柴艷，李琦華，賈俊靜，張文杰，陳濤，師正鵬，梁建平

（1.芒市科技局科協(xié)，云南德宏678400；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650201；3.濰坊六和飼料有限公司臨朐分公司，山東濰坊262609；4.芒市畜牧局，云南德宏678400；5.德宏州畜牧局，云南德宏678400；6.德宏州科技局科協(xié)，云南德宏678400））

白術(shù)多糖對(duì)斷奶仔豬白細(xì)胞介素-1β基因表達(dá)的影響

柴艷1，李琦華2*，賈俊靜2，張文杰3，陳濤4，師正鵬5，梁建平6

（1.芒市科技局科協(xié)，云南德宏678400；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650201；3.濰坊六和飼料有限公司臨朐分公司，山東濰坊262609；4.芒市畜牧局，云南德宏678400；5.德宏州畜牧局，云南德宏678400；6.德宏州科技局科協(xié)，云南德宏678400））

本試驗(yàn)選用44日齡、平均體重8.94 kg的DLY三元雜交斷奶仔豬60頭，隨機(jī)分為5個(gè)處理組，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4頭豬。第一組為對(duì)照組，飼喂基礎(chǔ)日糧；第二、第三、第四和第五組為試驗(yàn)組，分別在基礎(chǔ)日糧中添加抗生素（桿菌肽鋅+硫酸粘桿菌素）及0.05%、0.10%、0.15%的白術(shù)多糖（PAM），正式期為30 d。30 d后頸靜脈采取血液樣品，并應(yīng)用SYBR Green I熒光染料實(shí)時(shí)定量PCR方法進(jìn)行白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）基因mRNA的定量，研究白術(shù)多糖對(duì)斷奶仔豬免疫功能的影響，為白術(shù)多糖的深入研究提供科學(xué)依據(jù)。結(jié)果表明：IL-β基因的相對(duì)表達(dá)量，各處理組間差異不顯著（P＞0.05），但白術(shù)多糖處理組均比對(duì)照組和抗生素組高，其中以0.1%PAM組最高，抗生素組、0.05%PAM組次之，對(duì)照組和0.15%PAM處理組的最低。0.1%PAM處理組與對(duì)照組和抗生素組相比，IL-β基因相對(duì)表達(dá)量分別提高34.21%和27.5%；0.1%PAM處理組與0.05%PAM處理組和0.15%PAM處理組相比，IL-β基因相對(duì)表達(dá)量分別提高27.5%和34.21%。0.05%PAM處理組與對(duì)照組和抗生素組相比，IL-β基因相對(duì)表達(dá)量分別提高5.2%和0%；0.15%PAM處理組與對(duì)照組相比，IL-β基因相對(duì)表達(dá)量提高0%；0.15%PAM處理組與抗生素組相比，IL-β基因相對(duì)表達(dá)量降低5%。

