張曉男，聶繼云，閆 震，程 楊，王玉嬌

(中國農業(yè)科學院 果樹研究所/農業(yè)部果品質量安全風險評估實驗室(興城)，遼寧 興城 125100)

研究報告

UPLC-MS/MS同時檢測蘋果及其制品中的7種真菌毒素

張曉男，聶繼云*，閆 震，程 楊，王玉嬌

(中國農業(yè)科學院 果樹研究所/農業(yè)部果品質量安全風險評估實驗室(興城)，遼寧 興城 125100)

建立了蘋果及5種蘋果制品中7種真菌毒素(PAT，OTA，AOH，AME，ALT，TEN，TeA)的超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法。準確稱取蘋果及5種蘋果制品各10 g(液體樣品量取10 mL)，加入10 mmol/L檸檬酸乙腈溶液進行提取，再加入4 g 4A型分子篩和1 g氯化鈉除水鹽析，離心后上清液采用C18凈化，最后采用0.22 μm聚四氟乙烯膜(PTFE)過濾進行UPLC-MS/MS檢測。7種真菌毒素在2～150 μg/L范圍內線性關系良好(r2>0.99)；檢出限為0.02～1.8 μg/L，方法定量下限為1～5 μg/L。以10，50，100 μg/L濃度水平做加標回收實驗，回收率為71.8%～112.4%。此方法快速、高效，為蘋果及其制品中真菌毒素污染的風險監(jiān)測奠定了基礎。

真菌毒素；超高效液相色譜-串聯質譜；4A分子篩；蘋果；蘋果制品

蘋果是我國第一大果品[1]，至2014年，中國蘋果栽培面積和產量分別達到2 272.2×104hm2和4 092.32×104t，占全國水果栽培面積的18.4%和水果產量的15.65%[2]。除鮮食外，我國每年還有大量蘋果用于加工，在生產過程中，果實難免受到真菌病害侵染產生真菌毒素，從而對蘋果及其制品造成污染。研究表明，污染蘋果及其制品的真菌毒素主要棒曲霉素(Patulin，PAT)[3]、赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)[4]、交鏈孢酚(Alternariol，AOH)、交鏈孢酚單甲醚(Alternariolmonomethyl ether，AME)、交鏈孢烯(Altenuene，ALT)、騰毒素(Tentoxin，TEN)和細交鏈孢酮酸(Tenuazonic acid，TeA)[5]7種。目前，果品及其制品中真菌毒素的檢測方法主要有薄層色譜法[5]、高效液相色譜法[6]、液相色譜-質譜法(HPLC-MS)[6-9]、氣相色譜-質譜法(GC-MS)[10]等。有效的前處理方法是實現儀器分析的前提保證，目前用于真菌毒素分析的前處理方法包括免疫親和柱法[11]、多功能柱法[12]、QuEChERS方法[13]等。然而，這些方法檢測的真菌毒素種類有限，無法滿足蘋果及其制品中主要真菌毒素的同時檢測需求。本文以上述7種真菌毒素為對象，對樣品的提取凈化方法、色譜條件、質譜條件、基質效應等展開研究。通過篩選和優(yōu)化，提出適于蘋果及其制品中上述7種真菌毒素的前處理方法，建立了同時檢測蘋果及其制品中7種真菌毒素的UPLC-MS/MS方法，從而為蘋果及其制品中真菌毒素污染的風險監(jiān)測與評估奠定了方法基礎。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

甲醇、乙腈、甲酸銨、乙酸銨、甲酸、乙酸、檸檬酸(色譜純，美國Thermo Fisher Scientific公司)；C18(50 μm，60 ?)、PSA(40 μm，100 g)(美國Varian 公司)；無水MgSO4(優(yōu)級純，天津市津科精細化工研究所)；NaCl(優(yōu)級純，天津市科密歐化學試劑有限公司)；4A型分子篩(鈉-A型分子篩，國藥集團化學試劑有限公司)；有機濾膜(美國FINE Scientific公司)； PAT，AOH，AME，ALT，TEN，TeA，OTA標準品(純度≥98%，新加坡Pribolab公司)。

