任衛(wèi)合，王麗萍，劉容秀，張 麗

（西北民族大學生命科學與工程學院，蘭州 730030）

研究簡報

中國荷斯坦奶牛FASN基因部分序列多態(tài)性分析

任衛(wèi)合，王麗萍，劉容秀，張 麗

（西北民族大學生命科學與工程學院，蘭州 730030）

利用PCR-SSCP技術(shù)，對中國荷斯坦奶牛脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)ASN）基因第34外顯子進行多態(tài)性分析。結(jié)果顯示：該區(qū)域存在A、B兩種等位基因和AA、BB、AB三種基因型，其中等位基因A和B的頻率分別為0.890 8和0.109 2，基因型AA、BB和AB的頻率分別為0.908 0、0.011 5和0.195 4。A為優(yōu)勢等位基因，AA為優(yōu)勢基因型。群體遺傳學分析發(fā)現(xiàn)，荷斯坦奶牛FASN基因的有效等位基因數(shù)（Ne）、遺傳雜合度（He）、遺傳純合度（Ho）和多態(tài)信息含量（PIC）分別為0.184 5、0.195 7、0.804 3和0.175 6?？ǚ綑z驗表明，該群體已經(jīng)極顯著地偏離了Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＜0.01）。說明中國荷斯坦奶牛FASN基因exon34區(qū)存在遺傳多態(tài)性。

FASN基因；基因多態(tài)性；PCR-SSCP；中國荷斯坦奶牛

脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)ASN）是由FASN基因編碼的一種基本代謝酶類，對控制動物體脂沉積和乳脂脂肪酸合成代謝具有重要意義［1］。該酶主要表達在哺乳動物的肝臟和脂肪組織中［2-3］，負責催化乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A合成一種長鏈飽和軟脂酸［4］。研究發(fā)現(xiàn)，脂肪酸合成酶直接受FASN基因表達情況的影響，若FASN基因的堿基序列發(fā)生突變，牛全乳中的脂肪酸含量就可能發(fā)生變化，對牛的泌乳性能產(chǎn)生影響［5］。Roy等［6］將牛FASN基因定位于19號染色體上，發(fā)現(xiàn)其包含42個外顯子，編碼2 513個氨基酸殘基，且含有多個SNPs。研究表明，F(xiàn)ASN基因缺失的小鼠胚胎會在其胚胎發(fā)育早期死亡，F(xiàn)ASN基因突變的小鼠則會在其發(fā)育的不同時期死亡，表明脂肪酸合成酶對胚胎發(fā)育也有重要作用［7］。褚敏等［8］研究推測，F(xiàn)ASN基因不僅影響牛肉脂肪酸的組成及含量，亦對牦牛肉的脂肪量及食用品質(zhì)有影響，可作為牦牛肉質(zhì)性狀標記輔助選擇的有效分析標記。

目前國內(nèi)對荷斯坦奶牛FASN基因的研究還很少，本研究利用PCR-SSCP技術(shù)研究中國荷斯坦奶牛FASN基因第34外顯子多態(tài)性，旨在豐富荷斯坦奶牛FASN基因庫，并為泌乳基因、胚胎發(fā)育基因和肉質(zhì)性狀基因的篩選提供分子理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及基因組DNA提取

血樣采自寧夏賀蘭山奶業(yè)有限公司的87頭中國荷斯坦奶牛，用醫(yī)用采血管靜脈采血，每頭10 mL，-20℃保存。采用苯酚-氯仿抽提法從備用冷凍血樣中提取總基因組DNA，去離子水溶解稀釋，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設(shè)計與PCR擴增

根據(jù)GenBank中牛FASN基因的mRNA序列（登錄號AF285607）設(shè)計1對特異性引物，用于擴增荷斯坦奶牛FASN基因序列。引物序列Forward：5′-CCAGACCTTAATTTGCCAATCCTC-3′，Reverse：3′CCCTCTAAAGCCGTCCTCACCA-5′，引物由大連寶生物公司合成，擴增區(qū)域從15 906 bp開始，包括了FASN基因外顯子34的全部序列，目的片段216 bp。

以提取的DNA為模板，PCR擴增FASN基因。PCR擴增總反應(yīng)體系為20 μL，其中模板DNA 0.8 μL，上下游引物各0.4 μL，Taq PCR MasterMix 11 μL，ddH2O 7.4 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預變性4 min；94℃變性30 s，54℃退火30s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后置于4℃冷藏保存，以備SSCP分析。

1.3 SSCP檢測與等位基因序列的回收測定

取3.0 μL的PCR產(chǎn)物與7.0 μL變性上樣緩沖液（0.025%溴酚藍、98%去離子甲酰胺、10 mmol/L EDTA、0.025%二甲苯氰）混合，98℃變性10 min后再立即冰浴10 min。將變性后的PCR產(chǎn)物點樣至12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上（Acr∶Scr=29∶1），160V電壓室溫電泳4h。銀染法顯帶，并確定其基因型。PCR產(chǎn)物經(jīng)過SSCP確定基因型后，純合子PCR產(chǎn)物用試劑盒回收后直接送北京華大公司測序。而雜合子個體參照Hu等［9］介紹的方法進行處理。

