張 月，王耀一，武雪亮，周海豐，梁晚平(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院乳腺外科,張家口 075000;通訊作者,E-mail:zhangyue906@tom.com)

SNS314對(duì)乳腺癌細(xì)胞T47D生長(zhǎng)的影響

張 月，王耀一，武雪亮，周海豐，梁晚平*
(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院乳腺外科,張家口 075000;*通訊作者,E-mail:zhangyue906@tom.com)

目的 探討SNS314對(duì)體外培養(yǎng)人乳腺癌T47D細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。 方法 用0,0.001,0.01,0.1,1,10 μmol/L SNS314分別處理T47D細(xì)胞，采用MTT法評(píng)價(jià)SNS314對(duì)人類乳腺癌細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。Western blot檢測(cè)總AuroraA(T-Aurora A)、磷酸化Aurora A(p-Aurora A)、磷酸化組蛋白(p-Histone H3)、總組蛋白(T-Histone H3)和凋亡相關(guān)蛋白以及Cyclin B1表達(dá)水平的變化。免疫熒光檢測(cè)多核細(xì)胞形成，Annexin Ⅴ-FITC與PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。 結(jié)果 不同濃度的SNS314分別處理T47D細(xì)胞24 h、48 h，T47D增殖明顯抑制，IC50分別為(2.684±0.429)μmol/L和(0.309±0.510)μmol/L；流式細(xì)胞術(shù)顯示隨著濃度增加，G2/M期細(xì)胞由(21.40±0.53)%升高至(93.73±0.06)%，G2/M期阻滯呈劑量依賴性；Western blot顯示SNS413處理后p-Aurora A、p-Histone H3蛋白表達(dá)受到抑制，Cyclin B1的表達(dá)下調(diào)，Bcl-2表達(dá)降低，促進(jìn)PARP蛋白剪切及增強(qiáng)Bax表達(dá)。免疫熒光檢測(cè)到多核細(xì)胞，Annexin Ⅴ-FITC與PI雙染檢測(cè)顯示細(xì)胞凋亡率由(2.07±0.21)%增加到(32.47±2.65)%，與SNS314 0 μmol/L組比較，凋亡率顯著增加(P<0.05)。 結(jié)論 SNS314抑制乳腺癌細(xì)胞T47D的增殖、誘導(dǎo)凋亡，且呈劑量依賴性。

乳腺癌； SNS314； Aurora激酶； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞凋亡

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，對(duì)女性的健康與生命安全構(gòu)成嚴(yán)重的威脅，據(jù)我國(guó)疾病預(yù)防控制中心流行病學(xué)調(diào)查乳腺癌位居我國(guó)女性惡性腫瘤第一位[1]。研究表明Aurora 激酶與乳腺癌的關(guān)系比較密切，乳腺癌中Aurora A和Aurora B的表達(dá)是比較常見(jiàn)的，表達(dá)率為26%-94%，Aurora激酶已經(jīng)作為分子靶點(diǎn)表現(xiàn)了抗腫瘤能力，Aurora激酶家族為絲/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞周期調(diào)控中起著重要的作用，Aurora激酶的過(guò)表達(dá)會(huì)干擾有絲分裂檢查點(diǎn)的功能，導(dǎo)致遺傳的不穩(wěn)定性和誘發(fā)腫瘤的增長(zhǎng)。SNS314作為小分子Aurora激酶抑制劑，可同時(shí)抑制Aurora A、B，有研究表明SNS314具有抑制細(xì)胞增殖的效應(yīng)，抑制組蛋白H3的磷酸化、阻止細(xì)胞周期進(jìn)程，使細(xì)胞失去生存能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，但其對(duì)乳腺癌T47D細(xì)胞的作用研究不多。本研究的實(shí)驗(yàn)主要檢測(cè)SNS314抑制人乳腺癌T47D細(xì)胞的增殖效應(yīng)，誘導(dǎo)凋亡并且初步探討與其相關(guān)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

人乳腺癌細(xì)胞株T47D由河北北方學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供；SNS314購(gòu)自美國(guó)Selleck公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司；BCA蛋白分析試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司；DAPI染液購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司； p-Aurora A、p-Histone H3、Aurora A、Histone H3、PARP、Bcl-2、Bax一抗購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司；二抗購(gòu)自Santa Cruz 公司；FITC-Annexin Ⅴ凋亡試劑盒購(gòu)于BD公司(美國(guó))。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