超高效液相色譜-串聯質譜儀(UPLC-MS/MS Xevo TQ，美國Waters公司)；立式大容量高速離心機(CF16RXⅡ，日本Hitachi公司)；全自動超純水制水機(Milli-Q Direcet 8，美國Millipore公司)；馬弗爐(M110，美國Thermo公司)；色譜柱(美國Waters公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 標準貯備液：準確稱取1 mg標準品于10 mL 容量瓶中，乙腈定容，配成100 mg/L的標準貯備液，儲存于-20 ℃冰箱中備用。基質空白標準工作溶液：利用本實驗前處理方法分別制備蘋果、蘋果汁、蘋果酒、蘋果醋、蘋果醬、蘋果罐頭的基質空白溶液，然后用基質空白溶液將標準貯備液稀釋至1，2，5，10，50，100，200 μg/L 7個濃度水平。

1.2.2 樣品前處理 分別準確吸取10 mL蘋果汁、蘋果醋、蘋果酒樣品于50 mL 具塞離心管中，蘋果、勻漿后的蘋果罐頭和蘋果醬則稱取10 g，加入10 mL提取液(10 mmol/L檸檬酸乙腈溶液)，劇烈振蕩3 min，然后加入4 g 4A型分子篩(400 ℃下烘干3 h，立即移至干燥箱中冷卻至室溫后使用)和1 g NaCl，劇烈振蕩1 min，9 000 r/min離心5 min，取2 mL上清液轉移至15 mL離心管中，加入60 mg凈化劑C18，渦旋振蕩1 min，靜置2 min，上清液過0.22 μm PTFE有機系濾膜，待測。

1.2.3 UPLC-MS/MS條件 色譜條件：Cortecs UPLC C18色譜柱；柱溫：35 ℃；流動相：A為甲醇，B為1 mmol/L乙酸銨；梯度洗脫程序：0～0.5 min，3%A；0.5～3.5 min，3%～90%A；3.5～4.5 min，90%A；4.5～4.6 min，90%～3%A；4.6～5.5 min，3%A；流速：0.3 mL/min；進樣體積：5 μL。

質譜條件：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正負同時掃描；毛細管電壓：0.5 kV；檢測方式：多反應監(jiān)測(MRM)；離子源溫度：150 ℃；去溶劑氣溫度：400 ℃；去溶劑氣和錐孔氣均為高純氮氣，流速分別為800 L/h和50 L/h；碰撞氣：高純氬氣，流速 0.14 mL/min。

2 結果與討論

2.1 色譜柱及柱溫的選擇

對比了BEH C18色譜柱[5,14-15]、BEH Hilic色譜柱和Cortecs UPLC C18色譜柱對7種真菌毒素的分離效果。結果表明，BEH Hilic色譜柱分析7種真菌毒素的出峰時間主要集中在0.85～1.05 min，不能將7種真菌毒素很好地分離。Cortecs UPLC C18色譜柱分析7種真菌毒素的峰形和響應值優(yōu)于BEH C18色譜柱，對Cortecs UPLC C18色譜柱的柱溫(30，35，40，45 ℃)進行了優(yōu)化，結果表明，當柱溫為35 ℃時，7種真菌毒素的峰形、響應值最好。本實驗最終采用Cortecs UPLC C18色譜柱進行分離，柱溫為35 ℃。

2.2 色譜-質譜條件的優(yōu)化

比較研究了甲酸[16]、乙酸[17]、緩沖鹽、乙酸銨[18]和水共5種水相與乙腈[19]、甲醇[20]2種有機相作為流動相時7種真菌毒素的分離效果。結果表明，以甲醇-乙酸銨作為流動相體系時，7種真菌毒素的峰形得到明顯改善，離子信號值增強，分離度較好，響應值為3.67×104～2.50×106。進一步優(yōu)化乙酸銨濃度(0.5，1.0，5.0，10.0，50.0 mmol/L)，結果表明乙酸銨濃度為1.0 mmol/L時，7種真菌毒素的出峰效果最佳。因此，實驗最終確定以甲醇和1.0 mmol/L乙酸銨作為流動相。

