常瑞剛，劉麗霞

（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030）

溫度對基因組DNA提取的影響

常瑞剛，劉麗霞

（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030）

為了探討溫度對基因組DNA提取質(zhì)量的影響，以荷斯坦牛血液為實(shí)驗(yàn)材料，采用DNA提取試劑盒法在4℃和常溫下提取牛血液DNA。結(jié)果表明：在4℃下提取的DNA質(zhì)量要明顯高于常溫下所提取的。該研究對于提高DNA提取質(zhì)量具有一定的參考價(jià)值。

溫度；質(zhì)量；DNA提取

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，在動物遺傳育種 研究以及基因工程等分子水平的操作均需從生物體中提取基因組DNA。提取基因組DNA的方法種類繁多，目前主要分成兩種，一是經(jīng)典的酚－氯仿抽提法，二是試劑盒法。酚－氯仿抽提法價(jià)格便宜，但操作繁瑣，而且獲得基因組DNA質(zhì)量欠佳；試劑盒法的優(yōu)點(diǎn)是簡便、快捷，且DNA提取效率較高［1］。目前試劑盒法應(yīng)用十分廣泛，在提取基因組DNA的過程中，DNA的質(zhì)量受多種因素的影響，提取的DNA質(zhì)量會影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，其中溫度是影響其質(zhì)量的一個重要因素。因此，本實(shí)驗(yàn)采用DNA提取試劑盒法在4℃和常溫下提取牛血液DNA，旨在探討溫度對DNA提取質(zhì)量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣本 本實(shí)驗(yàn)以寧夏賀蘭山奶業(yè)有限公司同一奶牛場荷斯坦牛為實(shí)驗(yàn)動物。用醫(yī)用采血管經(jīng)尾靜脈采血10 mL，－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 自動平衡離心機(jī)Labofuge 200和高速冷凍離心機(jī)D－37520（德國Eppendorf公司），低溫冰箱MDF－U541（日本SANYO電子有限公司），凝膠數(shù)字成像系統(tǒng)BiO－BEST 140E（美國西蒙子公司）等。

1.2 方法

采用DNA試劑盒法分別在4℃和常溫條件下提取牛血液DNA，操作步驟如下。

（1）取牛血液20 μL，不足200 μL可加緩沖液GA補(bǔ)足。

（2）加入20 μL蛋白酶K溶液，混勻。

（3）加入200 μL緩沖液GB，充分顛倒混勻，70℃放置10 min，溶液應(yīng)變清亮，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。

（4）加入200 μL無水乙醇，充分振蕩混勻15 s，此時(shí)可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。

（5）將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。

（6）向吸附柱CB3中加入500 μL緩沖液GD，12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。

（7）向吸附柱CB3中加入700 μL漂洗液PW，12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。

（8）向吸附柱CB3中加入500 μL漂洗液PW，12 000 r/min離心30 s，倒掉廢液。

（9）將吸附柱CB3放回收集管中，12 000 r/min離心2 min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

（10）將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加25 μL ddH2O（預(yù)熱），室溫放置2～5 min，12 000 r/min離心2 min，將溶液收集到離心管中。

2 結(jié)果與分析

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析所提取的DNA含量均較高。但相比之下4℃所提取的DNA含量更高，濃度更大，除樣品條帶外未出現(xiàn)其他條帶，表明所提取的DNA未受外源核酸和蛋白質(zhì)的污染，無斷裂，且分子大小相同。6個試驗(yàn)樣品遷移率幾乎相同。見圖1。

圖1 不同溫度條件下提取的DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

3 討論

從動物血液中獲得高質(zhì)量的DNA是進(jìn)行分子遺傳育種研究所必需的。在血液中，DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合形成染色體，存在于細(xì)胞核中，因此，在提取DNA時(shí)既要將蛋白質(zhì)等物質(zhì)除盡，又要盡可能保持DNA分子的完整性，即DNA帶不斷裂，且無外源核酸污染。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，4℃下所提取的DNA濃度更大，含量更高；而常溫下所提取的DNA濃度雖然也較高，但條帶不整齊且點(diǎn)樣孔有亮度，表明有外源核酸和蛋白質(zhì)的污染。本實(shí)驗(yàn)采用DNA提取試劑盒法，在常溫條件下提取DNA，由于離心機(jī)高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生大量熱量，導(dǎo)致部分基因組DNA降解；而在4℃條件下提取DNA，溫度低，血液細(xì)胞釋放的內(nèi)源核酸酶活性較低，因此能夠保證DNA的完整性。

綜上所述，在4℃條件下提取可獲得較高質(zhì)量的基因組DNA。

［1］ 覃莉，江莉，李慕軍，等.人類精液DNA提取方法的探討及影響因素分析［J］.廣西醫(yī)學(xué)，2013（4）：406-410.

S823.2

A

2095-3887（2017）03-0073-02

10.3969/j.issn.2095－3887.2017.03.021

2017-03-28

西北民族大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（31920170029）；西北民族大學(xué)本科生科研創(chuàng)新項(xiàng)目

常瑞剛（1995-），男，在讀本科生。

劉麗霞（1983-），女，高級實(shí)驗(yàn)師，博士，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究工作。