陳建康，嚴(yán)瑜，潘曉莉，張泓，林帆，朱鵬立，柯俊

（福建省立醫(yī)院，福建省醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院1.老年科，福建省臨床老年病研究所；2.急診內(nèi)科，福建省急診醫(yī)學(xué)研究所，福州350001）

膜聯(lián)蛋白A1對(duì)糖尿病大鼠心功能及炎癥反應(yīng)的影響

陳建康1，嚴(yán)瑜1，潘曉莉1，張泓1，林帆1，朱鵬立1，柯俊2

（福建省立醫(yī)院，福建省醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院1.老年科，福建省臨床老年病研究所；2.急診內(nèi)科，福建省急診醫(yī)學(xué)研究所，福州350001）

目的探討膜聯(lián)蛋白A1（Annexin A1）對(duì)糖尿病大鼠心功能及腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）的影響。方法將24只SD大鼠隨機(jī)均分為正常對(duì)照組、糖尿病組；利用高糖高脂飲食飼養(yǎng)及較小劑量鏈脲佐菌素（30 mg/kg）誘導(dǎo)造成2型糖尿病模型，2組分別予以普通喂食、高糖高脂喂食；于第8周末用彩色多普勒超聲檢測(cè)左心室舒張末期容積（LVEDV）、左心室收縮末期容積（LVESV）、二尖瓣舒張?jiān)缙诜逯邓俣?二尖瓣舒張晚期峰值速度（e/a）比值、左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、每搏射血量（SV）；第0、4、8周采用實(shí)時(shí)PCR測(cè)定血中Annexin A1表達(dá)，采用酶聯(lián)免疫分析法測(cè)定血中TNF-α、IL-1β。結(jié)果與正常對(duì)照組對(duì)比，糖尿病組LVEDV、e/a、SV明顯下降，Annexin A1明顯上升（P＜0.05），8周后糖尿病組Annexin A1顯著下降（P＜0.01）；與正常對(duì)照組對(duì)比，糖尿病組TNF-α、IL-1β上升明顯（P＜0.05），8周后上升更明顯（P＜0.01）；糖尿病組Annexin A1與TNF-α、IL-1β負(fù)相關(guān)（r分別為-0.73、-0.71，P＜0.01）。結(jié)論Annexin A1可改善糖尿病大鼠心功能，Annexin A1改善糖尿病大鼠心功能可能與炎癥反應(yīng)有關(guān)。

膜聯(lián)蛋白A1；心功能；2型糖尿病；炎癥反應(yīng)

心臟功能改變與心肌病變密切相關(guān)，2型糖尿病導(dǎo)致的心肌病變是心力衰竭的重要原因之一，也是心血管病主要的死亡原因之一。目前認(rèn)為2型糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制與高血糖、氧化應(yīng)激、炎癥等有關(guān)。炎癥反應(yīng)在糖尿病心肌病中發(fā)揮重要的作用，它增強(qiáng)氧化應(yīng)激使活性氧（reactive oxygen，ROS）增加，炎性細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β）分泌增多，炎癥細(xì)胞（粒細(xì)胞/單核細(xì)胞）聚集及遷移，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）分泌增多，造成心肌細(xì)胞肥大、間質(zhì)纖維化、微血管病變，從而形成糖尿病心肌病變。已有研究［1-4］證實(shí)通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)可以改善糖尿病心肌病變，從而達(dá)到改善心功能的目的。

膜聯(lián)蛋白A1（Annexin A1）是體內(nèi)重要的抗炎物質(zhì)，與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分化和增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞凋亡、信號(hào)調(diào)控、凋亡細(xì)胞吞噬清除等許多細(xì)胞生命活動(dòng)有密切關(guān)系［5-6］。有報(bào)道［7］表明2型糖尿病伴腎功能不全患者血清中Annexin A1水平下降，Annexin A1在體內(nèi)可能抑制糖尿病腎病的進(jìn)展，但在糖尿病心臟病中Annexin A1的作用不明。本研究探討Annexin A1對(duì)糖尿病大鼠心功能及炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