對(duì)照組T47D細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)液中，內(nèi)加10%胎牛血清、人青霉素(濃度100 U/ml)和鏈霉素(濃度100 μg/ml)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),處理組分別給予SNS314 0.001,0.01,0.1,1,10 μmol/L處理。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞生存率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的T47D細(xì)胞以1×104個(gè)/ml細(xì)胞濃度接種于 96 孔板內(nèi)，每孔 0.1 ml。取不同的濃度SNS314(0,0.01,0.1,1,10 μmol/L)處理T47D細(xì)胞24,48 h ,每孔加入20 μl濃度為 5 g/L的 MTT，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h后棄上清，每孔加入二甲基亞砜 200 μl震蕩 10 min充分溶解顯色，酶標(biāo)儀波長(zhǎng) 570 nm處檢測(cè)吸光度 (A值) ，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(對(duì)照孔A值-加藥孔A值)/對(duì)照孔A值×100%。

1.4 Western blot檢測(cè) Aurora激酶及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

將實(shí)驗(yàn)組(0.001,0.01,0.1,1,10 μmol/L SNS314)和對(duì)照組(0 μmol/L)細(xì)胞的蛋白樣品30 μg分別行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，37 mA恒流1 h將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，含5%牛奶TBST封閉纖維素膜0.5 h，加入一抗4 ℃過(guò)夜，TBST洗滌 3次，然后與二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記)室溫孵育1 h后TBST洗滌3次， ECL顯影，曝光。檢測(cè)Aurora A、Histone H3、p-AuroraA、p-Histone H3、PARP、Bcl-2、Bax?？笰urora A、Histone H3、p-AuroraA、p-Histone H3、PARP、Bcl-2、Bax，抗體稀釋比例為1 ∶1 000，β- actin抗體稀釋比例為1 ∶10 000，二抗稀釋比例1 ∶10 000 。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期改變

分別用對(duì)照組(未處理)、抑制劑組(SNS3140.001,0.01,0.1,1,10μmol/L)處理T47D 24 h后，收集細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×106個(gè)/ml，用冷PBS洗滌細(xì)胞，離心1 000 r/min，5 min兩次，預(yù)冷的95%乙醇固定，離心乙醇固定的細(xì)胞，棄去乙醇，加入PI(50 μg/ml)與RNase(1 μg/ml)混合物500 μl作用 15 min后，在流式細(xì)胞儀上機(jī)分析，檢測(cè)1×104個(gè)細(xì)胞，并用multicycle軟件進(jìn)行細(xì)胞周期的分析。

1.6 免疫熒光觀察核的改變

對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化、計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至103/ml，把預(yù)先處理的無(wú)菌玻片放入12孔板中，將以上細(xì)胞懸液滴入每孔(保證每孔為2 ml)，放入37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)過(guò)夜使其貼壁。給予SNS314 1 μmol/L處理48 h后，將培養(yǎng)液棄去，用預(yù)冷的1×PBS洗3次(5 min/次)，經(jīng)4%多聚甲醛固定、0.2%Triton-X100破膜、DAPI著色5-10 min，1×PBS洗3次后封片，在熒光顯微鏡下觀察，共聚焦顯微鏡下采圖。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

分別用對(duì)照組(未處理)、加藥組SNS314 0.1,1,10 μmol/L分別處理T47D 24 h后，收集細(xì)胞，并調(diào)整的細(xì)胞數(shù)至1×106個(gè)/ml，用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次。加入Binding 緩沖液100 μl、FITC Annexin-Ⅴ 5 μl、PI(50 μg/ml)10 μl，室溫避光孵育15 min后加入Binding 緩沖液400 μl細(xì)胞懸液中加入孵育20-30 min。流式細(xì)胞儀FACScan測(cè)定，經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件處理計(jì)算凋亡細(xì)胞百分率。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SNS314抑制細(xì)胞生長(zhǎng)

MTT法顯示隨著SNS314濃度和作用時(shí)間的增加呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，抑制率曲線呈上升的趨勢(shì),與對(duì)照組(0 μmol/L)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05)，24,48 h的IC50值分別為(2.684±0.429)μmol/L、(0.309±0.510)μmol/L，10 μmol/L SNS314 作用于T47D細(xì)胞24 h抑制率為(65.78±0.01)%,作用48 h后抑制率可達(dá)(83.19±0.01)%(見(jiàn)圖1)。

