李 娜，王倩倩，楊麗娟，劉 巍，孫祥德

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003)

4-甲氧基-N-(4-(3-嗎啉基丙氧基)苯基)-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯甲酰胺與人血清白蛋白的相互作用研究

李 娜，王倩倩，楊麗娟，劉 巍，孫祥德*

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003)

應(yīng)用分子對接模擬技術(shù)結(jié)合熒光猝滅法、同步熒光法、三維熒光法和紫外-可見光譜法，模擬生理條件(pH 7.4)，在298 K和310 K溫度下，研究了人血清白蛋白(HSA)與4-甲氧基-N-(4-(3-嗎啉基丙氧基)苯基)-3-(4-(吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯甲酰胺(1z)之間的相互作用。發(fā)現(xiàn)1z的加入引起了HSA內(nèi)源熒光的靜態(tài)猝滅，蛋白構(gòu)象發(fā)生改變。理論研究與實(shí)驗結(jié)果相結(jié)合研究了蛋白與藥物的作用機(jī)理，從而為進(jìn)一步尋找治療慢性粒細(xì)胞白血病的藥物小分子提供了實(shí)驗依據(jù)。

1z；HSA；相互作用；熒光光譜；分子對接；紫外吸收光譜

圖1 1z的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecule structure of 1z

研究1z與人HSA的相互作用，了解其作用機(jī)理、作用后蛋白質(zhì)構(gòu)型的變化等具有重要的理論意義。1z與HSA的相互作用研究尚未見報道，在本課題組前期研究1z與牛血清白蛋白的基礎(chǔ)上，本工作模擬生理pH 7.4下采用熒光猝滅法、同步熒光法、三維熒光法和紫外-可見光譜法結(jié)合分子對接技術(shù)研究了1z與HSA的相互作用，對進(jìn)一步了解1z的藥理活性和代謝穩(wěn)定性有指導(dǎo)意義。

1 實(shí)驗部分

1.1 儀器與試劑

熒光分光光度計(日本，島津RF-5301PC)；紫外-可見分光光度計(日本，島津UV-2550)；精密數(shù)顯酸度計(上海，雷磁PHS-3C)；電子分析天平(德國，梅特勒)；Sybyl-X 2.0(Tripos公司，西安交通大學(xué)藥學(xué)院藥物所提供)。三羥甲基氨基甲烷(Tris,上海精細(xì)化工試劑有限公司)，人血清白蛋白(HSA,Sigma,美國)；1z由西安交通大學(xué)藥學(xué)院藥物所提供(純度>99.0%)；實(shí)驗用水為雙蒸水；試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 熒光猝滅光譜 精密移取濃度為1.0×10-6mol·L-1HSA溶液2.0 mL于1 cm石英熒光池中，逐次加入1z溶液進(jìn)行滴定,配制成濃度分別為0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0×10-6mol·L-1的1z系列溶液，搖勻后靜置反應(yīng)10 min，掃描溶液300～450 nm波長的熒光光譜。設(shè)置Ex=279 nm，狹縫寬度nEm和nEx分別為2.5 nm和5.0 nm。

1.2.2 恒波長同步熒光分析Em和Ex保持固定的波長間隔差Δλ分別為60和15 nm，同時掃描激發(fā)和發(fā)射兩個單色器波長，得到體系的同步熒光光譜。

1.2.3 三維熒光光譜 掃描Ex=200～320 nm，Em=300～440 nm，其他條件同“1.2.1”。

1.2.4 紫外吸收光譜 以Tris-HCl 緩沖液為參比，在200～450 nm波長范圍內(nèi)掃描不同濃度的1z-HSA溶液體系的紫外吸收光譜。

1.2.5 分子對接 本研究的高級結(jié)構(gòu)取自于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(RCSB)中(PDB ID：1H9Z)，1z的初始結(jié)構(gòu)由分子模擬軟件包SYBYL-X 2.0生成，使用SYBYL-X 2.0中的Surflex模塊將HSA與1z進(jìn)行對接。Surflex模塊使用protomol-base法和經(jīng)驗導(dǎo)出的打分函數(shù)自動計算到受體的配體結(jié)合位點(diǎn)。對接時，將配體水分子除去，并加入極性氫原子。其它參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。該配體1z反復(fù)對接到HSA的活性位點(diǎn)，將對應(yīng)于最低能量評分對接構(gòu)象選為最可能的結(jié)合構(gòu)象做進(jìn)一步的分析。

