周敏，李會(huì)榮，李祥明，楊在賓，楊維仁，張桂國(guó)，姜淑貞*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安271018；2.山東省飼料質(zhì)量檢驗(yàn)所，山東濟(jì)南250022）

飼料衛(wèi)生

鐮刀菌毒素對(duì)全價(jià)日糧發(fā)酵淀粉和揮發(fā)性脂肪酸的影響

周敏1，李會(huì)榮2，李祥明2，楊在賓1，楊維仁1，張桂國(guó)1，姜淑貞1*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安271018；2.山東省飼料質(zhì)量檢驗(yàn)所，山東濟(jì)南250022）

本試驗(yàn)以鐮刀菌毒素為研究對(duì)象，研究鐮刀菌毒素對(duì)全價(jià)日糧發(fā)酵淀粉和揮發(fā)性脂肪酸的影響。試驗(yàn)分為3個(gè)處理，對(duì)照組為基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)1組（25M yco.）和2組（50M yco.）分別用25%和50%含有鐮刀菌毒素的玉米和玉米蛋白粉代替基礎(chǔ)日糧中的玉米和玉米蛋白粉。采用復(fù)合菌種對(duì)全價(jià)日糧進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵開(kāi)始前所有處理日糧水分調(diào)節(jié)至50%。試驗(yàn)結(jié)果表明：（1）本試驗(yàn)條件下，日糧的淀粉含量隨發(fā)酵時(shí)間呈線(xiàn)性下降（P＜0.05），日糧的丁酸、乙酸含量隨發(fā)酵時(shí)間呈先線(xiàn)性上升（P＜0.05），而后下降；（2）日糧（0 d）的淀粉和乙酸含量隨著鐮刀菌毒素水平的提高顯著降低（P＜0.05）；（3）發(fā)酵末期（18 d）的淀粉、乙酸和丁酸含量各處理組差異不顯著（P＞0.05）。由此說(shuō)明，鐮刀菌毒素及其水平可顯著影響全價(jià)日糧發(fā)酵的淀粉、丁酸和乙酸水平。

鐮刀菌毒素；發(fā)酵產(chǎn)物；淀粉；乙酸；丁酸

鐮刀菌毒素是一些霉菌在谷類(lèi)作物或者飼料加工過(guò)程中滋生繁殖、分泌產(chǎn)生的一種有毒代謝產(chǎn)物（彭杰等，2009）。在自然界中分布極為廣泛，每年全世界受霉菌污染的原料損失量占總損失量的比例最高（孫飛等2014）。在我國(guó)，越來(lái)越多的作物原料、飼料產(chǎn)品遭受霉菌的污染甚至是重度污染（王金勇，2012）。鐮刀菌可侵染多種禾谷類(lèi)作物，能引起作物出現(xiàn)根腐、萎蔫、穗腐等多種腐爛病，不僅能夠?qū)е罗r(nóng)作物減產(chǎn)，而且降低谷類(lèi)作物品質(zhì)和食用價(jià)值。此外，鐮刀菌產(chǎn)生的多種毒素能使人畜中毒，霉變的作物對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物的健康造成嚴(yán)重威脅（肖湘等，2012；伍慶斌，2011）。隨著飼料工業(yè)的發(fā)展，微生物發(fā)酵飼料已在全世界廣泛應(yīng)用（王秀，2010）。因物理、化學(xué)方法具有降解成效不穩(wěn)定、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流失和影響動(dòng)物飼料適口性等缺點(diǎn)，生物降解以其降解程度高、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)備受關(guān)注和研究（喬霞等，2014；計(jì)成，2012；陸文清等2008）。Gourama等（1995）研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)嗜酸乳酸桿菌、保加利亞乳酸桿菌和植物乳酸桿菌等多種乳酸桿菌共同發(fā)酵可以抑制寄生曲霉孢子的產(chǎn)生；葉丙奎等（2009）研究證明，飼喂固態(tài)發(fā)酵日糧可以提高育肥豬的采食量和日增重；余淼等（2013）研究證明，肉牛食用微生物發(fā)酵的飼料，有效改善了消化吸收功能且提高了免疫力。國(guó)內(nèi)外有關(guān)發(fā)酵研究主要集中在發(fā)酵可改善常規(guī)飼料和原料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、降解原料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，而鐮刀菌毒素對(duì)發(fā)酵參數(shù)的研究還鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)旨在研究復(fù)合菌種發(fā)酵對(duì)鐮刀菌毒素日糧淀粉和揮發(fā)性脂肪酸的影響，為生產(chǎn)中霉變飼料的處理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料發(fā)酵菌種：乳酸菌（Lactobacillus），5×109cfu/g；酵母菌（Yeast），4.6×109cfu/g，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），1.9×1010cfu/g；北京科為博生物科技有限公司提供。