斷奶仔豬；白術(shù)多糖；白細(xì)胞介素-1β基因

白術(shù)多糖（PAM）是植物多糖中的一種，為菊科多年生草本植物，在我國(guó)的南方地區(qū)廣泛種植，是中草藥配方的一種有效成分，其用量居大宗常用中藥材之首（Shiik等，2003；Prieto，2003；Gong等，2002；楊翠平等2002；黃青森，2001；Ronald，1996；Mori等，1989；Fenichel，1984）。研究表明，PAM具有以下作用：（1）提高淋巴細(xì)胞增殖和抗體的產(chǎn)生、提高細(xì)胞免疫功能（Huang等，2005；P rieto，2003；郭鳳麗等，2003）。（2）提高細(xì)胞過(guò)氧化物歧化酶（SOD）活性，抑制紅細(xì)胞自氧化溶血，直接清除自由基（呂圭源等，1996）。（3）增強(qiáng)家兔離體小腸平滑肌自發(fā)性收縮（馬允慰，1982）；能明顯促進(jìn)小鼠小腸蛋白質(zhì)的合成；對(duì)應(yīng)激性潰瘍，有顯著抑制作用（馬曉松等，1995）。（4）具有抗菌消炎作用，對(duì)傷寒桿菌、甲型副傷寒桿菌、福氏痢疾桿菌等有抑制作用。研究表明，PAM能使小鼠TH細(xì)胞明顯增加，提高TH/Ts比值，改善T細(xì)胞亞群分布紊亂狀態(tài)，使IL－2表達(dá)水平顯著提高，并能增加T淋巴細(xì)胞表面IL－2R基因的表達(dá)。表明PAM可能是增強(qiáng)免疫和調(diào)節(jié)免疫作用的重要機(jī)制之一（余上才，1994）。（5）一定劑量的PAM能增加小鼠胸腺和脾臟重量，對(duì)抗環(huán)磷酰胺所致白細(xì)胞減少作用，增強(qiáng)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能，并能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和溶血素的生成（湯新慧，1998；李育浩等，1991）。（6）抗腫瘤作用（Mori等，1989）。此外，PAM還有抗血凝、擴(kuò)張血管、防護(hù)放射線損害等作用，是國(guó)家中醫(yī)管理局公布的中醫(yī)防治“非典”處方中的重要藥材之一（余上才，1994）。本文將PAM添加至早期斷奶仔豬飼料中，研究其對(duì)斷奶仔豬白細(xì)胞介素-1β基因表達(dá)效果的影響，旨在為PAM在飼料中的合理利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物從昆明和牧牧業(yè)有限公司豬場(chǎng)選擇胎次、體重（7.5 kg左右）相近，健康狀況良好的三元雜交（DLY）仔豬，公母各半，共60頭，隨機(jī)分為5組，每個(gè)處理12頭，分為3個(gè)重復(fù)（欄），每個(gè)重復(fù)4頭。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及日糧試驗(yàn)用白術(shù)多糖由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，試驗(yàn)日糧原料由昆明云嶺廣大種禽飼料有限公司提供。白術(shù)多糖以3個(gè)不同劑量分別添加至飼料中。試驗(yàn)日糧組成和營(yíng)養(yǎng)水平見表1?？股亟M中添加1∶5的硫酸粘桿菌素和桿菌肽鋅，除抗生素組以外，其他試驗(yàn)組中均未添加任何藥物和抗生素。

表2 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.3 飼養(yǎng)管理飼養(yǎng)試驗(yàn)在統(tǒng)一條件下進(jìn)行，試驗(yàn)豬按體重相近原則隨機(jī)的分配到各個(gè)處理中，且全部飼養(yǎng)在同一棟朝向相同豬舍內(nèi)。試驗(yàn)的前10 d，采用相同功率的紅外燈人工補(bǔ)溫，后20 d自然溫度。試驗(yàn)前對(duì)豬舍進(jìn)行統(tǒng)一清洗、消毒，試驗(yàn)豬用耳牌編號(hào)，同時(shí)按常規(guī)免疫程序免疫，并做好疾病控制。整個(gè)試驗(yàn)期采用自由采食和飲水。

1.4 PCR引物設(shè)計(jì)參照GenBank（http：//www. ncbi.nlm.nih.gov）公開發(fā)表的豬白細(xì)胞介素-1β基因全長(zhǎng)序列和豬βactin核苷酸序列，運(yùn)用Primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。其白細(xì)胞介素-1β和18S的產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為124和195 bp，引物序列如下：

IL-1β上游5'ACCTGGACCTTGGTTCTC 3'

IL-1β下游5'GGATTCTTCATCGGCTTC 3'

18S上游5'GCGGCTTTGGTGACTCTA 3'

18S下游5'CTGCCTCCTTGGATGTG 3'

1.5 白細(xì)胞介素-1β基因表達(dá)的檢測(cè)飼養(yǎng)30 d后頸靜脈采取血液樣品，血樣于-80℃冰箱保存，用RNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）提取血液RNA，應(yīng)用SYBR Green I熒光染料實(shí)時(shí)定量PCR方法進(jìn)行IL-1β基因mRNA的定量。

1.6 數(shù)據(jù)處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 血液總RNA的提取使用百泰克（血液樣本）總RNA快速提取試劑盒提取血液RNA，然后取7μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)結(jié)果如圖1。提取的RNA無(wú)蛋白質(zhì)污染，并且條帶清晰，也沒有降解和斷裂，說(shuō)明提取RNA達(dá)到試驗(yàn)要求。

圖1 血液RNA提取電泳圖

2.2 IL-β和18SPCR擴(kuò)增圖經(jīng)RT-PCR得到目的基因片段如圖2和圖3。1%瓊脂糖凝膠電泳圖譜顯示IL-β基因的目的片段大小為124 bp，18S的目的片段大小為195 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度大小與目的片段大小一致。