歌曲僅以6個修辭、9處典故及意象就勾畫出愛情悲劇的畫卷，這是方文山的成功，也是“中國風(fēng)”歌曲邁出重要一步的成功。

圖2 不同濃度lz下，HSA 體系的熒光猝滅光譜Fig.2 Fluorescence quenching spectra of HSA at different concentrations of 1z T=298 K；cHSA=1×10-6 mol·L-1;c1z(1-11)： 0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5, 5.0×10-6 mol·L-1;pH 7.4

2 結(jié)果與討論

2.1 HSA的熒光猝滅光譜與其猝滅機(jī)制

HSA的熒光猝滅光譜顯示(圖2)，HSA的熒光強(qiáng)度隨1z濃度的增加逐步降低，最大發(fā)射波長從345 nm藍(lán)移到338 nm，表明1z的加入導(dǎo)致HSA熒光猝滅，熒光生色團(tuán)酪氨酸、色氨酸所處介質(zhì)的疏水性增加。

將測得實(shí)驗數(shù)據(jù)按Stern-Volmer猝滅方程[7-8]處理，進(jìn)一步推斷猝滅機(jī)理：

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+Ksv[Q]

(1)

在298 K和310 K下以猝滅劑1z滴加前后的熒光強(qiáng)度比F0/F對1z濃度[Q]作曲線，其中τ0為1z不存在時HSA的分子平均壽命(10-8s)[9-12]。由斜率求得猝滅常數(shù)Ksv和Kq，298 K時分別為6.76×104和6.76×1012mol·L-1；310 K時分別為5.55×104和5.55×1012mol·L-1。Kq的值在1012數(shù)量級，與猝滅劑對生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)2.0×1010L·mol-1·s-1相差百倍[12]，因此初步判斷1z對HSA的熒光猝滅不是由動態(tài)碰撞引起。而變溫試驗測定結(jié)果表明，Ksv隨溫度升高而降低，進(jìn)一步說明1z的加入使HSA發(fā)生了靜態(tài)猝滅。

2.2 結(jié)合常數(shù)K與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n

1z與HSA發(fā)生作用時所處的平衡狀態(tài)可由結(jié)合常數(shù)表達(dá)式描述[13-16]：

(2)

固定HSA的濃度，改變1z的濃度[Q]，以lg[(F0-F)/F]對lg[Q]作圖，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n和結(jié)合常數(shù)K列于表1。由表1可以看出結(jié)合位點(diǎn)數(shù)約為1，說明化合物與HSA在實(shí)驗濃度范圍內(nèi)以1∶1結(jié)合，1z與HSA有較強(qiáng)的結(jié)合力。隨著溫度的升高，化合物與HSA的結(jié)合常數(shù)由8.60×104mol·L-1降至6.86×104mol·L-1，HSA-1z復(fù)合物的穩(wěn)定性下降。進(jìn)一步說明1z對HSA猝滅過程為靜態(tài)猝滅。

表1 結(jié)合常數(shù)Table 1 Binding constants

2.3 1z對HSA構(gòu)象的影響

2.3.1 同步熒光光譜法 通過測量發(fā)射光譜最大吸收波長的偏移來研究氨基酸殘基的微環(huán)境，可以了解藥物分子對蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響。圖3A和B為不同系列濃度的1z與HSA溶液在Δλ分別為15 nm和60 nm時的同步熒光光譜，其中圖3A表示酪氨酸殘基的光譜特性，圖3B表示色氨酸殘基的熒光特性[17]。由圖3可知，1z使HSA色氨酸殘基的最大發(fā)射峰波長發(fā)生藍(lán)移，而對酪氨酸殘基無影響，說明1z的加入使色氨酸殘基的親水性降低，微環(huán)境發(fā)生變化，構(gòu)象發(fā)生改變。并且1z使色氨酸熒光強(qiáng)度猝滅的幅度遠(yuǎn)大于酪氨酸殘基，可以看出HSA的熒光主要由色氨酸貢獻(xiàn)，且1z和HSA的色氨酸殘基的相互作用較強(qiáng)。

2.3.2 三維熒光光譜法 三維熒光光譜能直觀地顯示出熒光峰的位置、高度以及光譜的某些特性，可以有效的研究溶液狀態(tài)下蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化[18-19]。圖4A和4B分別是pH 7.4的Tris-HCl緩沖溶液中HSA和HSA-1z的三維熒光光譜，其中圖4中的兩條逐漸升高的“山脊”形峰為瑞利散射線。從圖中可以看出，加入1z后，HSA的瑞利散射峰明顯增強(qiáng)；兩個“駝峰”峰1和峰2 分別表示色氨酸和酪氨酸殘基峰以及HSA的多肽骨架結(jié)構(gòu)，加入1z后，兩駝峰的峰高明顯降低(圖4B)，表明熒光的相對強(qiáng)度降低，其中峰1的最大發(fā)射峰波長發(fā)生了略微藍(lán)移(約藍(lán)移11 nm，從340 nm到329 nm)，說明HSA的周圍微環(huán)境極性降低，與熒光猝滅光譜和同步熒光光譜的結(jié)果相一致。

