不到。

2.3.3 流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證OX40mab-1與細(xì)胞表面抗原的結(jié)合活性和特異性 為驗(yàn)證所得抗體與細(xì)胞表面抗原的結(jié)合活性和特異性，首先對(duì)轉(zhuǎn)染pCMV-OX40-GFP的293T細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)，結(jié)果如圖7，轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞表面OX40表達(dá)量明顯提高，且分2群，一群OX40高表達(dá)，熒光強(qiáng)度較強(qiáng)；另一群低表達(dá)，熒光強(qiáng)度較弱。

OX40mab-1與轉(zhuǎn)染后293T細(xì)胞表面OX40的結(jié)合活性較強(qiáng)，當(dāng)OX40mab-1抗體濃度為0.4μg/ mL時(shí)檢測(cè)到的平均熒光強(qiáng)度最高，且平均熒光強(qiáng)度隨抗體濃度的下降而減弱，說(shuō)明OX40mab-1抗體濃度與結(jié)合的平均熒光強(qiáng)度具有劑量關(guān)系，空白對(duì)照和huIgG組熒光強(qiáng)度極弱（圖8）。

以293T（未轉(zhuǎn)染）、Nalm6和A549為對(duì)照細(xì)胞檢測(cè)，OX40mab-1的特異性較好，與這幾種細(xì)胞均不結(jié)合（圖9）。

2.4 全抗體的特異性鑒定

圖6 OX40mab-1與293T-OX40GFP結(jié)合的免疫熒光鑒定

為驗(yàn)證OX40mab-1的特異性，采用ELISA檢測(cè)全抗體與OX40的特異性結(jié)合，對(duì)照抗原包括EGFR、VEGF、CD47、PDL1、TNF、PLGF、TIM3。結(jié)果顯示純化后的OX40mab-1與OX40結(jié)合特異性良好（圖10），只特異性結(jié)合OX40抗原，與其他對(duì)照抗原基本不結(jié)合。

2.5 全抗體血清穩(wěn)定性鑒定

為驗(yàn)證OX40mab-1的血清穩(wěn)定性，用50%無(wú)菌胎牛血清（未滅活）稀釋OX40mab-1并于37℃溫箱放置，分別于第0、3、6、9、12、15 d取出樣品于-20℃凍存以備檢測(cè)。ELISA結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)15 d的37℃血清放置后，該抗體與抗原依然具有較好的結(jié)合活性，證明該抗體具有良好的血清穩(wěn)定性（圖11）。

2.6 全抗體親和力測(cè)定

圖7 pCMV3-OX40-GFP轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞流式檢測(cè)結(jié)果

圖8 OX40mab-1與293T-OX40GFP細(xì)胞結(jié)合的流式檢測(cè)

圖9 OX40mab-1與293T、Nalm6、A549細(xì)胞結(jié)合特異性流式檢測(cè)

圖10 OX40mab-1與抗原結(jié)合特異性的ELISA檢測(cè)

圖11 OX40mab-1血清穩(wěn)定性的ELISA檢測(cè)

為檢測(cè)OX40mab-1與OX40的親和力，采用BIAcore 3000測(cè)定抗體與重組OX40抗原結(jié)合的親和力，用BIA evaluation軟件分析結(jié)果。結(jié)果顯示OX40mab-1具有較高的結(jié)合速率（Ka=2.6×105mol/L），但其解離速率也較高（Kd=65 mmol/L），因此親和力為251 nmol/L（圖12）。

圖12 BIAcore 3000測(cè)定OX40mab-1的親和力

3 討論

我們經(jīng)過(guò)3輪條件逐漸嚴(yán)苛的噬菌體抗體庫(kù)篩選后得到1株富集良好的克隆，即OX40mab-1，改造成全人抗體形式并順利表達(dá)純化。經(jīng)驗(yàn)證，該抗體與重組蛋白OX40及細(xì)胞表面抗原OX40的結(jié)合活性良好；與無(wú)關(guān)抗原、細(xì)胞表面其他蛋白和不表達(dá)OX40的對(duì)照細(xì)胞均不結(jié)合，特異性良好；37℃血清放置15 d后該抗體與抗原OX40仍有較好的結(jié)合，證明其血清穩(wěn)定性良好；BIAcore 3000測(cè)得該抗體的親和力為251 nmol/L，已相當(dāng)接近于天然狀態(tài)的OX40/OX40L單體親和力150 nmol/L。相比于鼠單抗和人源化單抗，全人源抗體具有更低的免疫原性和更長(zhǎng)的半衰期。