近交系SPF級(jí)SD大鼠6周齡24只，體質(zhì)量（200±10）g，由福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供；鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；兔抗大鼠TNF-α、IL-1β購(gòu)于南京建成生物工程研究所；小動(dòng)物超聲多普勒（GE Healthcare），RNA提取試劑、引物、RT-PCR試劑盒購(gòu)于大連寶生物公司；Annexin A1單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 分組和動(dòng)物模型建立：大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（12只）、糖尿病組（12只）。對(duì)照組不接受任何處理，釆用普通詞料喂養(yǎng)；糖尿病組釆用高糖高脂飼料飼養(yǎng)。1個(gè)月后，糖尿病組大鼠一次性腹腔注射STZ（30 mg/kg），3 d后監(jiān)測(cè)血糖，連續(xù)2 d血糖值均＞16.7 mmol/L認(rèn)定造模成功，之后繼續(xù)喂養(yǎng)8周。

1.2.2 超聲多普勒檢測(cè)心功能：8周末用水合氯醛麻醉大鼠，由心臟彩超室醫(yī)生操作，采用小動(dòng)物超聲多普勒，探頭頻率為10 MHz，測(cè)量左心室舒張末期容積（left ventricular end-diastolic volume，LVEDV）、左心室收縮末期容積（left ventricular endsystolic volume，LVESV）、二尖瓣舒張?jiān)缙诜逯邓俣?二尖瓣舒張晚期峰值速度（e/a）比值、左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、每搏射血量（stroke volume，SV）。

1.2.3 血液TNF-α、IL-1β檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)第0、4、8周按照試劑盒步驟采用酶聯(lián)免疫分析法測(cè)定各組大鼠血中TNF-α、IL-1β水平。

1.2.4 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)血液Annexin A1：實(shí)驗(yàn)第0、4、8周測(cè)定血中Annexin A1表達(dá)，按Trizol法提取總RNA，參照說(shuō)明書(shū)對(duì)Annexin A1進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，正反引物序列分別為5’-GCAATGAAGGAGA TAAG-3’和5’-ATTCCTCTTCAGTTC-3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度分別為315 bp、327 bp，采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，自動(dòng)凝膠系統(tǒng)拍照，并進(jìn)行圖像分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析，多變量之間采用相關(guān)關(guān)系進(jìn)行相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組與糖尿病組心功能比較

與正常對(duì)照組比較，糖尿病組LVEDV、e/a、SV明顯下降（均P＜0.05），LVEDV、LVEF略有下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見(jiàn)表1。

2.2 對(duì)照組與糖尿病組Annexin A1表達(dá)比較

與對(duì)照組比較，糖尿病組Annexin A1表達(dá)明顯上升（P＜0.05），隨著時(shí)間延長(zhǎng)糖尿病組Annexin A1表達(dá)逐漸下降，8周后與對(duì)照組比較Annexin A1明顯下降（P＜0.01），見(jiàn)表2。

表1 2組大鼠心功能指標(biāo)比較（x±s）Tab.1Comparison of cardiac function between the control and diabetic groups

表1 2組大鼠心功能指標(biāo)比較（x±s）Tab.1Comparison of cardiac function between the control and diabetic groups

1）compared with control group，P＜0.05.

GroupnLVEDV（mL）LVESV（mL）LVEF（%）e/aSV（mL）Control120.781±0.061 20.211±0.051 373.220±5.051 71.209±0.048 10.570±0.081 2 DM120.580±0.059 31）0.180±0.049 469.320±4.051 40.810±0.052 11）0.400±0.067 31）

2.3 對(duì)照組與糖尿病組炎癥指標(biāo)比較

與對(duì)照組比較，糖尿病組TNF-α、IL-1β水平升高（P＜0.05）；隨著時(shí)間延長(zhǎng)TNF-α、IL-1β水平逐漸上升，糖尿病組8周時(shí)上升更明顯（P＜0.01），見(jiàn)表3。

2.4 Annexin A1與TNF-α、IL-1β的相關(guān)分析

糖尿病組大鼠Annexin A1表達(dá)與TNF-α、IL-1β相關(guān)分析結(jié)果顯示，Annexin A1與炎癥程度呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.73、-0.71，均P＜0.01），隨著時(shí)間延長(zhǎng)Annexin A1水平逐漸降低，而炎癥指標(biāo)逐步升高。

表2 2組大鼠Annexin A1表達(dá)比較Tab.2 Comparison of annexin A1 expression level between the control and diabetic groups

表2 2組大鼠Annexin A1表達(dá)比較Tab.2 Comparison of annexin A1 expression level between the control and diabetic groups

1）P＜0.05 compared with control group；2）P＜0.01 compared with control group.