鐮刀菌毒素原料選擇：本課題組于2014年6月至12月相繼從山東省13個(gè)飼料廠(chǎng)和12個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)抽檢飼料原料樣品共計(jì)135個(gè)，檢測(cè)其霉菌毒素含量，調(diào)查霉菌毒素污染狀況。從中選擇毒素水平低于檢測(cè)限的原料配制對(duì)照日糧，選擇含有鐮刀菌毒素的玉米和玉米蛋白粉配制試驗(yàn)日糧。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)分3個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)18桶。對(duì)照組為基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)1組（25Myco.）和試驗(yàn)2組（50Myco.）分別用25%和50%的含有鐮刀菌毒素的玉米和玉米蛋白粉代替基礎(chǔ)日糧中的玉米和玉米蛋白粉，使50%鐮刀菌素日糧的玉米赤霉烯酮含量剛剛超過(guò)我國(guó)仔豬小于500mg/kg的限量標(biāo)準(zhǔn)（GB 13078.2-2006）。

1.3 試驗(yàn)日糧斷奶仔豬基礎(chǔ)日糧是參考美國(guó)NRC（1998）營(yíng)養(yǎng)需要來(lái)配制的，用已知鐮刀菌毒素的玉米和玉米蛋白粉代替基礎(chǔ)日糧中的玉米和玉米蛋白粉配制成含有100%鐮刀菌毒素日糧，隨后用100%鐮刀菌素日糧和對(duì)照日糧按照1∶3比例配制成25Myco.日糧，用100%的鐮刀菌素日糧和對(duì)照日糧按照1∶1比例配制成50Myco.日糧。日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品的制備與采集發(fā)酵試驗(yàn)開(kāi)始前將一定比例發(fā)酵菌種（乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌分別為6.33×106cfu/g、1.05×106cfu/g和8.94×106cfu/g）配制成水溶液，均勻噴灑在所有試驗(yàn)日糧中，然后噴灑蒸餾水，調(diào)節(jié)水分含量至50%，攪拌均勻，裝入塑料桶（50±0.36 kg），密封發(fā)酵，發(fā)酵溫度為16~18°C。

日糧密封前采樣作為第0天的樣品，然后分別于日糧發(fā)酵的第3、6、9、12、15、18天采集樣品，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選擇3桶，采樣完畢棄去。采樣方法：距離桶邊約20 cm做一個(gè)圓，在圓上劃一個(gè)“十”字，“十”字與圓的4個(gè)交點(diǎn)和圓心作為取樣點(diǎn)；分別在距離發(fā)酵桶上表面約20 cm處、桶底約20 cm處和桶的中央采樣，每個(gè)采樣點(diǎn)采樣約500 g，然后將每個(gè)桶的上、中、下15個(gè)點(diǎn)的樣品混合，立即進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。按照四分法縮樣，最后將樣品平均分成2份（每份約500 g），一份置于60℃烘箱中制成風(fēng)干樣，粉碎用于測(cè)定DM、CP、Ca、P常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分和毒素含量（張麗英，2003），另一份置于-20℃保存，用于淀粉和揮發(fā)性脂肪酸（VFA）含量測(cè)定。