圖5 1z與HSA的分子對接圖Fig.5 Molecular docking of 1z to HSA

圖6 加入1z前后HSA的紫外吸收光譜Fig.6 Absorption spectra of HSA in the absence and presence of 1zpH=7.4,T=298 K;1.c1z=1.0×10-6 mol·L-1;2.cHSA= 1.0×10-6 mol·L-1;3.1z-HSA(molar ratio：1∶1); 4.1z-HSA(molar ratio：2∶1)

2.3.3 分子對接 計算機(jī)分子對接可直觀顯示出1z與HSA的相互作用情況,對從理論上確定藥物與蛋白相互作用的鍵合機(jī)理和模式[20-22]有較大幫助。圖5為1z與HSA的分子對接圖，對接的打分值為9.589 9，1z通過靜電力嵌入到HSA的Ⅱ亞域的位點(diǎn)Ⅰ中，這是由HSA分子中的疏水性氨基酸殘基之間形成的疏水腔。1z進(jìn)入疏水腔后，1z結(jié)構(gòu)中的嗎啉環(huán)丙氧基位的氧與HSA主鏈的ARG257上的氨基形成了氫鍵，嘧啶環(huán)上的氮與ARG222上的羰基形成了氫鍵，以及吡啶環(huán)上的氮與ARG218的羰基形成了氫鍵。這些靜電力、疏水作用與氫鍵力共同作用，使得HSA的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。

2.3.4 紫外吸收光譜 分別測定了[HSA]，[1z]，[HSA∶1z=1∶1]和[HSA∶1z=2∶1]的紫外吸收光譜(圖6)?？梢杂^察到，單獨(dú)1z的紫外吸收很小，單獨(dú)HSA在207 nm和277 nm處有兩個吸收峰。隨著1z的加入，HSA的紫外吸收光譜強(qiáng)度增大，這表明1z與HSA發(fā)生了較強(qiáng)的相互作用，形成了HSA-1z復(fù)合物。且在277 nm處可觀察到約3 nm的藍(lán)移，表明1z改變了HSA肽鍵周圍的微環(huán)境，疏水性增加。其間的相互作用改變了HSA的二級結(jié)構(gòu)。

3 結(jié) 論

本文研究了1z與HSA之間的相互作用，結(jié)果表明1z對HSA的內(nèi)源性熒光具有較強(qiáng)的猝滅作用，猝滅特征表現(xiàn)為靜態(tài)猝滅。通過測定1z與HSA的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，以及同步熒光、三維熒光、紫外光譜、分子對接等數(shù)據(jù)可知，疏水作用、靜電作用和氫鍵在1z-HSA結(jié)合中起主要作用，且1z-HSA復(fù)合物的形成改變了HSA的二級結(jié)構(gòu)。這與本課題組前期研究的1z與BSA的相互作用動態(tài)猝滅機(jī)制有一定的差別[3]。相關(guān)研究為后期研究金屬離子對藥物與蛋白相互作用的影響提供了一定基礎(chǔ)。

[1] Yang J L.Oncol.Prog.(楊建良．癌癥進(jìn)展雜志),2007，5(2):173-177．

[2] Pan X Y,Wang F,Zhang Y M,Gao H P,Hu Z G,Wang S C,Zhang J.Bioorg.Med.Chem.,2013,21：2527-2534.

[3] Li N,Cui L S,Yang L J,Wang Q Q，Liu W，Sun X D.J.XinxiangMed.Univ.(李娜，崔柳蘇，楊麗娟,王倩倩，劉巍，孫祥德．新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報),2015，32(10) ：899-902，906．

[4] O’Hare T,Walters D K,Stoffregen E P,Jia T,Manley P W,Mestan J，Cowan-Jacob S W,Lee F Y，Heinrich M C.CancerRes.,2005,65：4500-4505.

[5] Deguchi Y,Kimura S,Ashihara E,Niwa T,Hodohara K,FujiyamaY,Maekawa T.LeukocyteRes.,2008,32：980-983.

[6] Redaelli S,Piazza R,Rostagno R,Magistroni V,Perini P,Marega M,Gambacorti-Passerini C J.Clin.Oncol.,2009,27：469-471.

[7] Qu L B,Wang L,Yang R,Chen X L,Li P.ActaPharm.Sin.(屈凌波，王玲，楊冉，陳曉嵐，李萍．藥學(xué)學(xué)報),2006，41(4)：352-357.