與對(duì)照組(0 μmol/L)比較，*P<0.05圖1 MTT檢測(cè)不同濃度不同時(shí)間SNS314對(duì)T47D細(xì)胞抑制率曲線 (n=3)Figure 1 Effect of different concentrations of SNS314 on proliferation of T47D cells (n=3)

2.2 SNS314可以導(dǎo)致G2/M期阻滯流式細(xì)胞術(shù)顯示SNS314濃度從0 μmol/L到

10 μmol/L,顯示G0/G1期細(xì)胞由(49.30±0.66)%降至(5.13±0.21)%，S期細(xì)胞由(29.30±0.30)%降至(1.12±0.11)%，G2/M期細(xì)胞由(22.40±0.53)%升高至(93.75±0.06)%(見(jiàn)表1)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組(0 μmol/L)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 SNS314作用于T47D細(xì)胞24 h對(duì)細(xì)胞周期的影響 (%)

Table 1 Effect of SNS314 for 24 h on cell cycle of T47D cells (%)

SNS314的濃度(μmol/L)G0/G1SG2/M0 49．30±0．6629．30±0．3022．40±0．530．00136．00±0．4628．77±0．3134．23±0．670．01 31．50±0．15?20．40±0．82?48．10±0．16?0．1 16．33±0．54?5．63±0．41?79．04±0．75?1 8．63±0．25?4．26±0．31?87．11±0．35?10 5．13±0．21?1．12±0．11?93．75±0．06?

2.3 SNS314對(duì)Aurora A、組蛋白H3磷酸化水平的影響

隨著SNS314濃度的增加，Aurora A和Histone H3總蛋白表達(dá)沒(méi)有明顯變化，而Aurora A、組蛋白H3磷酸化水平的表達(dá)逐漸減弱，CyclinB1的蛋白表達(dá)減少,呈現(xiàn)明顯的遞減趨勢(shì)(見(jiàn)圖2)。

1.對(duì)照組(0 μmol/L);2. 0.001 μmol/L SNS314;3. 0.01 μmol/L SNS314;3. 0.1 μmol/L SNS 314; 4. 1 μmol/L SNS314;5.10 μmol/L SNS314圖2 Western blot檢測(cè)SNS314作用于T47D細(xì)胞24 h后磷酸化Aurora激酶和磷酸化組蛋白以及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的變化Figure 2 The expression of phosphorate Aurora A,phosphorate Histone H3 and apoptosis-related protein after treated with SNS314 for 24 h by Western blot

2.4 SNS314對(duì)T47D細(xì)胞細(xì)胞核的影響

對(duì)照組 SNS314 0 μmol/L作用于T47D細(xì)胞核沒(méi)有改變，當(dāng)1 μmol/LSNS314作用于T47D細(xì)胞可見(jiàn)細(xì)胞核形態(tài)改變，出現(xiàn)核的分葉現(xiàn)象，多核細(xì)胞的產(chǎn)生，最終形成多倍體細(xì)胞，影響胞質(zhì)的正常分裂，細(xì)胞最終走向凋亡(見(jiàn)圖3)。

A.對(duì)照組 B.1 μmol/L SNS314 圖3 SNS314作用于T47D細(xì)胞48 h對(duì)T47D細(xì)胞核的影響Figure 3 Effect of SNS314 on cell nucleus of T47D cells after treatment for 48 h

2.5 SNS314對(duì)凋亡的影響

隨著SNS314濃度的增加，PARP的剪切帶和Bax的表達(dá)水平增加，Bcl-2蛋白的表達(dá)減少(見(jiàn)圖2)。Annexin Ⅴ-FITC與PI雙染顯示SNS314 0，0.1，1，10 μmol/L作用T47D細(xì)胞24 h凋亡率分別為(2.07±0.21)%、(7.83±0.31)%、(10.03±0.31)%、(32.47±2.65)%，隨著藥物濃度的增加，凋亡率增加(見(jiàn)圖4)。

A.對(duì)照組 B.SNS314 0.1 μmol/L C.SNS314 1 μmol/L D.SNS314 10 μmol/L圖4 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染檢測(cè)SNS314對(duì)細(xì)胞凋亡的影響Figure 4 Effect of SNS314 on apoptosis of T47D cells by Annexin Ⅴ-FITC/PI

