鐘曉，王嶺，徐翔，楊陳麗，孫麗

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，山東青島266011)

大動(dòng)脈粥樣硬化型腦梗死患者TLR4基因多態(tài)性觀察

鐘曉，王嶺，徐翔，楊陳麗，孫麗

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，山東青島266011)

目的 觀察中國膠東半島地區(qū)大動(dòng)脈粥樣硬化(LAA)型腦梗死漢族患者TLR4基因的rs1927911、rs1927914、rs2149356位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性情況。方法 將LAA型腦梗死患者105例納入病例組，選擇同期健康體檢者125例納入對(duì)照組。采用PCR-RFLP法或直接測序法觀察兩組白細(xì)胞TLR4基因rs1927911、rs1927914、rs2149356位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性情況。結(jié)果 兩組各多態(tài)性位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P>0.05)。病例組TLR4基因rs1927911位點(diǎn)CC、TT基因型頻率低于對(duì)照組，CT基因型頻率高于對(duì)照組(P均<0.05)。病例組rs2149356位點(diǎn)CC、AC基因型頻率低于對(duì)照組，AA基因型頻率高于對(duì)照組，A等位基因頻率高于對(duì)照組(P均<0.05)。結(jié)論 中國膠東半島地區(qū)LAA型腦梗死漢族患者白細(xì)胞TLR4基因rs1927911、rs2149356位點(diǎn)多態(tài)性可能與LAA型腦梗死的發(fā)病有關(guān)。

Toll樣受體4基因；腦梗死；動(dòng)脈粥樣硬化；大動(dòng)脈粥樣硬化型腦梗死；基因多態(tài)性

高脂血癥、高血壓、糖尿病、吸煙、飲酒等是缺血性腦梗死主要的危險(xiǎn)因素，然而有不少腦梗死患者并不存在上述常見危險(xiǎn)因素。研究發(fā)現(xiàn)具有不同病因的缺血性腦梗死的遺傳學(xué)背景不同[1～3]，認(rèn)為缺血性腦梗死是由多因素共同作用的多基因遺傳病[4]。其中，大動(dòng)脈粥樣硬化(LAA)型腦梗死受遺傳因素影響可能更明顯。研究[5]證實(shí)，炎癥引起的免疫反應(yīng)貫穿于動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的始終。Toll樣受體(TLRs)是一種模式識(shí)別受體，其中TLR4在AS的多個(gè)病理階段都發(fā)揮重要作用。有學(xué)者[6]研究證實(shí)，TLR4在正常血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)甚少，而在AS患者的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)顯著增高。研究[7，8]發(fā)現(xiàn)TLR4基因中的3個(gè)位點(diǎn)(rs1927911、rs1927914、rs2149356)單核苷酸多態(tài)性與心血管疾病、血脂水平、AS等有關(guān)。但在漢族人群中，有關(guān)缺血性腦梗死受遺傳因素影響的報(bào)道較少。因此，我們觀察了中國膠東半島地區(qū)LAA型腦梗死漢族患者TLR4基因的rs1927911、rs1927914、rs2149356位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性情況，探討TLR基因多態(tài)性與LAA型腦梗死的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2015年6月～2016年6月在青島大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科就診的LAA型腦梗死患者(病例組)和同期健康體檢者(對(duì)照組)。所有研究對(duì)象均為長期生活在中國膠東半島地區(qū)的漢族人，且年齡、性別相匹配，具有可比性。病例組105例均符合第四屆全國腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議制定的LAA型腦梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)；排除外傷、動(dòng)脈炎、心源性栓塞、藥物、血液病、動(dòng)脈瘤、腦血管畸形或腫瘤等其他原因所引起的腦梗死者，伴有嚴(yán)重心臟疾病及近期發(fā)生急性心肌梗死、心絞痛者，近期服用抗血小板和抗凝藥物者，嚴(yán)重肝腎疾病、自身免疫性疾病、心功能衰竭、慢性肺部疾病、嚴(yán)重感染性疾病、腫瘤、梗死后出血患者，近期手術(shù)患者，合并妊娠者。對(duì)照組128例均經(jīng)腦血管檢查證實(shí)無血管狹窄及AS，且經(jīng)MRA、CTA、DSA等檢查證實(shí)無中、重度顱內(nèi)外大動(dòng)脈狹窄表現(xiàn)。所有受試者在禁食12 h后，于入院的第2天清晨抽取前臂靜脈血，用于生化指標(biāo)的檢測及白細(xì)胞DNA的提取。兩組年齡、性別、吸煙、飲酒、冠心病發(fā)生情況、TG、TC差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；病例組合并高血壓比例、合并糖尿病比例、LDL水平高于對(duì)照組，HDL水平低于對(duì)照組(P均<0.05)。見表1、2。

