楊茂森 張世文 王鑫 劉占莉

（甘肅省蜂業(yè)技術(shù)推廣總站，天水741020）

仿生蜂巢花粉制備方法及其活性成分測(cè)定的研究

楊茂森 張世文 王鑫 劉占莉

（甘肅省蜂業(yè)技術(shù)推廣總站，天水741020）

蜂巢花粉是蜜蜂真正的天然食物，是蜜蜂采集植物花粉過(guò)程或在蜂房?jī)?nèi)摻入自身唾液與蜂蜜后釀造成熟的產(chǎn)品，蜜蜂及其幼蟲(chóng)缺食蜂巢花粉，將造成群勢(shì)下降、幼蟲(chóng)不能完全羽化。根據(jù)蜜蜂釀制花粉的原理，我們采用多級(jí)發(fā)酵技術(shù)，確立了仿生蜂巢花粉的制備方法；通過(guò)蜂花粉、蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉（三種材料都是油菜花粉）對(duì)比研究試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)仿生蜂巢花粉中的活性化學(xué)成分含量高于蜂花粉、蜂巢花粉的含量。通過(guò)對(duì)不同花粉淀粉酶、蛋白酶的對(duì)比檢測(cè)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)仿生蜂巢花粉中這兩種活性酶的含量與蜂巢花粉的含量十分接近。本研究為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)活性仿生蜂巢花粉制劑及其單一活性物質(zhì)產(chǎn)品提供了理論依據(jù)。

蜂花粉；蜂巢花粉；仿生蜂巢花粉；淀粉酶；蛋白酶

花粉為植物的雄性生殖細(xì)胞，它具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)：花粉具有預(yù)防腦心血管疾病、降血脂，調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)，促進(jìn)睡眠，調(diào)節(jié)胃腸系統(tǒng)功能，促進(jìn)消化，治療習(xí)慣性便秘；在調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、提高機(jī)體免疫功能、抗衰老、改善性功能、治療男性不育、前列腺炎癥等方面有一定的效果，具有防癌抑癌、保肝護(hù)肝、防止貧血、糖尿病、抗疲勞、養(yǎng)顏美容等功能而倍受人們的關(guān)注和應(yīng)用[1-6]。蜂花粉是經(jīng)蜜蜂采集的花粉，在蜂箱巢門(mén)口人工脫取的花粉被稱為“蜂花粉”，經(jīng)蜜蜂采集帶回巢內(nèi)釀造成熟的花粉被稱為“蜂巢花粉”，蜂巢花粉是蜂花粉在巢脾蜂房?jī)?nèi)被蜜蜂加入自身唾液和蜂蜜后，得以釀熟的天然產(chǎn)品。蜂巢花粉是蜜蜂真正的食物，具有很高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值。但是人類要享用蜂巢花粉，只能采取人工掏取的辦法，經(jīng)我們?cè)囼?yàn)：一個(gè)勞力一天（8小時(shí)）的掏取量在350～450g左右，生產(chǎn)成本較高。如何批量生產(chǎn)出與天然蜂巢花粉活性成分接近的產(chǎn)品，是本研究要解決的問(wèn)題。

我國(guó)是世界第一養(yǎng)蜂大國(guó)，蜂花粉產(chǎn)量及出口量均居世界首位。據(jù)2009年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)：我國(guó)蜂花粉年產(chǎn)量超過(guò)13500噸，產(chǎn)量位居世界第一，其中一部分用于保健食品或藥品，一部分用于出口外銷，絕大多數(shù)被用做蜜蜂過(guò)冬時(shí)的“口糧”。我國(guó)可開(kāi)發(fā)利用的蜂花粉數(shù)量在600噸以上，如果采用仿生蜂巢花粉的制備方法，可增進(jìn)吸收，使其附加值得以大幅提高，從而帶動(dòng)提升國(guó)內(nèi)養(yǎng)蜂業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。我國(guó)仿生蜂巢花粉產(chǎn)品研發(fā)剛剛起步，其發(fā)展前景十分遠(yuǎn)大[7]。

1 儀器與材料

紫外光譜儀：UV-2001型紫外光譜儀（日本日立公司）；Surveyor高效液相色譜分析儀（Thermo Finnigan）；凍干機(jī)；

油菜（Brassica campestris L）蜂花粉、天然蜂巢花粉均由甘肅耐克特蜂產(chǎn)品有限公司采集并通過(guò)蘭州大學(xué)藥學(xué)院馬志剛教授鑒定。