3 討論

Aurora A、B、C是Aurora激酶家族中的3個(gè)成員，主要在調(diào)節(jié)中心體成熟、有絲分裂紡錘體形成、胞質(zhì)分裂中占有重要的地位。它們?cè)诙喾N腫瘤如乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、卵巢癌、肝癌等中過(guò)表達(dá)[2]，其中在94%浸潤(rùn)性乳腺癌中過(guò)表達(dá)Aurora A,而在正常組織中低表達(dá)，Aurora A可作為乳腺癌獨(dú)立的預(yù)后因素[3]，Aurora A主要在G2/M期達(dá)到高峰，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期中G2/M轉(zhuǎn)換，是調(diào)節(jié)M期進(jìn)展的關(guān)鍵因子[4]。Aurora B調(diào)節(jié)有絲分裂的關(guān)鍵步驟：Aurora B使組蛋白H3磷酸化[5]。Aurora B作為染色體信使復(fù)合物，保證染色體的分離和線性結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞周期進(jìn)展和完成有絲分裂的過(guò)程中扮有重要角色。

過(guò)去十幾年中，藥物領(lǐng)域主要研究Aurora A與人類腫瘤的關(guān)系,如何抑制Aurora A達(dá)到抑制腫瘤的效果，對(duì)于Aurora B的研究甚少，Aurora B受抑制后核內(nèi)發(fā)生復(fù)制，多倍體細(xì)胞聚集，最終導(dǎo)致有絲分裂失敗和細(xì)胞凋亡，研究表明細(xì)胞增殖至關(guān)重要的是Aurora B而不是Aurora A。

Arbitrario等[6]研究表明SNS314是ATP競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合性小分子Aurora激酶抑制劑，可抑制細(xì)胞的增殖，抑制組蛋白H3的磷酸化，細(xì)胞出現(xiàn)多倍體現(xiàn)象，胞質(zhì)分裂失敗。Vander Porten等[7]發(fā)現(xiàn)SNS314在結(jié)腸癌細(xì)胞中有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、阻斷微管形成的作用，從而發(fā)生細(xì)胞周期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究以人乳腺癌T47D細(xì)胞為研究對(duì)象，檢測(cè)SNS314對(duì)T47D細(xì)胞的增殖抑制以及對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，對(duì)其分子機(jī)制進(jìn)行了初步探討。MTT顯示10 μmol/L SNS314作用于T47D細(xì)胞24，48 h抑制率分別為(65.78±0.01)%、(83.19±0.01)%，IC50分別為(2.684±0.429)μmol/L、(0.309±0.510)μmol/L。流式細(xì)胞術(shù)顯示細(xì)胞周期在加藥組出現(xiàn)了明顯的G2/M期阻滯，G0/G1期細(xì)胞由(49.30±0.66)%降至(5.13±0.21)%，S期細(xì)胞由(29.30±0.30)%降至(1.12±0.11)%，G2/M期細(xì)胞由(22.40±0.53)%升高至(93.75±0.06)%，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[8]。

Aurora A轉(zhuǎn)化為磷酸化Aurora A才能發(fā)揮活性，Cyclin B1是細(xì)胞周期中的一種重要的蛋白，使細(xì)胞通過(guò)G2/M期的檢查點(diǎn)，促進(jìn)細(xì)胞G2/M期的轉(zhuǎn)換，它在有絲分裂中后期被降解，促進(jìn)有絲分裂完成，促使細(xì)胞周期的運(yùn)行[9,10]。Cyclin B1為磷酸化Aurora A的下游基因，因而干擾磷酸化的Aurora A形成會(huì)影響到G2/M細(xì)胞周期的運(yùn)行，使細(xì)胞發(fā)生凋亡， Bcl-2/Bax比例是決定細(xì)胞進(jìn)入凋亡與否的關(guān)鍵因素[11]，細(xì)胞發(fā)生凋亡后可以誘導(dǎo)促凋亡蛋白Bax表達(dá)增加，PARP剪切帶表達(dá)增加，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)減少。本研究中Western blot結(jié)果顯示磷酸化Aurora A和磷酸化組蛋白H3的表達(dá)隨著濃度的增加逐漸減少。隨著SNS314藥物濃度的增加伴隨Cyclin B1的蛋白表達(dá)量減少，這說(shuō)明細(xì)胞的增殖抑制可能與下調(diào)Cyclin B1的表達(dá)，不能有效調(diào)節(jié)G2/M期細(xì)胞周期的進(jìn)展，這與文獻(xiàn)[7]報(bào)道一致。T47D細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同濃度SNS314處理后Bcl-2與Bax的表達(dá)呈相反趨勢(shì)即Bax的蛋白表達(dá)量增加，Bcl-2的蛋白表達(dá)量減少，細(xì)胞進(jìn)入凋亡。同時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)Annexin-Ⅴ/PI雙染顯示隨著SNS314濃度的增加，細(xì)胞凋亡率由(2.07±0.21)%增加到(32.47±2.65)%，凋亡細(xì)胞明顯增加。SNS314抑制磷酸化Aurora A的同時(shí)也抑制磷酸化組蛋白H3的表達(dá)，Western blot顯示隨著藥物濃度的增加磷酸化H3的表達(dá)減少，免疫熒光顯示1 μmol/L SNS314作用于乳腺癌T47D細(xì)胞48 h，DNA聚集，多核形成，多倍體細(xì)胞產(chǎn)生，胞質(zhì)分裂失敗，最終細(xì)胞發(fā)生凋亡。