圖2 18S基因擴(kuò)增電泳圖

圖3 豬IL-β基因擴(kuò)增電泳圖

2.3 測(cè)序結(jié)果經(jīng)PCR擴(kuò)增的IL-β基因膠回收后，產(chǎn)物送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI-BLAST程序比對(duì)，確認(rèn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均為目的片段。其比對(duì)結(jié)果如下：

GENE ID：397122 IL1B|interleukin 1，beta [Sus scrofa]

（10 or fewer PubMed links）

Score=152 bits（82），Expect=1e-33

Identities=85/86（98%），Gaps=1/86（1%）

Strand=Plus/Minus

2.4 熒光定量PCR結(jié)果分析

2.4.1 IL-β基因熒光定量PCR結(jié)果以cDNA樣品為模板進(jìn)行定量PCR得到IL-β基因的熒光定量PCR擴(kuò)增的動(dòng)力學(xué)曲線（圖4）和熒光定量PCR擴(kuò)增的溶解曲線（圖5）。

圖4 部分樣品IL-β基因的熒光定量PCR擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線

圖5 部分樣品IL-β基因的熒光定量PCR擴(kuò)增熔解曲線

2.4.2 IL-β基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制將目的基因片段回收純化后，按相差10倍的比例做5～8個(gè)濃度梯度稀釋，作為熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)模板，進(jìn)行定量反應(yīng)。在標(biāo)準(zhǔn)曲線圖中，Ct值與模板擴(kuò)增拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)呈反比關(guān)系。

標(biāo)準(zhǔn)曲線圖中基因的擴(kuò)增效率一般為80%～105%，相關(guān)系數(shù)一般大于0.98，即認(rèn)為定量可靠。本試驗(yàn)中IL-β基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率及其相關(guān)系數(shù)分別為82%和99.8%。如圖6即認(rèn)為達(dá)到熒光定量PCR的擴(kuò)增要求。

圖6 IL-β標(biāo)準(zhǔn)品熒光定量PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.3 IL-β實(shí)時(shí)熒光定量PCR產(chǎn)物檢測(cè)經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR得到目的基因片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳圖譜顯示IL-β目的片段大小為124 bp左右，與預(yù)期結(jié)果相符。在電泳過(guò)程中沒有出現(xiàn)非特異性條帶，且?guī)屯暾?，亮度適中。說(shuō)明熒光定量PCR反應(yīng)體系和條件設(shè)置比較合適，擴(kuò)增效果良好，定量結(jié)果可靠。

2.4.4 18S基因熒光定量PCR結(jié)果以血液cDNA樣品為模板進(jìn)行定量PCR得到18S基因的熒光定量PCR擴(kuò)增的動(dòng)力學(xué)曲線（7圖）和熒光定量PCR擴(kuò)增的熔解曲線（圖8）。

圖7 部分樣品18S基因的熒光定量PCR擴(kuò)增的動(dòng)力學(xué)曲線

圖7 的動(dòng)力學(xué)曲線圖表明樣品的RNA完整性好。圖8的熔解曲線分析顯示，引物二聚體污染較少，熔解溫度均一，峰的形狀較尖銳，表明定量結(jié)果比較準(zhǔn)確。

2.4.5 18S基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制18S基因標(biāo)準(zhǔn)曲線圖中該基因的擴(kuò)增效率為84.1%，相關(guān)系數(shù)為0.998（見圖9），達(dá)到熒光定量PCR的擴(kuò)增要求。

圖8 部分樣品18S基因的熒光定量PCR擴(kuò)增熔解曲線

圖9 18S標(biāo)準(zhǔn)品熒光定量PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.6 不同白術(shù)多糖添加水平對(duì)仔豬IL-β基因相對(duì)表達(dá)量的影響由表3可知，在仔豬基礎(chǔ)日糧中添加白術(shù)多糖可以提高斷奶仔豬IL-β基因的相對(duì)表達(dá)量，劑量不同IL-β基因的相對(duì)表達(dá)量不同，白術(shù)多糖處理組的IL-β基因相對(duì)表達(dá)量都比對(duì)照組和抗生素組高，但添加PAM組之間差異不顯著（P＞0.05），其中以0.1%添加量組相對(duì)比較高。另外，0.1%PAM處理組與對(duì)照組和抗生素組相比，IL-β基因相對(duì)表達(dá)量分別高出34.21%和27.5%；0.1%PAM處理組與0.05%PAM處理組和0.15%PAM處理組相比，分別高出27.5%和34.21%。0.05%PAM處理組與對(duì)照組相比，IL-β基因相對(duì)表達(dá)量高出5.2%；0.15%PAM處理組與抗生素組相比，IL-β基因相對(duì)表達(dá)量降低5%。