酵母菌：安琪酵母股份有限公司提供；乳酸菌：河南君安生物技術(shù)有限公司提供；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：成都曼思特生物科技有限公司；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品:成都曼思特生物科技有限公司；甲醇：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；亞硝酸鈉：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硝酸鋁：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；NaOH:分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；苯酚:分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硫酸:分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2 試驗(yàn)方法與分析

2.1 仿生蜂巢花粉的制備方法

蜂花粉的稱量、滅菌：從冷庫(kù)稱取油菜蜂花粉，精選除雜，經(jīng)臭氧殺菌機(jī)滅菌，使原料蜂花粉達(dá)到食品安全衛(wèi)生要求。

脫敏處理：按蜂花粉重量的15～30%噴灑生理鹽水，攪拌均勻后，在溫度為28～38℃條件下培養(yǎng)48～72小時(shí)，完成第一級(jí)處理。

蜂巢花粉液處理：對(duì)完成第一級(jí)處理蜂花粉，按每份1 kg均勻噴灑200～300 ml蜂巢花粉培養(yǎng)液，在溫度為28～35℃條件下培養(yǎng)48～72小時(shí)，完成第二級(jí)處理。

天然蜂巢花粉液的準(zhǔn)備方法：用蒸餾水制成5%濃度的滅菌蜂花粉液,用蜂蜜調(diào)節(jié)其糖度18%，然后加入天然蜂巢花粉，天然蜂巢花粉含量達(dá)12%（w/v）以上，調(diào)節(jié)pH值在3.5，在恒溫箱28～35℃條件下培養(yǎng)3天，得到天然蜂巢花粉液。

酵母菌液處理[8，9]：對(duì)完成第二級(jí)處理的蜂花粉，按每份1kg均勻噴灑200～300ml酵母菌液，在溫度為28～35℃條件下培養(yǎng)48～72小時(shí)，完成第三級(jí)處理。

酵母菌液的準(zhǔn)備方法：用蒸餾水制成5%濃度的滅菌蜂花粉液,用蜂蜜調(diào)節(jié)其糖度在18%，調(diào)節(jié)pH值在3.5，在恒溫箱28～35℃條件下自然接種培養(yǎng)5天,得到酵母菌培養(yǎng)液。

乳酸菌液處理[9，10]：對(duì)完成第三級(jí)處理的蜂花粉，按每kg均勻噴灑200～300ml乳酸菌液，在溫度為28～35℃條件下培養(yǎng)48～72小時(shí)，完成第四級(jí)處理。

乳酸菌液的準(zhǔn)備方法：用蒸餾水制成5%濃度的滅菌蜂花粉液，量取加入天水當(dāng)?shù)貪{水菜汁，漿水菜汁含量為25%（v/v），在恒溫箱25～30℃條件下培養(yǎng)3天，得到乳酸菌培養(yǎng)液。

真空凍干：完成第四級(jí)處理的蜂花粉，用60目的紗網(wǎng)制成小顆粒后，進(jìn)行真空凍干處理36～48小時(shí)，溫度控制在-55～-65℃之間，真空度為-0.009MPa，使花粉中含水量在3～5%即可。

滅菌：將完成凍干的蜂花粉置于臭氧滅菌罐中滅菌，滅菌時(shí)間為50分鐘，完成滅菌后裝入潔凈食品袋中備用,即生產(chǎn)出凍干活性仿生蜂巢花粉。

2.2 油菜蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉活性成分對(duì)比檢測(cè)

油菜蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉活性成分對(duì)比采用高效液相色譜測(cè)定[11]，其色譜條件為色譜柱：Hypersil GOLD C18 2.1×150mm；柱溫：25℃；流動(dòng)相：甲醇：0.1%磷酸=45：55；檢測(cè)器：UV和PDA；進(jìn)樣量：5μl。

圖1 油菜蜂花粉高效液相色譜

圖2 油菜天然蜂巢花粉高效液相色譜

2.2.1 蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉活性成分檢測(cè)方法

分別準(zhǔn)確稱取蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉相同質(zhì)量，定容于50ml，取5 μl進(jìn)樣分析，得到如下色譜圖：蜂花粉見(jiàn)圖1、天然蜂巢花粉見(jiàn)圖2、仿生蜂巢花粉見(jiàn)圖3。