Groupn Annexin A1 0 week4 weeks8 weeks Control120.28±0.0510.29±0.0440.30±0.046 DM120.44±0.0351）0.41±0.0670.21±0.0322）

表3 2組大鼠炎癥指標(biāo)比較（Tab.3Comparison of the inflammation index between the control and diabetic groups（）

表3 2組大鼠炎癥指標(biāo)比較（Tab.3Comparison of the inflammation index between the control and diabetic groups（）

1）P＜0.05 compared with control group；2）P＜0.01 compared with control group.

IL-1β 0 week4 weeks8 weeks0 week4 weeks8 weeks Control1223.28±5.0524.38±4.4528.53±5.3415.38±3.5316.82±4.2317.27±4.63 DM1244.54±6.671）68.23±6.781）87.56±7.672）28.58±5.451）38.26±4.781）50.83±7.572）GroupnTNF-α

3 討論

2型糖尿病發(fā)病率高、并發(fā)癥多，臨床危害性極大。2型糖尿病與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、高血壓、房顫、心力衰竭等心血管疾病密切相關(guān)，糖尿病可以誘發(fā)或者促進(jìn)心力衰竭進(jìn)展［8］。糖尿病導(dǎo)致的非缺血性心肌病是心力衰竭重要原因，臨床上早期表現(xiàn)為心臟舒張功能障礙，晚期則主要表現(xiàn)為心臟收縮功能障礙［9］。目前研究認(rèn)為，糖尿病發(fā)展過(guò)程中伴隨炎癥反應(yīng)強(qiáng)度增加，而在糖尿病心肌病變過(guò)程中必然伴隨著炎癥反應(yīng)的增強(qiáng)［10］。因此通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)可能改善糖尿病心肌病變，從而進(jìn)一步改善心功能。

Annexin A1是膜聯(lián)蛋白超家族中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的成員，又稱依鈣蛋白、磷脂酶A2抑制蛋白，依賴鈣離子與細(xì)胞膜磷脂結(jié)合，表達(dá)于機(jī)體多數(shù)器官、組織，尤其是粒細(xì)胞/單核細(xì)胞中表達(dá)水平高。Annexin A1在體內(nèi)具有強(qiáng)大抗炎作用，與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。既往Annexin A1研究多集中于感染、腫瘤等，近些年有研究［11-14］表明Annexin A1與動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、腦梗死、肺肝纖維化等相關(guān)。TNF-α、IL-1β是主要由單核-巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)中起重要作用。

本研究探討糖尿病大鼠血中Annexin A1表達(dá)以及其對(duì)心功能、TNF-α、IL-1β的影響。結(jié)果顯示，糖尿病對(duì)大鼠心功能的影響主要以舒張功能障礙為主，符合早期糖尿病心肌病表現(xiàn)，這與既往研究結(jié)果一致［15-17］。糖尿病組大鼠實(shí)驗(yàn)開(kāi)始Annexin A1表達(dá)上升明顯，隨著病程進(jìn)展Annexin A1逐漸下降，說(shuō)明在糖尿病初期體內(nèi)存在炎癥反應(yīng)，Annexin A1增加發(fā)揮抗炎作用，糖尿病病情發(fā)展過(guò)程中，炎癥反應(yīng)強(qiáng)度增加，Annexin A1表達(dá)受到抑制。本研究結(jié)果顯示糖尿病組大鼠心功能惡化，Annexin A1表達(dá)受到抑制，提示糖尿病心肌病變與Annexin A1有關(guān)，因此推測(cè)Annexin A1表達(dá)增加可能改善糖尿病大鼠心肌病變。同樣，結(jié)果顯示對(duì)照組大鼠Annexin A1和TNF-α、IL-1β隨著時(shí)間延長(zhǎng)變化不明顯，但糖尿病組TNF-α、IL-1β隨著時(shí)間的延長(zhǎng)TNF-α、IL-1β逐漸升高，說(shuō)明糖尿病病情發(fā)展過(guò)程伴隨炎癥反應(yīng)的增強(qiáng)。Annexin A1發(fā)揮抗炎作用重要機(jī)制之一是抑制磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2），PLA2是炎癥介質(zhì)合成釋放的關(guān)鍵酶，是調(diào)節(jié)炎癥過(guò)程的中心，PLA2被抑制后，中性粒細(xì)胞表面整合素和脂多糖的表達(dá)受到抑制，從而抑制中性粒細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β。本研究發(fā)現(xiàn)Annexin A1與TNF-α、IL-1β呈負(fù)相關(guān)，提示隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，Annexin A1受到抑制，炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，進(jìn)而說(shuō)明糖尿病大鼠心功能減退與Annexin A1抑制、炎癥反應(yīng)增強(qiáng)相關(guān)。因此推測(cè)糖尿病大鼠通過(guò)內(nèi)源性Annexin A1發(fā)揮抗炎作用，Annexin A1表達(dá)可改善糖尿病大鼠心肌病變。