液相色譜分離時，若流動相為酸性，調低毛細管電壓可以提高檢測物質的靈敏度[21]。本實驗中流動相pH值為6.0，提取液pH值為3.79～5.77，當降低毛細管電壓至0.5 kV時，7種真菌毒素的響應值得到提高。所以本研究最終采用0.5 kV的毛細管電壓。采用流動注射泵連續(xù)進樣方式對MRM質譜條件進行優(yōu)化，分別在ESI+模式和ESI-模式下掃描，最終確定7種真菌毒素的MRM參數見表1。由于基質影響差別不大，以蘋果基質為例，50 μg/L混合標準溶液及50 μg/L加標蘋果樣品中7種真菌毒素的定量離子質譜圖見圖1。

表1 7種真菌毒素的串聯質譜檢測參數Table 1 MRM parameters for 7 mycotoxins analyzed

2.3 樣品前處理的優(yōu)化

本研究對前處理過程的提取溶劑、除水劑、凈化劑和濾膜進行優(yōu)化，分別考察了蘋果及其制品共6種不同基質，結果表明5種蘋果制品和蘋果的前處理條件并無差異，因此以蘋果基質作為代表，討論了樣品前處理的優(yōu)化結果。

圖2 檸檬酸濃度對7種真菌毒素回收率的影響Fig.2 Effect of citric acid concentration on recoveries of 7 mycotoxins

圖3 C18用量對7種真菌毒素回收率的影響Fig.3 Effect of C18 use level on recoveries of 7 mycotoxins

2.3.1 提取溶劑的優(yōu)化 選用極性和毒性均較低的乙腈[20]作為提取溶劑，并比較了乙腈、甲酸-乙腈[22]、乙酸-乙腈[23-24]、檸檬酸-乙腈[25]4種溶劑對7種真菌毒素回收率的影響。結果表明，采用純乙腈或乙酸-乙腈進行提取時，TeA的回收率不足50%；甲酸-乙腈提取時TeA的回收率為60.1%～68.6%；檸檬酸-乙腈提取時TeA的回收率為61.7%～78.8%，表明以檸檬酸-乙腈提取時的效果較好。進一步優(yōu)化了檸檬酸的濃度(1，5，10，50，100 mmol/L)，結果表明，以10 mmol/L檸檬酸-乙腈為提取溶劑時效果最好，7種真菌毒素的回收率為78.8%～116.6%，因此最終選擇10 mmol/L檸檬酸-乙腈作為提取溶劑(圖2)。

2.3.2 除水劑的優(yōu)化 比較了4A型分子篩和無水MgSO4對7種真菌毒素回收率的影響。結果表明，當使用無水MgSO4時，7種毒素的回收率為54.7%～109.7%，使用4A型分子篩時的回收率為81.6%～109.5%，表明4A型分子篩的提取效果高于無水MgSO4。這是由于4A分子篩是一種有效孔徑為0.4 nm的人工合成、具有微孔型立方晶格的硅鋁酸鹽，能有效吸附水、NH3、H2S、二氧化硫、二氧化碳等臨界直徑不大于0.4 nm 的分子，而本研究的7種真菌毒素的直徑均大于0.4 nm，不會被吸附，提取過程損失小，4A型分子篩用量對回收率無明顯影響，故本實驗采用4 g 4A分子篩作除水劑。2.3.3 凈化劑的優(yōu)化 比較了凈化劑C18和PSA對7種真菌毒素回收率的影響。結果表明，PSA對OTA有明顯的吸附作用，添加PSA凈化后，OTA的添加回收率小于10%。因此采用C18作為凈化劑進行凈化，并比較了C18用量(0，15，30，60，120 g)對樣品中7種真菌毒素回收率的影響。結果表明，每毫升提取液中加入30 mg C18時，7種真菌毒素的回收率為77.5%～103.7%(圖3)，凈化效果好，回收率高。2.3.4 濾膜的選擇 比較了尼龍膜(Nylon)、聚醚砜膜(PES)、聚偏二氟乙烯膜(PVDF)、混合纖維素酯(MCE)和聚四氟乙烯膜(PTFE) 5種一次性濾膜對7種真菌毒素回收率的影響。結果表明，Nylon膜會對AOH和AME產生明顯的吸附作用，PES膜對AME產生吸附作用。采用PTFE膜時，7種真菌毒素的回收率為96.4%～106.5%，能有效過濾雜質和最大限度減少樣品損失，因此本實驗選擇0.22 μm的PTFE濾膜進行過濾。