表1 兩組性別、飲酒、吸煙情況及合并疾病情況比較(例)

表2 兩組年齡及血脂指標(biāo)比較

1.2 白細(xì)胞TLR4基因rs1927911、rs1927914、rs2149356多態(tài)性觀察

1.2.1 白細(xì)胞DNA提取 抽取前臂靜脈血5 mL置于EDTA抗凝管中，固定2 h，常溫下3 000 r/min離心10 min，收集白細(xì)胞層置于eppendof管中，放在-80 ℃冰箱中備用。將白細(xì)胞標(biāo)本從冰箱取出后完全熔化，提取白細(xì)胞DNA。

1.2.2 rs1927911、rs1927914、rs2149356位點(diǎn)基因序列擴(kuò)增 用梯度PCR儀分別擴(kuò)增TLR4基因的rs1927911、rs1927914、rs2149356位點(diǎn)的目的基因片段。引物經(jīng)Premier軟件設(shè)計(jì)，由上海生物工程有限公司合成。rs1927911位點(diǎn)上游引物序列為5′-AACCTGCATGCTCTGCACATG-3′，下游引物序列為5′-ACCATGGGAATCCATGCAC-3′，產(chǎn)物長度247 bp，限制性內(nèi)切酶為StyI；rs1927914位點(diǎn)上游引物序列為5′-CGCATGTGTTTTGAATTACTGAATT-3′，下游引物序列為5′-AATAATCTCAATACTCAGAGCAAAGCTTT-3′，產(chǎn)物長度454 bp，限制性內(nèi)切酶為SphI；rs2149356位點(diǎn)上游引物序列為5′-CAGATGTGATGGGTCATATGATTGT-3′，下游引物序列為5′-CAAAACTCGCTCCTATCACCTGTT-3′，產(chǎn)物長度500 bp，直接測序。rs1927911、rs1927914、rs2149356位點(diǎn)的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件均相同?？偡磻?yīng)體系20 μL，包括雙蒸水8 μL，2×Taq PCR Master Mix(不含染料)10 μL，模板DNA 1 μL，上游、下游引物各0.5 μL。PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性94 ℃ 30 s，變性94 ℃ 15 s，退火58 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，用瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增結(jié)果。擴(kuò)增產(chǎn)物放在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 rs1927911、rs1927914、rs2149356位點(diǎn)基因型鑒定 rs1927911位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)StyI酶在37 ℃下酶切約60 min，rs1927914位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)SphI酶在37 ℃下酶切約90 min；rs1927911、rs1927914位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)體系相同，總體積10 μL(雙蒸水3.6 μL，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，10×buffer 1 μL，限制性內(nèi)切酶0.4 μL)，酶切反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果，見圖1、2。rs2149356沒有天然內(nèi)切酶，因此采用直接測序法鑒定基因型，見圖3。

注：a、b、c代表基因型分別為CT、TT、CC。

注：a、b、c代表基因型分別為CT、CC、TT。

注：a、b、c代表基因型分別為CC、AC、AA。

2 結(jié)果

兩組各核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P>0.05)，本研究選擇的樣本具有群體代表性。病例組TLR4基因rs1927911位點(diǎn)CC、TT基因型頻率低于對(duì)照組，CT基因型頻率高于對(duì)照組(P均<0.05)。病例組rs2149356位點(diǎn)CC、AC基因型頻率低于對(duì)照組，AA基因型頻率高于對(duì)照組，A等位基因頻率高于對(duì)照組(P均<0.05)。兩組rs1927914位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。詳見表3～5。

表3 兩組rs1927911位點(diǎn)基因型與等位基因頻率比較(%)

表4 兩組rs1927914位點(diǎn)基因型與等位基因頻率比較(%)