2.2.2 蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉活性成分對(duì)比分析

由表1可知，根據(jù)色譜分析的色譜峰保留時(shí)間和色譜峰面積對(duì)照分析，仿生蜂巢花粉與天然蜂巢花粉之間的活性物質(zhì)出峰位置完全一樣，活性物質(zhì)非常接近，而仿生蜂巢花粉與蜂巢花粉之間的活性物質(zhì)出峰位置也基本一樣，僅差一個(gè)峰的區(qū)別，其他活性物質(zhì)非常接近；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)仿生蜂巢花粉各活性物質(zhì)的色譜峰面積有所增加，說(shuō)明其活性物質(zhì)的含量有所增加，仿生蜂巢花粉可以完全替代蜂巢花粉和蜂花粉。

2.2.3 蜂花粉、蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉的總黃酮對(duì)比測(cè)定

2.2.3.1 測(cè)定方法

(1)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[12]

稱取0.0099 g蘆丁溶解于100 ml甲醇溶液，搖勻，得標(biāo)準(zhǔn)液；取標(biāo)準(zhǔn)液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml分別置于10 ml容量瓶中，加入蒸餾水使成5 ml；精密加入5%的亞硝酸鈉溶液0.3 ml，搖勻，放置5min；再加入10%硝酸鋁溶液0.3 ml,搖勻，放置6min；再加入4% NaOH溶液4 ml；各用蒸餾水定容至刻度線，搖勻，放置10min。在510nm處測(cè)定吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）實(shí)驗(yàn)組

稱取仿生蜂巢花粉0.0275 g，用甲醇定溶至50 ml容量瓶中；稱取蜂花粉0.0126 g，用甲醇定容至50 ml容量瓶中；稱取天然蜂巢花粉0.0249 g，用甲醇定容至50 ml容量瓶中備用。

取仿生蜂巢花粉、蜂花粉和天然蜂巢花粉甲醇溶液5 ml加入到10 ml容量瓶，加入蒸餾水使成5 ml；精密加入5%的亞硝酸鈉溶液0.3 ml，搖勻，放置5min；再加入10%硝酸鋁溶液0.3 ml,搖勻，放置6min；再加入4%NaoH溶液4 ml；各用蒸餾水定容至刻度線，搖勻放置10min。在510nm處分別測(cè)定吸光度。

表1 蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉之間活性物質(zhì)含量峰值面積對(duì)比表

2.2.3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉總黃酮含量見(jiàn)表2。

2.2.4 蜂花粉、蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉總多糖對(duì)比測(cè)定

(1)測(cè)定方法—標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品適量，配制成含量為129.465mg/l標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別移取該標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml、1.5 ml、2.0 ml于具塞比色管，各精密加入5.0%苯酚溶液1.0 ml，搖勻，迅速精密加入硫酸5.0 ml，搖勻，放置10分鐘，置于40℃水浴中保溫15分鐘，取出迅速冷卻至室溫，以相應(yīng)試劑為空白，依照紫外可見(jiàn)光譜儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度檢測(cè)，系列標(biāo)準(zhǔn)溶液葡萄糖含量分別為：25.893μg、51.786μg、77.697μg、103.572μg、129.1975μg、258.93μg，測(cè)得該系列標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度值分別為：0.291、0.429、0.553、0.707、0.829、1.197、1.468，空白溶液吸光度值為0.125，得標(biāo)準(zhǔn)曲線如下圖：

（2）蜂花粉、蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉總多糖測(cè)定

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉總多糖含量見(jiàn)表3。

圖3 油菜仿生蜂巢花粉高效液相色譜

2.2.5 蜂花粉、蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉淀粉酶、蛋白酶的對(duì)比測(cè)定

淀粉活性酶測(cè)定按GB/T18932.16-2003方法，蛋白活性酶測(cè)定按GB/T23527-2009方法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4：

表2 蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉的總黃酮含量結(jié)果

表3 蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉的總多糖含量結(jié)果

表4 蜂花粉、蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉淀粉酶、蛋白酶測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