由于靶向T細(xì)胞表面的激動(dòng)型抗體是一個(gè)探索較少同時(shí)研究難度較大的領(lǐng)域，機(jī)遇和風(fēng)險(xiǎn)并存。OX40的激活能夠明顯促進(jìn)CD4+/CD8+T細(xì)胞的增殖、存活、分化及記憶T細(xì)胞的產(chǎn)生和維持，進(jìn)而提高T細(xì)胞的抗腫瘤免疫應(yīng)答，這使得OX40成為潛在的良好的抗腫瘤免疫刺激靶標(biāo)。若能獲得T細(xì)胞激活功能良好的全人源抗OX40激動(dòng)型抗體，將具有廣闊的腫瘤治療前景。但由于激動(dòng)型抗體對(duì)于抗原抗體的結(jié)合表位和抗體結(jié)構(gòu)要求較高，又由于OX40/OX40L的三聚體結(jié)合模式，使得高親和力、結(jié)構(gòu)正確且功能活性良好的抗體極難獲得，從而使全人源抗OX40激動(dòng)型抗體的研發(fā)具有較大的挑戰(zhàn)性。

但同時(shí)，因OX40/OX40L通路能夠在活化的T細(xì)胞和APC之間提供雙向轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，使OX40L在協(xié)同OX40刺激T細(xì)胞存活的同時(shí)又能促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生高效價(jià)的抗體及抗體的類(lèi)別轉(zhuǎn)換，因此在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化癥、潰瘍性結(jié)腸炎等自身免疫疾病及移植物抗宿主病患者中，通過(guò)OX40抑制性抗體阻斷OX40/OX40L通路，可以下調(diào)免疫系統(tǒng)對(duì)自身抗原的免疫應(yīng)答，平衡機(jī)體內(nèi)Th1、Th2類(lèi)細(xì)胞因子的含量。目前已有一株全人源抗OX40阻斷型抗體進(jìn)入臨床Ⅱ期研究階段。因此，即使不能獲得激動(dòng)型的抗OX40抗體，篩選中獲得的阻斷型抗體也可以考慮用于針對(duì)自身免疫病的候選藥物研發(fā)。

與配體相近的親和力以及全人源單抗的高安全性是該抗OX40單抗候選分子的優(yōu)勢(shì)，但其發(fā)揮功能活性的類(lèi)型仍須進(jìn)一步驗(yàn)證。我們的后續(xù)研究將會(huì)著眼于對(duì)該抗體進(jìn)行親和力成熟和生物學(xué)活性鑒定，確定其激活性或抑制性生物學(xué)活性，從而明確本研究獲得的OX40mab-1是否可作為腫瘤或自身免疫病治療的候選分子，為進(jìn)一步藥物開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

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Preparation and Preliminary Identification of Human Anti-OX 40 M onoclonal Antibody

HOU Xiao-Juan1,CHEN Hong-Bin1,YUAN Xu-Dong2, WANG Shuang1,QIU Wei-Yi1*,SUN Zhi-Wei1*
1.Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100071;
2.Out-Patient Department of Air Force Staff in Northern Theater Command,Shenyang 110015;China

Objective:To harvest a fully human anti-human OX40 specific antibody for developing related drug.Methods:We chose OX40 as a target antigen to screen specific antibodies from the fully human single-chain antibody phage library and got the enriched positive clones after 3 rounds of solid screening.The best enriched single-chain antibody scFv-1 was redesigned to be a fully human antibody,and the corresponding recombinant plasmid was transfected into HEK293-F cells for transient expression.The final prodcut,named as OX40mab-1,was purified based on AKTA system,and the binding activity,specificity,serum stability were verified via ELISA,indirect immunofluorescence,and flow cytometry respectively．The affinity of OX40mab-1 was determined via BIAcore 3000．Results:After 3 rounds of screening,a single chain antibody with an enrichment rate of 95%was harvested,and was reconstructed into a fully human antibody OX40mab-1 The binding EC50of OX40mab-1 to OX40 was 0.015μmol/L.OX40mab-1 did not bind to unrelated antigens,showing its specificity,and its good binding activity to antigen retained after 15 days in serum at 37℃,proving its serum stability and its affinity was 251 nmol/L determined by BIAcore 3000．Conclusion:An anti-OX40 fully human monoclonal antibody with good binding activity,specificity,and serum stability was obtained,and deserves for further development．

OX40;monoclonal antibody;phage displayed antibody;specificity

R392.1

A

1009-0002（2017）03-0242-07

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.003

2017-03-10

侯小娟（1991-），女，碩士研究生，（E-mail）13051578182@163.com

仇瑋祎，（E-mail）qiuweiyi831@163.com；孫志偉，（E-mail）szwyhhh@aliyun.com

*Co-corresponding authors,QIU Wei-Yi,E-mail:qiuweiyi831@163.com;SUN Zhi-Wei,E-mail:szwyhhh@aliyun.com