2.4 基質效應

基質效應(Matrix effects，ME)是指色譜分離時，共洗脫的物質使目標分析物的檢測靈敏度和準確性降低的現象[26]。選取6種100 μg/L的基質空白標準工作溶液與溶劑標準溶液比較，按照公式ME=(A-B)/B×100%計算7種真菌毒素在不同基質中的基質效應[27]，其中A和B分別為空白基質標準溶液和溶劑標準溶液的響應值。當平均基質效應(增強或抑制)超過20%，則認為基質效應對定量檢測具有顯著影響。結果表明，基質對多數真菌毒素均存在顯著影響(見表2)。本研究在優(yōu)化色譜-質譜分析條件的基礎上，采用樣品空白基質配制標準曲線對7種真菌毒素進行定量分析，以補償基質效應。

表2 7種真菌毒素在不同樣品中的基質效應Table 2 Matrix effects of 7 mycotoxins in different samples

(續(xù)表2)

MycotoxinMatrixeffect(%)AppleApplejuiceApplewineAppleacidApplejamCannedappleALT74 0303 988 52 9263 5179 8TEN39 1-42 512 60 6-49 0-98 9TeA11 265 14 215 834 0-45 0

2.5 方法學評價

2.5.1 標準方程、相關系數、檢出限與定量下限 在優(yōu)化條件下，用蘋果空白基質配制一系列質量濃度(2，5，10，50，100，150 μg/L)的真菌毒素溶液，上機檢測。結果表明7種真菌毒素在2～150 μg/L范圍內具有良好的線性關系，r2≥0.992 8。檢出限(S/N=3)為0.02～1.80 μg/L，采用加標回收的方法得出方法定量下限，設置1，2，5 μg/L加標水平，計算回收率，獲得7種真菌毒素的方法定量下限(S/N=10)為1～5 μg/L(見表3)。

表3 7種真菌毒素的線性方程、檢出限及定量下限Table 3 Linear equations,LODs and LOQs of 7 mycotoxins

x：concentration(μg·L-1)；y：response

2.5.2 回收率與精密度 在蘋果及其制品中分別添加10，50，100 μg/L 3個濃度水平的混合標準溶液，進行加標回收率實驗，每個濃度水平重復5次。結果表明，7種真菌毒素的回收率為71.8%～112.4%(見表4)。本方法對蘋果及其制品中不同含量的7種真菌毒素的回收率均符合NY/T 788-2004標準[28]。

表4 蘋果及其制品中7種真菌毒素的加標回收率Table 4 Spiked recoveries of 7 mycotoxins in apple and its products

(續(xù)表4)