蜂巢花粉是蜜蜂真正的天然食物，是蜜蜂采集植物花粉過(guò)程或在蜂房?jī)?nèi)摻入自身唾液與蜂蜜后釀造成熟的產(chǎn)品，蜜蜂及其幼蟲(chóng)缺食蜂巢花粉，將造成群勢(shì)下降、幼蟲(chóng)不能完全羽化。根據(jù)蜜蜂釀制花粉的原理，我們采用多級(jí)發(fā)酵技術(shù)確立了仿生蜂巢花粉的制備方法；通過(guò)蜂花粉、蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉（三種材料都是油菜花粉）對(duì)比研究試驗(yàn)，根據(jù)色譜分析的色譜峰保留時(shí)間和色譜峰面積對(duì)照分析，仿生蜂巢花粉與天然蜂巢花粉之間的活性物質(zhì)出峰位置完全一樣，活性物質(zhì)成分非常接近，而仿生蜂巢花粉與蜂巢花粉之間的活性物質(zhì)出峰位置也基本一樣，僅差一個(gè)峰的區(qū)別，其他活性物質(zhì)成分也非常接近；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，仿生蜂巢花粉各活性物質(zhì)的色譜峰面積有所增加，說(shuō)明其活性物質(zhì)的含量有所增加，因此仿生蜂巢花粉可以完全替代蜂巢花粉和蜂花粉。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)仿生蜂巢花粉中的活性化學(xué)成分含量高于蜂花粉、蜂巢花粉的含量，另外通過(guò)對(duì)不同花粉淀粉酶、蛋白酶的對(duì)比檢測(cè)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)仿生蜂巢花粉中，這兩種活性酶的含量與蜂巢花粉的含量十分接近。

致謝：本課題研究受甘肅省科技支撐計(jì)劃《多級(jí)仿生蜂花粉的制造及其制劑的制備研究》（No：0708NKCE080，2009-2011）、《仿生蜂花粉系列制劑產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)》（No：1204 NKCE102,2012-2014）及《天水蜂產(chǎn)品品質(zhì)優(yōu)化工藝技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)》（No：144NKCE244,2014-2015）的支持，表示感謝。

[1]劉建濤，趙利，蘇偉．蜂花粉生物活性物質(zhì)的研究進(jìn)展[J]．食品科學(xué)，2006，37(12)：58－63．

[2]厲聞，曹煒，束紀(jì)蔣.蜂花粉提取物抗氧化作用的研究[J].西北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)網(wǎng)絡(luò)版)2004，2(10)：1-6.

[3]孫麗萍，田文禮,董捷.蜂花粉營(yíng)養(yǎng)液的營(yíng)養(yǎng)成分分析[J].中國(guó)養(yǎng)蜂,2005,56(7):6-7.

[4]王小艷，王洪倫，劉永軍，等.油菜蜂花粉總黃酮幾種提取方法的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),2007,(19):318-321.

[5]阮征，胡筱波，賴富饒，等.油菜花粉中黃酮類物質(zhì)提取工藝的優(yōu)化研究[J].食品科學(xué),2007,28(7):133-137.

[6]李福高，章振東，倪贇榮，等.花粉活性成分的提取與分離現(xiàn)狀及展望[J].蜜蜂雜志,2007,(6):7-10.

[7]李英華.中國(guó)花粉化學(xué)成分的研究進(jìn)展 [J].養(yǎng)蜂科技,2005 (4):16-18.

[8]戚薇，喬琳，杜連祥．蜂花粉的固態(tài)發(fā)酵工藝[J]．食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30(12)：56-60.

[9]熊曉輝，梁劍光，熊強(qiáng)．納豆激酶液體發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]．食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30(1)：62-66.

[10]任乃艷，盧榮，程妮，等．蜂花粉活性成分的研究進(jìn)展[J]．中國(guó)蜂業(yè)(學(xué)術(shù)版)，2011,62(10)：76-77．

[11]朱恩圓，竇玉玲，魏東芝，等．蜂膠HPLC指紋圖譜及質(zhì)量控制[J]．中國(guó)中藥雜志，2005，30(18)：1423-1425．

[12]李軍，龔維桂.油菜蜂花粉的黃酮化學(xué)成分研究[J]．浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，1990，(3)：14-15．