本研究存在一定的局限性，無(wú)心肌組織樣本及未檢測(cè)心肌Annexin A1表達(dá)。擬開(kāi)展后續(xù)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)基因敲除Annexin A1、補(bǔ)充外源性Annexin A1進(jìn)一步驗(yàn)證Annexin A1改善糖尿病大鼠心肌病變的作用。

［1］SANSKRITI K，GURINDER BS，MADHU K.Nitric oxide synthases and diabetic cardiomyopathy［J］.Biophysics，2014，43（10）：29-34. DOI：org/10.1016/j.niox.2014.08.004.

［2］SUN X，CHEN RC，YANG ZH，et al.Taxifolin prevents diabetic cardiomyopathy in vivo and in vitro by inhibition of oxidative stress and cell apoptosis［J］.Food Chem Toxicol，2014，63（1）：221-232.DOI：10.1016/j.fct.2013.11.013.

［3］MILES J，DE B，KARINA H，et al.Therapeutic targeting of oxidative stress with coenzyme Q10 counteracts exaggerated diabetic cardiomyopathy in a mouse model of diabetes with diminished PI3K（p110α）signaling［J］.Free Rad Biol Med，2015，87（6）：137-147. DOI：10.1016/j.freeradbiomed.2015.04.028.

［4］ZOLTAN V，ZOLTAN G，LUCAS L，et al.Interplay of oxidative，nitrosative/nitrative stress，inflammation，cell death and autophagy in diabetic cardiomyopathy［J］.Biochimica Biophysica Acta，2015，1852（2）：232-242.DOI：10.1016/j.bbadis.2014.06.030.

［5］VINCENZO B，EMMA M，RODERICK J，et al.Annexin A1 mediates hydrogen sulfide properties in the control of inflammation［J］.J Pharmacol Exp，2014，351（11）：96-104.DOI：10.1124/jpet.114. 217034.

［6］YUAN HY，ERIC M，MICHELLE L.Annexin A1：potential for glucocorticoid sparing in RA［J］.Nat Rev Rheumatol，2013，9（8）：595-603.DOI：10.1038/nrrheum.2013.126.

［7］PIETRANI NT，F(xiàn)ERREIRA CN，RODRIGUES KF，et al.Annexin A1 concentrations is decreased in patients with diabetes type 2 and nephropathy［J］.Clin Chim Acta，2014，25（436）：181-182.DOI：10.1016/j.cca.2014.05.027.

［8］MARCINKIEWICZ A，OSTROWSKI S，DRZEWOSKI J.Can the onset of heart failure be delayed by treating diabetic cardiomyopathy?［J］.Diabetol Metab Syndr，2017，4（4）：9-21.DOI：10.1186/s13098-017-0219-z.

［9］MSCHUTT K，MARX N.Diabetes and heart failure：update 2017［J］.Herz，2017，4（10）：32-42.DOI：10.1007/s00059-017-4558-1.

［10］RAJESH M，BATKAI S，KECHRID M，et al.Cannabinoid 1 receptor promotes cardiac dysfuntion oxidative stress，inflammation，and fibrosis in diadetic cardiomyopathy［J］.Diabetes，2012，61（3）：716-727.DOI：10.2337/db11-0477.

［11］DE JONG RJ，PAULIN N，LEMNITZER P，et al.Protective aptitude of annexin A1 in arterial neointima formation in atherosclerosis-prone mice-brief report［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2017，37（2）：312-315.DOI：10.1161/ATVBAHA.116.308744.

