杜 軍,王瑞杰,蔡雨晴,張志云(山西大學(xué)生物技術(shù)研究所,化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,太原 030006;通訊作者,E-mail:dujun@sxu.edu.cn)

東亞鉗蝎氯毒素對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖的抑制作用及其機(jī)制

杜 軍*,王瑞杰,蔡雨晴,張志云
(山西大學(xué)生物技術(shù)研究所,化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,太原 030006;*通訊作者,E-mail:dujun@sxu.edu.cn)

目的 研究東亞鉗蝎氯離子通道毒素(BmK CT)對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖的抑制作用及其機(jī)制。 方法 制備融合蛋白GST-BmK CT,體外檢測(cè)GST-BmK CT對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響。以GST-BmK CT處理組為實(shí)驗(yàn)組,以GST處理組為陰性對(duì)照,PBS處理組為空白對(duì)照。MTT法分析各處理組U251細(xì)胞的增殖速度;流式細(xì)胞術(shù)分析U251細(xì)胞周期變化;蛋白免疫印跡法檢測(cè)MAPKAPK-2的蛋白的磷酸化及其上游蛋白p38的磷酸化。預(yù)先使用p38α特異性抑制劑SB203580處理細(xì)胞，檢測(cè)p38α活化對(duì)細(xì)胞周期阻滯的影響。 結(jié)果 MTT結(jié)果表明,融合蛋白GST-BmK CT體外處理U251細(xì)胞48 h和96 h,增殖抑制率分別為(25±1.9)%和(33±2.3)%,與GST處理組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果表明,處理U251細(xì)胞96 h,GST-BmK CT組比空白對(duì)照組S期和G2/M期比例增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.005),GST陰性對(duì)照組相比空白組細(xì)胞周期各時(shí)相差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示GST-BmK CT能激活p38α絲裂原活化蛋白激酶(p38αMAPK),而用p38α特異性抑制劑SB203580能反轉(zhuǎn)GST-BmK引起的細(xì)胞周期阻滯。結(jié)果進(jìn)一步表明,BmK CT通過活化p38α激活下游絲裂原活化蛋白激酶激活的蛋白激酶-2(MAPKAPK-2,MK2)從而引起細(xì)胞S期和G2/M期的阻滯。 結(jié)論 GST-BmK CT是通過p38αMAPK信號(hào)通路激活MK2來引起U251細(xì)胞周期在S期和G2/M期的阻滯,從而抑制細(xì)胞增殖。

蝎氯毒素； 神經(jīng)膠質(zhì)瘤； 細(xì)胞周期阻滯； p38αMAPK信號(hào)通路

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性腦腫瘤,約占所有腦部中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的30%和所有惡性腦腫瘤的80%[1,2]。神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床治療主要以外科手術(shù)切除為主,同時(shí)輔助化學(xué)藥物療法和放射療法。盡管治療的水平不斷提高,然而神經(jīng)膠質(zhì)瘤在腦內(nèi)呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)、其增殖復(fù)發(fā)能力較強(qiáng)等特點(diǎn)仍是臨床治療的難點(diǎn),膠質(zhì)瘤患者的中位總生存期在過去幾十年并沒有明顯的延長(zhǎng),仍然保持在1年左右[3，4]。因此,迫切需要改善膠質(zhì)瘤治療的方法和手段。

蝎氯毒素全稱為蝎氯離子通道神經(jīng)毒素,由36個(gè)氨基酸組成,最早從以色列金蝎(Leiurus quinquestriatus)尾腺的毒液中提取純化得到。蝎氯毒素能特異地阻斷大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞的小電導(dǎo)氯離子通道而得名[5，6]。東亞鉗蝎氯毒素(BmK CT)是從廣泛分布于我國(guó)的東亞鉗蝎(Buthus martensii Karshch，BmK)中發(fā)現(xiàn)并分離的一種類氯毒素基因[7，8]編碼的多肽,與以色列蝎氯毒素有相似的功能[9，10]。蝎氯毒素可以特異地結(jié)合在膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)并下調(diào)其活性從而抑制細(xì)胞的遷移能力[11]。我們前期研究證實(shí)BmK CT除了能抑制惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移,同時(shí)能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖[12，13]。也有相關(guān)研究報(bào)道證實(shí)東亞鉗蝎的氯毒素在大鼠膠質(zhì)瘤模型中可以特異地結(jié)合腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞并且抑制腫瘤的增殖、侵襲和遷移[14]。目前已證實(shí)蝎氯毒素抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和遷移主要是通過抑制MMP-2蛋白的活性,但BmK CT抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制尚不明確。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)東亞鉗蝎氯毒素融合蛋白GST-BmK CT抗膠質(zhì)瘤作用進(jìn)行深入分析,探究BmK CT抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞株及主要試劑