1.4.2 樣品測(cè)定

1.4.2.1 毒素測(cè)定采用免疫親和柱層析凈化，以液相色譜法熒光檢測(cè)器測(cè)定玉米赤霉烯酮的含量，外標(biāo)法定量。采用免疫親和層析凈化高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，以液相色譜結(jié)合紫外檢測(cè)器測(cè)定伏馬毒素B1和嘔吐毒素的含量，外標(biāo)法定量。玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏馬毒素、T-2毒素和嘔吐毒素的最低檢測(cè)限為分別為0.1 mg/kg、1.0μg/kg、0.5μg/kg、0.25 mg/kg、0.02μg/kg和0.1mg/kg。

1.4.2.2 淀粉的測(cè)定采用蒽酮比色法測(cè)定日糧淀粉含量。（1）試劑的配制。試劑一：80%乙醇溶液；試劑二：52%高氯酸溶液；蒽酮-硫酸試劑：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.4 g蒽酮溶于100mL 88%硫酸溶液中，現(xiàn)用現(xiàn)配。（2）淀粉標(biāo)準(zhǔn)液及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制。淀粉標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱(chēng)取200mg淀粉于燒杯中，加入5mL蒸餾水和65mL試劑二，攪拌溶解，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，此淀粉溶液濃度為2 mg/mL；移取上述溶液10 mL于250 mL容量瓶中，蒸餾水定容，作為淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液，此淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為80μg/mL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：分別移取換算成淀粉含量分別為0、10、20、40、60、80μg標(biāo)準(zhǔn)液于試管中，加蒸餾水使各試管中溶液均為2mL，冰水浴中冷卻2min，加入6 mL蒽酮-硫酸試劑，搖勻，再在冰水浴中冷卻2 min。隨后將試管放入沸水浴中5 min，冷卻至室溫。用0μg淀粉作為空白參比，用分光光度計(jì)，于640 nm波長(zhǎng)下比色，測(cè)定吸光度，以吸光度為橫坐標(biāo)，淀粉濃度作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

步驟：①準(zhǔn)確稱(chēng)取2.5 g發(fā)酵飼料樣品于50mL離心管中；②滴加2滴試劑一濕潤(rùn)樣品，再加入5 mL蒸餾水搖勻，加入25 mL熱的試劑一，漩渦振蕩器搖勻，靜置5 min；③在2 500 r/min離心5 min，棄除上清液；④加入30mL試劑一和5mL水于殘?jiān)?，搖勻后靜置5 min，2500 r/min離心5 min，棄除上清液；⑤加入30 mL試劑二和5 mL水于殘?jiān)?，攪拌混?0 min，以2500 r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中作為提取液；⑥再加入35 mL試劑二和5 mL水于殘?jiān)?，攪拌混?0 min，以2500 r/min離心10 min，上清液與⑤中提取液合并，以蒸餾水定容；⑦定量濾紙過(guò)濾提取液于干凈錐形瓶中，移取10 mL濾液于250mL容量瓶中，蒸餾水定容；⑧?、咧械矸厶崛∫? mL于試管中，冷水浴2 min，然后加入6mL蒽酮-硫酸試劑，旋窩振蕩器上充分混勻。再冷水浴2 min，沸水浴5 min，此時(shí)各試管中溶液呈藍(lán)綠色，冷去至室溫，用分光光度計(jì)，于640 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行比色，測(cè)定吸光度。

計(jì)算公式：淀粉/%＝G/M×100；

式中：G為由飼料樣品提取液測(cè)定的吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸公式計(jì)算出來(lái)的淀粉毫克數(shù)；M為飼料樣品的質(zhì)量。

1.4.2.3 揮發(fā)性脂肪酸（VFA）的測(cè)定樣品中VFA含量是采用氣相色譜法（美國(guó)安捷倫Agilent Technotogies 7890A）測(cè)定的。

樣品處理：稱(chēng)取3 g發(fā)酵飼料樣品，加入10mL 20%偏磷酸溶液，置于振蕩器上振蕩1.5 h，然后通過(guò)有機(jī)濾膜（水系，0.22μm）3層，存入1.5mL離心管中，放在4℃冰箱中待測(cè)。