［12］EGLE S，SIMON M，HELEN C，et al.Annexin A1 in the brainundiscovered roles?［J］.Trends Pharmacol Sci，2008，29（3）：135-142.DOI：10.1016/j.tips.2007.12.003.

［13］PG T，TPT F，ACS A，et al.Annexin A1 mimetic peptidecontrols the inflammatory and fibrotic effects of silica particles in mice［J］. Br J Pharmacol，2015，172（2）：3058-3071.DOI：10.1111/bph. 13109.

［14］QIN CX，KEITH DB，SALVATORE P，et al.Reperfusion-induced myocardial dysfunction is prevented by endogenous annexin-A1 and its N-terminal-derived peptide Ac-ANX-A1 2-26［J］.Br J Pharmacol，2013，168（2）：238-252.DOI：10.1111/j.1476-5381.2012. 02176.x.

［15］PARK J，KIM JS，KIM SH，et al.Subclinical left ventricular diastolic dysfunction and incident type 2 diabetes risk：the Korean Genome and Epidemiology Study［J］.Cardiovasc Diabetol，2017，16（1）：36-38.DOI：10.1186/s12933-017-0519-5.

［16］HODZIC A，RIBAULT V，MARAGNES P，et al.Decreased regional left ventricular myocardial strain in type 1 diabetic children：a first sign of diabetic cardiomyopathy?［J］.Transl Int Med，2016，4（2）：81-87.DOI：10.1515/jtim-2016-0025.

［17］LIU XY，LIU FC，DENG CY，et al.Left ventricular deformation associated with cardiomyocyte Ca（2+）transients delay in early stage of low-dose of STZ and high-fat diet induced type 2 diabetic rats［J］.BMC Cardiovasc Disord，2016，16（16）：41-43.DOI：10.1186/ s12872-016-0220-8.

（編輯 武玉欣）

Effect of Annexin A1 on the Cardiac Function and Inflammatory Response of Diabetic Rats

CHEN Jiankang1，YAN Yu1，PAN Xiaoli1，ZHANG Hong1，LIN Fan1，ZHU Pengli1，KE Jun2

（1.Department of Geriatric Medicine，F(xiàn)ujian Institute of Clinical Geriatrics，F(xiàn)ujian Provincial Hospital，Provincial Clinical College，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350001，China；2.Department of Emergency，F(xiàn)ujian Provincial Institute of Emergency Medicine，F(xiàn)ujian Provincial Hospital，Provincial Clinical College，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350001，China）

Objective To study the effect of annexin A1 on cardiac function，tumor necrosis factor α（TNF-α），and interleukin 1β（IL-1β）in diabetic rats.MethodsTwenty-four SD rats were randomly divided into normal control and diabetic groups.The type 2 diabetes model was induced with a high-glucose and high-fat diet and administration of low-dose streptozotocin.Left ventricular end-diastolic volume（LVEDV），left ventricular end-systolic volume（LVESV），peak velocity of early diastolic mitral-to-late diastolic peak velocity（e/a）ratio，left ventricular ejection fraction（LVEF），and stroke volume（SV）were measured by using color Doppler ultrasonography at the end of week 8.The expression levels of TNF-α and IL-1β in blood were measured by using enzyme-linked immunosorbent assay，and the expression level of annexin A1 in blood was measured at weeks 0，4，and 8 by using real-time polymerase chain reaction.ResultsCompared with the normal control group，the diabetic group had decreased LVEDV，e/a，and SV（P＜0.05）.The annexin A1 expression level in the diabetic group decreased significantly after 8 weeks（P＜0.01）. The TNF-α and IL-1β levels in the diabetic group were significantly higher than those in the normal control group（P＜0.05）and increased significantly after 8 weeks（P＜0.01）.Annexin A1 level correlated with the TNF-α and IL-1β levels in the diabetic group（P＜0.01）.ConclusionAnnexin A1 expression shows an anti-inflammatory effect that improved the cardiac function of diabetic rats.

Annexin A1；cardiac function；type 2 diabetes；inflammation

R544.1

A

0258-4646（2017）06-0532-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.06.012

福建省自然科學(xué)基金（2016J01431）

陳建康（1975-），男，副主任醫(yī)師，碩士.

柯俊，E-mail：68223384@qq.com

2016-12-13

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：