質(zhì)粒pGEX-6p-1-BmK CT的構(gòu)建及融合蛋白GST-BmK CT的表達(dá)、純化由梁愛華課題組完成,同時(shí)表達(dá)、純化GST蛋白做對(duì)照。U251細(xì)胞株由山西省人民醫(yī)院胡濤博士饋贈(zèng);胎牛血清(德國(guó)PAN Biotech公司);細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM(美國(guó)Gibco公司);TE(0.25% trypsin and 0.02% EDTA solution,美國(guó)Gibco公司);3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)(美國(guó)Thermo公司);三聯(lián)溶液(10% SDS,5% Isobutyl alcohol,0.01 mol/L HCl);propidium iodine(PI)和RNase A(美國(guó)Sigma公司);BCA蛋白定量試劑(美國(guó)Thermo公司);SB203580 和細(xì)胞裂解液(RIPA),購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司;苯甲基磺酰氟(PMSF)(北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)有限公司);蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑(瑞士羅氏公司);GAPDH抗體(天津三箭生物公司);P-p38、p38、P-MAPKAPK-2抗體(美國(guó)cell signaling technology公司);辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔、山羊抗鼠二抗(美國(guó)Sigma公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

人源的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基DMEM中,細(xì)胞培養(yǎng)維持在37 ℃、5% CO2的環(huán)境中。細(xì)胞消化使用含有0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶。

為了檢測(cè)GST-BmK CT對(duì)U251細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響,首先將U251細(xì)胞計(jì)數(shù),按相同細(xì)胞數(shù)分為三組：一組以1.12 μmol/L GST-BmK CT處理為實(shí)驗(yàn)組,一組以1.12 μmol/L GST處理為陰性對(duì)照組,一組以PBS處理組為空白對(duì)照。MTT分析各處理組細(xì)胞增殖速度,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化。

為了檢測(cè)GST-BmK CT處理U251細(xì)胞后相關(guān)信號(hào)通路的變化,分別用1.12 μmol/L融合蛋白GST-BmK CT和1.12 μmol/L標(biāo)簽蛋白GST處理U251細(xì)胞不同時(shí)間,蛋白免疫印跡檢測(cè)隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),信號(hào)通路蛋白表達(dá)及磷酸化情況。為了檢測(cè)p38α活化對(duì)細(xì)胞周期阻滯的影響，預(yù)先用p38α特異性抑制劑SB203580(終濃度為4 μg/ml)處理1 h，移除培養(yǎng)基，PBS漂洗一次，加入1.12 μmol/L GST-BmK CT。PBS處理和GST-BmK CT單獨(dú)處理為對(duì)照組，SB203580單獨(dú)處理和SB203580+GST-BmK聯(lián)合處理為實(shí)驗(yàn)組。

1.3 細(xì)胞增殖分析

用MTT法做細(xì)胞的增殖分析。將U251細(xì)胞以1 000個(gè)/孔的密度接種96孔板,待細(xì)胞貼壁分別加GST-BmK CT(1.12 μmol/L)和GST(1.12 μmol/L)蛋白,設(shè)PBS為空白對(duì)照組,每組6個(gè)復(fù)孔,在刺激48 h、96 h每孔加5 mg/ml MTT 10 μl,培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h。隨后每孔加入100 μl的三聯(lián)溶液,繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育溶解過夜,確保甲瓚完全溶解。在酶標(biāo)儀上檢測(cè)570 nm處的吸光值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞周期分析

U251細(xì)胞以5×104個(gè)/孔的密度接種于12孔板,過夜貼壁,分別加GST-BmK CT(1.12 μmol/L)和GST(1.12 μmol/L)蛋白,設(shè)PBS為空白對(duì)照組,每組3個(gè)復(fù)孔。刺激96 h用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞。收集的細(xì)胞用PBS洗1次,用70%的乙醇固定1 h。細(xì)胞懸液加適量的PBS,4 000 r/min離心收集細(xì)胞,再用PBS漂洗1次,100 μl PBS重懸細(xì)胞,其中包含5 μg/ml PI和100 μg/ml RNase A,室溫避光染色30 min。收集細(xì)胞用Becton Dickinson FACScan(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)流式檢測(cè)DNA含量。通過PI熒光計(jì)算出DNA含量,并根據(jù)細(xì)胞周期各時(shí)相的DNA含量計(jì)算各細(xì)胞周期的百分率。