色譜參數(shù)：采用程序升溫法，初始溫度為110℃，以10℃/min升溫至150℃，保持5min。檢測(cè)器參數(shù)：FID溫度為230℃，H2流量40mL/min，空氣流量450mL/min，尾吹流量45mL/min。進(jìn)樣口參數(shù)：溫度200℃，載氣高純氮?dú)?，分流比?0∶1，進(jìn)樣量為1μL。

1.5 數(shù)據(jù)處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，用單因素方差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Duncan’s進(jìn)行多重比較。其中不同發(fā)酵時(shí)期理化指標(biāo)變化采用Excel進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐮刀菌毒素對(duì)全價(jià)飼料發(fā)酵淀粉含量的影響由圖1可知，發(fā)酵初始（0 d）對(duì)照組淀粉含量顯著高于25%鐮刀菌素組和50%鐮刀菌素組（P＜0.05），25%毒素組和50%毒素組差異不顯著（P＞0.05）。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，各處理組不同時(shí)間點(diǎn)淀粉水平差異不顯著（P＞0.05）。各處理組日糧淀粉隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)均呈顯著下降趨勢(shì)（P＜0.05）。結(jié)果表明，對(duì)照組、25%毒素組和50%毒素組均在發(fā)酵15 d時(shí)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。隨日糧中鐮刀菌毒素增加，發(fā)酵淀粉隨時(shí)間的斜率逐漸增大（表2），但3個(gè)處理的斜率兩兩差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 飼糧淀粉隨時(shí)間變化的折線(xiàn)圖

表2 淀粉的普通截距多元線(xiàn)性回歸（d-0，3，6，9，12，15，18）

2.2 鐮刀菌毒素對(duì)全價(jià)飼料發(fā)酵乙酸含量的影響由圖2可知，毒素水平顯著影響發(fā)酵0、3、6、9 d和12 d的乙酸水平（P＜0.05）。對(duì)照組（發(fā)酵第0天和3天）乙酸含量顯著高于25%毒素組（P＜0.05），25%毒素組又顯著高于50%毒素組（P＜0.05）；對(duì)照組（發(fā)酵第9天和12天）乙酸含量顯著高于25%毒素組和50%毒素組（P＜0.05），而25%毒素組和50%毒素組差異不顯著（P＞0.05）。日糧乙酸含量隨發(fā)酵時(shí)間呈線(xiàn)性升高（P＜0.05），而后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。分析表明，25%毒素組和50%毒素組在發(fā)酵12 d時(shí)就達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，而對(duì)照組在發(fā)酵15 d時(shí)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。隨日糧中鐮刀菌毒素增加，發(fā)酵乙酸隨時(shí)間的斜率先減小后增大（表3），但3個(gè)處理的斜率兩兩差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 飼糧乙酸隨時(shí)間變化的折線(xiàn)圖

表3 乙酸的普通截距多元線(xiàn)性回歸（d-0，3，6，9，12，15，18）

2.3 鐮刀菌毒素對(duì)全價(jià)飼料發(fā)酵丁酸含量的影響由圖3可知，毒素水平顯著影響發(fā)酵6、9、12 d的丁酸水平（P＜0.05）。發(fā)酵第6天時(shí)，25%毒素組和50%毒素組丁酸含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），而25%和50%毒素組差異不顯著（P＞0.05）；第9天時(shí)，25%毒素組丁酸含量顯著高于對(duì)照組和50%毒素組（P＜0.05），而對(duì)照組和50%毒素組差異不顯著（P＞0.05）；第12天時(shí)，25%毒素組顯著高于50%毒素組（P＜0.05）。日糧中丁酸隨發(fā)酵時(shí)間呈線(xiàn)性上升（P＜0.05），而后下降至穩(wěn)定。分析表明，對(duì)照組和25%毒素組在發(fā)酵15 d時(shí)就達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，而50%毒素組在發(fā)酵12 d時(shí)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。隨日糧中鐮刀菌毒素增加，發(fā)酵丁酸隨時(shí)間的斜率先減小后增大（表4），但三個(gè)處理的斜率兩兩差異不顯著（P＞0.05）。