[8] Yu C H,Zhang Y D,Gao Q Q,Hei T T,Li L,Zhang Q.Spectrosc.SpectralAnal.(郁彩虹，張耀東，高裙裙，黑婷婷，李麗，張琦．光譜學(xué)與光譜分析),2011,31(8):2151-2155.

[9] Zhang H R,Guo S Y,Li L,Cai M Y,Jin W J,Liu C S.Spectrosc.SpectralAnal.(張海容，郭祀遠(yuǎn)，李琳，蔡妙顏，晉衛(wèi)軍，劉長松．光譜學(xué)與光譜分析),2001,21(6):829-832.

[10] Lakowica J R,Weber G.Biochemistry,1973,12:4161-4170.

[11] Li G X,Li J Q,Wei Y X,Dong C.Spectrosc.SpectralAnal.(李改仙，李建晴，魏玉霞，董川．光譜學(xué)與光譜分析),2005,25(8):1277-1280.

[12] Song Z Y,Han D,Wang J,Tong Y J，Gao X Y，Wen W，Zhang A P.J.Instrum.Anal.(宋志英，韓冬，王娟，仝月菊，高曉亞，文雯，張愛平．分析測試學(xué)報),2013,32(1):23-31.

[13] Xie M X,Xu X Y,Wang Y D,Liu Y.ActaChim.Sin.(謝孟峽，徐曉云，王英典，劉媛．化學(xué)學(xué)報),2005，63(22)：2055-2062.

[14] Jiang M,Xie M X,Zheng D,Liu Y,Li X Y,Chen X.J.Mol.Struct.,2004,692：71-80.

[15] Luo X,Du C,Wei J,Deng J,Lin Y,Lin C.Luminescence,2013,28(2)：202-210.

[16] Bi S Y,Qiao C Y,Song D Q,Tian Y,Gao D J,Sun Y,Zhang H Q.Sens.ActuatorsB,2006,119(1)：199-208.

[17] Bi S Y,Song D Q,Tian Y.Zhou X,Liu Z Y,Zhang H Q.Spectrochim.Acta：A,2005,61(4)：629-636.

[18] Abert W C,Gregory W M,Allan G S.Anal.Biochem.,1993,213：407-413.

[19] Khan A B,Khan J M,Ali M S,Khan R H,Din K.ColloidsSurf.,2011,87：447-453.

[20] Cheng Z.Spectrochim.ActaA,2012,93:321-330.

[21] Li Y,Gu Y,He J,He H,Zhou Y,Chuong P H.ActaChim.Sin.(李悅，谷雨，何佳，何華，周祎．Chuong Pham-Huy.化學(xué)學(xué)報),2012,70(2):143-150.

[22] Morris G M,Huey R,Lindstrom W,Sanner F M,Belew R K,Goodsell D S,Olson A J.J.Comput.Chem.,2009,30(16):2785-2791.

Molecular Modeling and Spectroscopic Studies on Interaction of 4-Methoxy-N-[4-(3-morpholin-4-yl-propoxy)-phenyl]-3-(4-pyridin-3-yl-pyrimidin-2-ylamino)-benzamide with Human Serum Albumin

LI Na,WANG Qian-qian，YANG Li-juan,LIU Wei,SUN Xiang-de*

(College of Pharmacy,Xinxiang Medical University,Xinxiang 453003,China)

Combined with molecular docking model,quenching fluorescence,synchronous fluorescence,tridimensional fluorescence and UV-Vis absorption spectroscopy were applied to investigate the interactions of 4-methoxy-N-[4-(3-morpholin-4-yl-propoxy)-phenyl]-3-(4-pyridin-3-yl-pyrimidin-2-ylamino)-benzamide(1z) and human serum albumin(HSA) under simulative physiological conditions(pH 7.4) at the temperature of 298 K and 310 K,and the interaction mechanism was studied.The results showed that the quenching of 1z to HSA is probably a static process,and the conformation of HSA altered with the addition of 1z.The combination of theoretical research and experimental result provides a basis for studying the action mechanism of protein with drug,which further provides a certain experimental basis for study of small molecules of drugs in treatment of chronic myeloid leukemia.Key words：1z;HSA;interaction;fluorescence spectrum;molecular docking;UV-Vis absorption spectroscopy

2016-08-24；

2016-10-24

河南省教育廳自然科學(xué)計劃項目(14A150010)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.05.014

O657.3；O629.73

A

1004-4957(2017)05-0660-05

*通訊作者：孫祥德,教授,研究方向：藥物分析學(xué)，Tel：0373-3831662，E-mail：sunxd@xxmu.edu.cn