1.5 蛋白免疫印跡分析

U251細(xì)胞以適當(dāng)密度接種于6孔板,待細(xì)胞生長(zhǎng)至底面的70%-80%時(shí),實(shí)驗(yàn)組加入GST-BmK CT(1.12 μmol/L)或GST(1.12 μmol/L)蛋白,刺激的時(shí)間梯度為1，2，4，8，16 h;空白對(duì)照組培養(yǎng)基加等量PBS。收取不同刺激時(shí)相的U251細(xì)胞,用PBS漂洗1次,加適量細(xì)胞裂解液(含有PMSF和蛋白酶及磷酸酶抑制劑),冰上裂解細(xì)胞30 min,離心30 min(15 000 r/min、4 ℃),吸取上清,用BCA法測(cè)蛋白濃度。SDS-PAGE膠每孔上20 μg總蛋白樣做電泳,冰浴轉(zhuǎn)膜,含5%的牛血清白蛋白(BSA)的TBST封閉1 h,一抗4 ℃孵育過夜,TBST漂洗3次、每次10 min,加入對(duì)應(yīng)的二抗室溫孵育1 h,TBST漂洗3次、每次10 min,用ECL顯色液顯色,分子成像系統(tǒng)掃描儀記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 融合蛋白GST-BmK CT抑制U251細(xì)胞存活的能力

MTT結(jié)果顯示,GST-BmK CT處理U251細(xì)胞48 h、96 h,對(duì)細(xì)胞增殖有明顯的抑制效果(見圖1),以PBS處理組為參照分析,GST-BmK CT處理組的的抑制率在48 h為(25±1.9)%,在96 h為(33±2.3)%,與GST處理組相比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

與GST組比較，*P<0.001圖1 MTT法分析GST-BmK CT和GST刺激U251細(xì)胞48 h,96 h細(xì)胞增殖Figure 1 Cell proliferation of U251 cells after treatment with GST-BmK CT and GST for 48 h and 96 h by MTT assay

2.2 融合蛋白GST-BmK CT誘導(dǎo)U251細(xì)胞周期發(fā)生S期和G2/M期的阻滯

GST-BmK CT作用U251細(xì)胞96 h,相比于PBS對(duì)照組和GST處理組,細(xì)胞周期中處于S期和G2/M期時(shí)相的比例明顯增加(見圖2),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.005)。與PBS對(duì)照組比較,GST處理前后細(xì)胞周期各時(shí)相均沒有明顯的變化(P>0.05)。GST-BmK CT處理前后細(xì)胞周期各時(shí)相發(fā)生了明顯的變化,G0/G1期的比例為(42±1.5)%,相較于空白對(duì)照組的(77±0.6)%,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001);S期的比例為(45±1.9)%,相較于空白對(duì)照組的(18±1.2)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);G2/M期的比例為(13±1.7)%,相較于空白對(duì)照組的(6±1.6)%明顯增加(P<0.05)。以上結(jié)果表明,GST-BmK CT具有誘導(dǎo)U251細(xì)胞S期和G2/M期阻滯的作用。

與空白對(duì)照比較，*P<0.005,**P<0.001圖2 GST-BmK CT、GST及PBS不同處理U251對(duì)周期阻滯的影響Figure 2 Effect of different treatment on cell cycle arrest of U251 cells

2.3 融合蛋白GST-BmK CT能特異性激活p38α信號(hào)通路

為了進(jìn)一步尋找GST-BmK CT誘導(dǎo)U251細(xì)胞S期和G2/M期阻滯的分子機(jī)制,利用蛋白免疫印跡分析檢測(cè)了與細(xì)胞周期相關(guān)的應(yīng)急激活蛋白的變化情況。GST-BmK CT能激活p38αMAPK信號(hào)途徑,隨著GST-BmK CT刺激時(shí)間的延長(zhǎng),p38α的磷酸化水平逐漸升高(見圖3A),而GST并不能激活p38αMAPK(見圖3B)。表明了BmK CT可以活化p38αMAPK蛋白。

2.4 SB203580能解除GST-BmK CT誘導(dǎo)的U251細(xì)胞周期在S期和G2/M期的阻滯

SB203580預(yù)處理前后細(xì)胞周期各時(shí)相的差異并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見圖 4),表明抑制劑本身不會(huì)影響細(xì)胞周期變化。圖4C結(jié)果顯示,GST-BmK CT單獨(dú)刺激U251細(xì)胞與SB203580預(yù)處理再做同樣的刺激相比,各細(xì)胞周期時(shí)相的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。以上結(jié)果表明，GST-BmK CT激活的p38α信號(hào)途徑和其誘導(dǎo)的U251細(xì)胞S期和G2/M期阻滯密切相關(guān)。