1.4 統(tǒng)計分析

利用Popgene32軟件計算出FASN基因不同突變位點的等位基因頻率、基因型頻率、有效等位基因數(shù)（Ne）、遺傳雜合度（He）、遺傳純合度（Ho）和多態(tài)信息含量（PIC），并對該群體進行Hardy-Weinberg平衡檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 荷斯坦奶牛FASN基因PCR擴增結(jié)果

對303頭荷斯坦奶牛的DNA樣品PCR擴增后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠（100 V，30 min）電泳檢測后均得到一條如圖1所示的特異性好、條帶清晰、長度約為216 bp的產(chǎn)物，與預期的目的片段大小一致，可用于SSCP檢測。

圖1 荷斯坦奶牛FASN基因exon34區(qū)域PCR擴增結(jié)果

2.2 PCR-SSCP檢測及序列測定結(jié)果

中國荷斯坦奶牛FASN基因exon34序列區(qū)域共檢測到A和B兩種等位基因，共形成AA、BB、AB三種基因型（圖2），其中等位基因A和B均具純合型個體。

圖2 荷斯坦奶牛FASN基因exon34區(qū)域SSCP檢測結(jié)果

2.3 遺傳參數(shù)分析

荷斯坦奶牛FASN基因exon34區(qū)基因頻率、基因型頻率以及各遺傳多態(tài)性指標見表1和表2。等位基因A和B的頻率分別為0.890 8和0.109 2，AA、BB和AB基因型頻率分別為0.908 0、0.195 4和0.011 5。本研究中，荷斯坦奶牛FASN基因的有效等位基因數(shù)（Ne）、遺傳雜合度（He）、遺傳純合度（Ho）和多態(tài)信息含量（PIC）分別為0.1845、0.1957、0.8043和0.1756。PIC值小于0.25，屬于低度多態(tài)，說明該位點較為保守?？ǚ綑z驗表明該群體已經(jīng)極顯著地偏離了Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＜0.01）。

表1 荷斯坦奶牛FASN基因exon34區(qū)基因頻率和基因型頻率

表2 遺傳多態(tài)性分析

3 討論

近年來，國內(nèi)外有關(guān)FASN基因的多態(tài)性報道相對較少。Abe等［10］在日本黑牛FASN基因編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)8個SNPs。Chirala等［7］在牛FASN基因中檢測到了5個多態(tài)位點。褚敏等［8］在甘南牦牛、天祝白牦牛和大通牦牛FASN基因的第3內(nèi)含子檢測到1個多態(tài)位點。歐陽建華等［11］在雞FASN基因最后1個內(nèi)含子發(fā)現(xiàn)2個多態(tài)位點。Abiel［12］在西農(nóng)薩能奶山羊的FASN基因中檢測到3個多態(tài)位點。

本研究通過對荷斯坦牛FASN基因exon34區(qū)進行PCR－SSCP分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)A、B兩個等位基因，其基因頻率分別為0.890 8、0.109 2，A為優(yōu)勢基因，試驗群體已經(jīng)極顯著地偏離了Hardy－Weinberg平衡狀態(tài)（P＜0.01），說明該位點受到漂變、選擇和引種等因素的影響。這與Roy等［6］和Chirala等［7］的研究結(jié)果存在一定的差異；而與馬彥南等［5］的研究結(jié)果較為一致。造成這種結(jié)果的原因可能是試驗群體的環(huán)境和種群存在差異，也可能是中國荷斯坦牛含有地方黃牛品種血統(tǒng)。本研究在試驗群體中僅發(fā)現(xiàn)一個個體為BB型，這可能是由于樣本量限制的緣故。在遺傳多態(tài)性分析中，等位基因數(shù)（Ne）、多態(tài)信息含量（PIC）和雜合度（He）都是群體內(nèi)遺傳變異的測度，其值的高低反映了群體遺傳變異的大小，遺傳變異大，數(shù)值越高。本研究試驗群體PIC值小于0.25，呈低度多態(tài)，這與武秀香等［2］的研究結(jié)果存在一定差異，可能是由于A等位基因?qū)伤固鼓膛５纳L發(fā)育、泌乳性能有正效應(yīng)，所以在長期的人工育種過程中受到正向選擇、處于優(yōu)勢地位的緣故。

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S823.2

A

2095-3887（2017）03-0067-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.03.018

2017-04-13

任衛(wèi)合（1997-），男，在讀本科生。

張麗（1980-），女，副教授，博士。研究方向：牛羊遺傳育種。