SampleMycotoxinAdded10μg/LAdded50μg/LAdded100μg/LRecovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)AppleacidPAT102 66 494 14 599 85 8OTA97 312 698 48 397 82 4AOH91 35 495 62 499 23 0AME99 65 299 96 698 83 1ALT103 71 096 18 295 46 6TEN103 810 099 13 198 96 0TeA87 25 592 01 293 37 6ApplejamPAT98 712 698 33 998 61 6OTA99 95 3102 74 799 31 5AOH91 92 9102 81 499 21 6AME88 512 398 14 6100 05 8ALT93 54 898 26 199 61 8TEN101 612 498 36 4101 75 3TeA88 53 288 03 890 53 5CannedapplePAT98 712 597 92 0100 11 2OTA99 77 6103 33 5100 21 0AOH98 67 199 22 799 72 0AME95 75 199 43 699 02 5ALT105 67 9101 60 899 91 6TEN95 312 790 215 3100 010 3TeA90 88 893 82 390 41 6

2.6 實際樣品的檢測

采用本方法檢測20個蘋果、41個蘋果汁、10個蘋果酒、34個蘋果醋、14個蘋果醬、5個蘋果罐頭共124個樣品。結果顯示，6類樣品中真菌毒素的檢出率分別為0，17.1%，2.9%，0，0，21.4%。其中，蘋果汁中檢出PAT(11.1～13.8 μg/L)，AOH(0.28～3.7 μg/L)，AME(0.6～0.81 μg/L)，ALT(0.48～1.1 μg/L)，TEN(2.2～3.1 μg/L)和TeA(11.9～20.6 μg/L) 6種真菌毒素，蘋果醋中檢出AME(1.77 μg/L)和TeA(14.5 μg/L)兩種真菌毒素，蘋果醬中檢出AME(1.17～4.42 μg/L)和TEN(10.1 μg/L)兩種真菌毒素。表明方法可用于實際樣品的檢測。

3 結 論

本文建立了超高效液相色譜-串聯質譜同時檢測蘋果及5種蘋果制品中7種真菌毒素的定量分析方法，并采用了新型除水劑4A型分子篩。本方法在檢測速度、靈敏度、準確度、精密度、成本、環(huán)保以及檢測真菌毒素種類方面有顯著改進和優(yōu)勢，適合于此類真菌毒素在蘋果及其制品中污染水平的研究。

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Simultaneous Detection of 7 Kinds of Mycotoxins in Apple and Its Products by UPLC-MS/MS

ZHANG Xiao-nan,NIE Ji-yun*,YAN Zhen,CHENG Yang,WANG Yu-jiao

(Institute of Pomology,Chinese Academy of Agricultural Sciences/Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Fruit (Xingcheng),Ministry of Agriculture,Xingcheng 125100,China)

A rapid and accurate method was developed for the determination of 7 mycotoxins (PAT,OTA,AOH,AME,ALT,TEN and TeA) in apple,apple juice,apple wine,apple acid,apple jam and canned apples by UPLC-MS/MS.10 g of the sample(10 mL of liquid sample) was precisely weighed,and extracted with acetonitrile containing 10 mmol/L citric acid solution,then 4 g of 4A molecular sieve and 1 g of NaCl were added.After oscillation and centrifugation,the liquid supernatant was purged with C18decontaminant.Finally,it was filtered through a 0.22 μm PTFE membrane and analyzed by UPLC-MS/MS.The method showed good linear relationships for 7 mycotoxins in the concentration range of 2-150 μg/L with correlation coefficients above 0.99.The detection limits were in the range of 0.02-1.8 μg/L,and the limits of quantitation were 1-5 μg/L.The recoveries of 7 mycotoxins were between 71.8% and 112.4% at three spiked concentrations levels of 10,50,100 μg/L.This method is rapid and efficient in the simultaneous detection of 7 mycotoxins in apple and its products.This will lay a foundation for the risk monitoring of mycotoxin contamination in apple and its products.

mycotoxin;UPLC-MS/MS;4A molecular sieve;apple;apple product

2017-02-03；

2017-03-14

農產品質量安全風險評估重大專項(GJFP2016003,GJFP2017003)；中國農業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程(CAAS-ASTIP)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.05.002

O657.63;S852.44

A

1004-4957(2017)05-0588-07

*通訊作者：聶繼云，博士，研究員，研究方向：果品質量安全，Tel:0429-3598178，E-mail:jiyunnie@163.com