2.5 融合蛋白GST-BmK CT通過激活MK2誘導(dǎo)U251 S期和G2/M期的阻滯

GST-BmK CT能選擇性的激活p38α,同時(shí) SB203580預(yù)處理并不影響p38α激活(見圖5A)。圖5B顯示,GST-BmK CT單獨(dú)刺激U251細(xì)胞,能選擇性的激活MAPKAPK-2;當(dāng)用SB203580預(yù)處理U251細(xì)胞,GST-BmK CT激活MAPKAPK-2的能力明顯減弱。以上結(jié)果進(jìn)一步證明了GST-BmK CT特異性激活p38αMAPK信號(hào)途徑,活化的 MAPKAPK-2是導(dǎo)致U251細(xì)胞S期和G2/M期阻滯的直接因素。

B.GST刺激U251細(xì)胞不同時(shí)間p38總蛋白及磷酸化水平的表達(dá)圖3 蛋白免疫印跡檢測(cè)p38總蛋白及磷酸化水平Figure 3 The total protein levels and phosphorylation status of p38 by Western blot after treated with GST or GST-BmK CT for different time

圖4 流式細(xì)胞術(shù)分析GST-BmK CT或SB203580單獨(dú)及聯(lián)合處理U251細(xì)胞后細(xì)胞周期變化(*P<0.005,**P<0.001)Figure 4 Cell cycle arrest of U251 cells after treatment with GST-BmK CT,SB203580,or their combination(*P<0.005,**P<0.001)

B.不同處理后MAPKAPK-2的磷酸化水平圖5 蛋白免疫印跡檢測(cè)p38蛋白磷酸化及其下游蛋白MAPKAPK-2的磷酸化Figure 5 The phophorylation level of p38 (A) and MAPKAPK-2 (B) after treated with GST-BmK CT,SB203580,or their combination by Western blot

3 討論

惡性膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤,具有極高的死亡率[15，16]。根據(jù)WHO統(tǒng)計(jì),在世界的不同地區(qū),源于神經(jīng)系統(tǒng)的顱內(nèi)腫瘤的發(fā)病率約為219/100 000人,這些患者中的50%是具有高死亡率的惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤。美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)的統(tǒng)計(jì)顯示大約77%的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者在1年內(nèi)死亡。

我們實(shí)驗(yàn)室前期的數(shù)據(jù)表明BmK CT能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和遷移[12，13]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)BmK CT能引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期阻滯在S期和G2/M期從而抑制細(xì)胞增殖。因此，GST-BmK CT是通過何種信號(hào)途徑誘導(dǎo)U251細(xì)胞S期和G2/M期周期阻滯是我們希望闡明的重要之處。

p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族重要的成員,響應(yīng)于很多應(yīng)激刺激[17，18],例如細(xì)胞因子、紫外線照射、熱休克等,并且參與細(xì)胞分化、凋亡和自噬。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了4種亞型的p38MAPK,分別是p38α、β、γ以及δ。有研究報(bào)道p38α參與調(diào)節(jié)DNA損傷的細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn),在DNA甲基化試劑誘導(dǎo)的DNA損傷模型中,p38α通過使細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)蛋白Cdc25C失活來激活G2檢驗(yàn)點(diǎn),導(dǎo)致G2阻滯[19];在紫外輻射誘導(dǎo)的DNA損傷模型中,p38α參與S期的阻滯和G2/M期的轉(zhuǎn)變[20，21]。

已有證據(jù)表明,絲裂原活化蛋白激酶激活的蛋白激酶-2(MAPKAPK-2)是一個(gè)重要的DNA損傷檢驗(yàn)點(diǎn)激酶家族成員[20]。該激酶和Chk1、Chk2一樣,也是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的成員。這種激酶通過被p38 MAP激酶的直接磷酸化來調(diào)節(jié),與p38 MAP激酶一起發(fā)揮作用[22,23]。MAPKAPK-2調(diào)節(jié)DNA損傷的主要分子機(jī)制是通過控制Cdc25家族的磷酸化依賴性失活,Cdc25家族是Cyclin/Cdk復(fù)合物的主要調(diào)節(jié)者。Cdc25家族主要包括3個(gè)異構(gòu)體:Cdc25A、Cdc25B和Cdc25C。MAPKAPK-2調(diào)控細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)是通過磷酸化Cdc25A、Cdc25B和Cdc25C,從而創(chuàng)造了一個(gè)和磷酸絲氨酸結(jié)合蛋白家族(14-3-3蛋白)的結(jié)合位點(diǎn)。14-3-3蛋白通過阻止Cdc25滯留在胞質(zhì),從而阻斷了與核內(nèi)的CycB-cdk1的相互作用,導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯。在紫外線誘導(dǎo)DNA損傷模型中,其磷酸化Cdc25A能導(dǎo)致S期的阻滯,磷酸化Cdc25B/C能導(dǎo)致G2/M期的阻滯[20]。