總而言之，本實(shí)驗(yàn)SNS314抑制乳腺癌細(xì)胞T47D細(xì)胞增殖，發(fā)生凋亡主要兩種途徑：一方面抑制磷酸化AuroraA從而下調(diào)Cyclin B1的表達(dá)，另一方面抑制磷酸化組蛋白H3，干擾Aurora B功能，影響細(xì)胞的胞質(zhì)分裂，使細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯，形成多倍體細(xì)胞，干擾細(xì)胞周期的進(jìn)程，Bcl-2的表達(dá)下降，PARP剪切帶與Bax的表達(dá)增加，誘導(dǎo)T47D細(xì)胞發(fā)生凋亡。

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Effects of Aurora kinase inhibitor SNS314 on growth of breast cancer cells

ZHANG Yue,WANG Yaoyi,WU Xueliang,ZHOU Haifeng，LIANG Wanping*
(DepartmentofMammographySurgery,FirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity,Zhangjiakou075000,China;*Correspondingauthor,E-mail：zhangyue906@tom.com)

ObjectiveTo investigate the effects of SNS314,a new Aurora kinase inhibitor,oninvitrogrowth of T47D breast cancer cell lines.MethodsT47D cells were culturedinvitrowith different concentrations of SNS314(0,0.001,0.01,0.1,1,10 μmol/L),respectively,and the cells at logarithmic growth phase were used for this experiment.The effect of SNS314 on cell proliferation was examined by MTT assay.Cell cycle of T47D cells was determined by flow cytometry.The levels of phosphorate-Aurora A(p-Aurora A),total Aurora(T-Aurora),phosphorate-Histone H3,total Histone H3,Cyclin B1 and apoptosis relative protein expression(Bcl-2,Bax,PARP) were detected by Western blot.The variety of nucleus was observed by immunofluorescence.The ratio of apoptotic cells was detected by flow cytometry.ResultsDifferent concentrations of SNS314 significantly inhibited the proliferation of T47D cells after treatment for 24 h or 48 h in a dose-dependent manner,with the IC50of (2.684±0.429) μmol/L and (0.309±0.510) μmol/L.The percentage of G2/M cells was increased from (21.40±0.53)% in 0 μmol/L group to (93.73±0.06)%in 10 μmol/L group.Flow cytometry showed G2/M cells were arrested in a dose-dependent manner.Western blot showed that SNS314 inhibited dose-dependently p-Aurora A,p-Histone H3,Cyclin B1,Bcl-2,while promoted the dissection of PARP and the expression of Bax.SNS314 showed no significant effect on the expression of T-Aurora,T-Histone H3.SNS314 induced multinuclear by immunofluorescence.The ratio of apoptotic cells increased from (2.07±0.21)% in 0 μmol/L group to (32.47±2.65)% in 10 μmol/L group.Compared with 0 μmol/L group,the apoptosis ratio was increased in 10 μmol/L group(P<0.05).ConclusionSNS314 may inhibite the proliferation and induce the apoptosis of T47D cells in a dose-dependent manner.

breast cancer； SNS314； Aurora kinase； cell proliferation； cell apoptosis

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題資助項(xiàng)目(ZD20140243)

張?jiān)?，女?984-10生，碩士,主治醫(yī)師,E-mail:zhangyueyue906@163.com

2017-02-15

R737.9

A

1007-6611(2017)05-0436-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.05.007