圖3 日糧丁酸隨時(shí)間變化的折線(xiàn)圖

表4 丁酸的普通截距多元線(xiàn)性回歸（d-0，3，6，9，12，15，18）

3 討論

3.1 鐮刀菌毒素對(duì)全價(jià)飼料發(fā)酵淀粉的影響淀粉是影響畜禽生長(zhǎng)性能的重要指標(biāo)之一（王海東等，2008）。乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌均能夠利用碳水化合物發(fā)酵糖類(lèi)（李永凱等，2009）。黃治國(guó)等（2012）跟蹤白酒生產(chǎn)整個(gè)發(fā)酵期并對(duì)采集酒醅樣品進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，淀粉消耗量比較大，并且呈現(xiàn)迅速下降趨勢(shì)，在本試驗(yàn)發(fā)酵過(guò)程中，淀粉也表現(xiàn)出隨時(shí)間迅速降低的趨勢(shì)。霉菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中分泌的酶也會(huì)分解和消耗飼料中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（史瑩華等，2006）。因此，25%毒素組和50%毒素組的淀粉含量低于對(duì)照組。

3.2 鐮刀菌毒素對(duì)全價(jià)飼料發(fā)酵VFA的影響Cohen等（1984）和Ren等（1997）研究表明，可溶性碳水化合物的發(fā)酵以丁酸型發(fā)酵為主，終產(chǎn)物主要為丁酸、乙酸及少量的丙酸，產(chǎn)丁酸菌同時(shí)會(huì)受到發(fā)酵終產(chǎn)物的抑制（艾斌凌，2014）。因此，丁酸出現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。發(fā)酵初始階段以產(chǎn)乙酸菌為主，乙酸的產(chǎn)生速率大于消耗速率，出現(xiàn)乙酸增加，后期由于產(chǎn)甲烷菌活性的加大，乙酸的消耗速率大于產(chǎn)生速率，因此乙酸呈下降趨勢(shì)（Zhao等，2008）。陳斌等（2015）在研究玉米秸稈干式厭氧發(fā)酵時(shí)發(fā)現(xiàn)，乙酸產(chǎn)生也呈先增后降的趨勢(shì)。本試驗(yàn)中乙酸、丁酸含量也有相同的規(guī)律。本研究中毒素處理組乙酸水平低可能與處理組淀粉含量低于對(duì)照組有關(guān)，但是毒素對(duì)VFA的影響機(jī)理尚需進(jìn)一步證明。

4 結(jié)論

4.1 本試驗(yàn)條件下，日糧中淀粉含量隨著發(fā)酵時(shí)間呈線(xiàn)性下降，丁酸和乙酸含量隨著發(fā)酵時(shí)間呈先升高后下降趨勢(shì)，但是不同處理的線(xiàn)性斜率差異不顯著。

4.2 日糧（0 d）的淀粉和乙酸含量隨著鐮刀菌毒素水平的提高顯著降低。

4.3 發(fā)酵末期（18 d）的淀粉、乙酸和丁酸含量各處理組間差異不顯著。

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This experimentwas conducted to study the effects of fusarium toxin on fermentation parameters of starchand and volatile fatty acid of compound feed.The experiment was divided into 3 treatments，the control group was the basal diet，the testgroup 1（25Myco.）and 2（50Myco.）were the basal diet that corn and corn glutenmealwere replaced by 25%or 50%fusarium toxin contaminated-corn and contaminated-corn gluten meal，respectively.The results showed as follows：（1）The dietary starch decreased significantly along with the fermentation time（P＜0.05），and acetic acid and butyric acid were increased first and then decreased（P＜0.05）；（2）The starch and acetic acid of diet（0 d）decreased significantly with the elevated levels of fusarium toxins（P＜0.05）；（3）The starch，acetic acid and butyric acid parameters at the end of fermentation（18 d）had no difference among three treatments（P＞0.05）.Under the experimental conditions，the fermentation products of starch，acetic acid，and butyric acid of the compound feed were significantly affected by fusarium toxin and its levels.

fusarium toxin；fermentation products；starch；acetic acid；butyric acid

S816.3

A

1004-3314（2017）06-0030-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20170607

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬項(xiàng)目（SDAIT-08-04）；山東省財(cái)政廳農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣項(xiàng)目

*通訊作者