本研究結(jié)果顯示,融合蛋白GST-BmK CT能特異地抑制U251細(xì)胞的增殖。GST-BmK CT刺激U251細(xì)胞96 h,細(xì)胞周期各時(shí)相發(fā)生了明顯的改變,U251細(xì)胞周期在S期和G2/M期發(fā)生阻滯。研究結(jié)果表明，GST-BmK CT能選擇性的激活p38α,當(dāng)用p38MAPK信號(hào)途徑特異性的抑制劑SB205380預(yù)處理U251細(xì)胞再用GST-BmK CT做刺激發(fā)現(xiàn),細(xì)胞周期各時(shí)相變化不明顯,與空白對(duì)照組相比,U251細(xì)胞周期在S期和G2/M期幾乎沒有阻滯,表明p38α在GST-BmK CT誘導(dǎo)的U251細(xì)胞周期阻滯中起重要作用。MAPKAPK-2是p38αMAPK下游的一個(gè)直接激活靶標(biāo),更是一個(gè)DNA損傷細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)激酶。本研究首次觀察到GST-BmK CT刺激U251細(xì)胞,MAPKAPK-2被激活從而引起細(xì)胞周期阻滯;當(dāng)用SB205380預(yù)處理U251細(xì)胞,GST-BmK CT引起的MAPKAPK-2的激活明顯減弱,更進(jìn)一步證明了GST-BmK CT激活p38αMAPK信號(hào)途徑的選擇性。此研究揭示了GST-BmK CT引起U251細(xì)胞周期S期和G2/M期阻滯的分子機(jī)制,為進(jìn)一步探討B(tài)mK CT作為治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的新途徑和方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Inhibitive effect ofBmK CT on proliferation of glioma U251 cells and its mechanism

DU Jun*,WANG Ruijie,CAI Yuqing,ZHANG Zhiyun
(KeyLaboratoryofChemicalBiologyandMolecularEngineering,MinistryofEducation,InstituteofBiotechnology,ShanxiUniversity,Taiyuan030006,China;*Correspondingauthor,E-mail:dujun@sxu.edu.cn)

ObjectiveTo explore the inhibitive effect ofBmK CT on proliferation of glioma U251 cells and its possible mechanism.MethodsU251 cells were treated with GST-BmK CTinvitroto evaluate the effects on proliferation and cell cycle.U251 cells were treated with GST-BmK CT(experiment group),GST(GST group) and PBS(PBS group),respectively.MTT was used to analyze the proliferation of U251 cells,and flow cytometry was used to analyze the cell cycle of U251 cells.Western blot was used to detect the expression of related proteins. Effect of pretreatment with SB203580 on cell cycle was determined.ResultsMTT results showed that the inhibition rates were (25±1.9)% and (33±2.3)% in U251 cells after treated with GST-BmK CTinvitrofor 48 h and 96 h,which were significantly different from those of GST group(P<0.001).Flow cytometry analysis found that the cells in S phase and G2/M phase were increased in GST-BmK CT group after treatment for 96 h compared with PBS group(P<0.005),but there was no significant difference between GST group and PBS group during the cell cycle phase(P>0.05).Western blot showed that GST-BmK CT activated p38α-mitogen-activated protein kinase(p38αMAPK),and p38α inhibitor SB203580 significantly reversed cell cycle arrest triggered by GST-BmK CT. MAPKAPK-2 was phosphorylated to induce S and G2/M phase arrest.ConclusionGST-BmK CT may cause U251 cell cycle arrest in the S phase and G2/M phase by activating MK2 through the p38αMAPK signal pathway to inhibit the proliferation of U251 cells.

Karsch Chlorotoxin； glioma； cell cycle arrest； p38αMAPK signal pathway

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31400765);山西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(201601D202064);高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新基金資助項(xiàng)目(2015117)

杜軍,男,1985-11生,博士,講師,E-mail:dujun@sxu.edu.cn

2017-02-17

R730.264

A

1007-6611(2017)05-0420-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.05.004