3 討論

淋巴細(xì)胞可產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，其中產(chǎn)生的IL-1β被認(rèn)為是主要的前炎癥因子（楊文東等，2007）。

表3 不同白術(shù)多糖添加水平仔豬IL-β基因相對(duì)表達(dá)量的比較分析

近年來(lái)，多糖對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響已有許多報(bào)道，研究表明，大多數(shù)多糖在體內(nèi)或體外均能促進(jìn)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。例如黃芪多糖（胡庭俊等，2005）、蜂膠多糖（王德云等，2005）、當(dāng)歸多糖（胡庭俊等，2005）均能促進(jìn)畜禽淋巴細(xì)胞增殖。湯新慧（1998）研究發(fā)現(xiàn)，白術(shù)多糖能明顯促進(jìn)淋巴細(xì)胞向成熟T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化。Guo（2000）報(bào)道，從紫云英中提取的果膠多糖，可促進(jìn)體外培養(yǎng)的鼠B細(xì)胞IL-6的分泌，其機(jī)制是IL-6 mRNA轉(zhuǎn)錄活性增加。胡曉蕾（2006）報(bào)道，添加1%和2%白術(shù)多糖均可顯著提高鼠的免疫功能，但二者的效果差異不顯著；而0.5%白術(shù)添加組與對(duì)照組相比無(wú)明顯的免疫促進(jìn)作用?？赡茉蚴?.5%白術(shù)添加量太小，以致對(duì)大鼠脾臟系數(shù)和胸腺系數(shù)無(wú)明顯的促進(jìn)作用，甚至有降低的趨勢(shì)。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在斷奶仔豬日糧中添加0.1%的白術(shù)多糖可以提高仔豬IL-1β的表達(dá)量，添加量為0.15%和0.05%時(shí)，仔豬IL-1β的表達(dá)量與對(duì)照組和抗生素組無(wú)顯著差異。

本研究中IL-1β的相對(duì)表達(dá)量結(jié)果與其他報(bào)道結(jié)果有不相一致的地方，這可能與選擇多糖的種類、來(lái)源、有效成分的含量、添加量、日糧組成、試驗(yàn)條件、試驗(yàn)動(dòng)物等有關(guān)，具體情況有待進(jìn)一步研究。

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A total fo 60 three-line crossbred DLY（44 days old）early-weaned piglets（average weight is about 8.94 kg）were random ly assigned to 5 treatments with 3 replicates of 4 pigs.GroupⅠfeed basal diet（CK），groupⅡfeed with antibiotic（bacitracin zinc+polymyxin E），groupⅢ，IV，V were fed with 0.05%，0.10%，0.15%Atractylodesmacrophala Koidz（PAM）.This experiment had one phases，total of 30 days，after 30 days，adopts the blood sample from neck meridians.And IL-1βgenemRNA wasmeasured by SYBR Green IFluorescent dye Real-time quantitative PCR to study the effect of immune function in piglets，and provid scientific proof for the future research of PAM.The results showed as follows：the experimental groups did not show significant difference on IL-1βgene mRNA（P＞0.05）.But natural PAM groupswere higher than control group and antibiotic group.Among them，0.1%PAM group was highest，0.05%PAM group and antibiotic group were second，control group and 0.05%PAM group were lowest.Compared with the control group and antibiotic group，the relative expression of IL-1βgene in 0.1%natural PAM group were higher 34.21%and 27.5%respectively；Compared with 0.05%natural PAM group and 0.15%natural PAM group，the relative expression of IL-1βgene in 0.1%natural PAM group were higher 27.5%and 34.2%respectively；Compared with the control group and antibiotic group，the relative expression of IL-1βgene in 0.05%natural PAM group were higher 5.2%and 0%respectively；Compared with the control group，the relative expression of IL-1βgene in 0.15%natural PAM group was higher 0%；Compared with antibiotic group，the relative expression of IL-1βgene in 0.15%natural PAM group was lower 5%.

weaned-piglet；polysaccharides of Atractylodesmacrophala Koidz；IL-1βgene

S816.7

A

1004-3314（2017）06-0010-05

云南省運(yùn)用基礎(chǔ)研究面上基金項(xiàng)目（2007C0056M）

*通訊作者