表5 兩組rs2149356位點(diǎn)基因型與等位基因頻率比較(%)

3 討論

炎癥在AS的發(fā)生和發(fā)展中都起到重要作用。TLR4主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，尤其在脂質(zhì)豐富的血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中表達(dá)水平顯著提高。血管壁中巨噬細(xì)胞分化為泡沫細(xì)胞是AS形成的早期標(biāo)志，TLR4在泡沫細(xì)胞的形成中發(fā)揮重要作用。巨噬細(xì)胞中激活的TLR4能引起一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)炎癥因子、蛋白酶表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)AS形成。有學(xué)者[9～11]發(fā)現(xiàn)，MyD88/ApoE都被敲除的小鼠相比只有ApoE被敲除的小鼠發(fā)生AS的概率小，病變處的脂質(zhì)和巨噬細(xì)胞明顯減少，內(nèi)膜損傷程度也較輕。髓樣分化因子88是TLR4細(xì)胞內(nèi)部分的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵的銜接蛋白，能夠啟動(dòng)下游炎癥因子轉(zhuǎn)導(dǎo)[12，13]。研究[14]發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌多糖刺激套囊誘導(dǎo)新內(nèi)膜形成和結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈血流中斷的小鼠模型中，TLR4缺陷小鼠均無新內(nèi)膜形成和向外的血管重塑，而野生型小鼠出現(xiàn)新內(nèi)膜形成和血管向外重塑，且其程度與TLR4基因表達(dá)水平相關(guān)，這表明TLR4參與血管重塑并引起血管腔進(jìn)一步狹窄[15]。Castrillo等[16]進(jìn)一步證實(shí)TLR4可抑制巨噬細(xì)胞中膽固醇外流，促進(jìn)斑塊的發(fā)生。因此，TLR4基因高表達(dá)可影響AS的形成、血管重塑及斑塊的穩(wěn)定性等，從而促進(jìn)動(dòng)脈血管狹窄、閉塞，是LAA型腦梗死發(fā)生的重要原因。

本研究觀察了長期生活在中國膠東半島地區(qū)漢族LAA型腦梗死患者白細(xì)胞TLR4基因rs1927911、rs1927914及rs2149356位點(diǎn)的多態(tài)性，結(jié)果顯示，病例組TLR4基因rs1927911位點(diǎn)CC、TT基因型頻率低于對(duì)照組，CT基因型頻率高于對(duì)照組。病例組rs2149356位點(diǎn)CC、AC基因型頻率低于對(duì)照組，AA基因型頻率高于對(duì)照組，A等位基因頻率高于對(duì)照組。Enquobahrie等[17]對(duì)華盛頓人群進(jìn)行病例對(duì)照研究未曾發(fā)現(xiàn)TLR4基因中rs1927911位點(diǎn)多態(tài)性與缺血性腦梗死有關(guān)，但發(fā)現(xiàn)rs1927911位點(diǎn)多態(tài)性可降低心肌梗死的危險(xiǎn)性。眾所周知，TC/HDL比值水平可影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展，進(jìn)而增加LAA型腦梗死的患病風(fēng)險(xiǎn)。有學(xué)者[8]在研究TLR4基因多態(tài)性與2型糖尿病患者TC/HDL-C比值的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，rs2149356位點(diǎn)雜合子較純合子可能更易于提高TC/HDL-C的比值，這與我們的研究結(jié)果基本相一致，因此我們認(rèn)為rs2149356位點(diǎn)多態(tài)性可能影響AS的發(fā)生和發(fā)展。

另外，本研究未發(fā)現(xiàn)rs1927914位點(diǎn)多態(tài)性與LAA型腦梗死有相關(guān)性。研究[17]發(fā)現(xiàn)rs1927914位點(diǎn)多態(tài)性可降低心肌梗死的危險(xiǎn)性，未發(fā)現(xiàn)rs1927914位點(diǎn)多態(tài)性與缺血性腦梗死有關(guān)。這與我們的研究結(jié)果基本基本一致，具體有待于進(jìn)一步研究探索。

綜上所述，中國膠東半島地區(qū)LAA型腦梗死漢族患者白細(xì)胞TLR4基因rs1927911、rs2149356位點(diǎn)多態(tài)性可能與LAA型腦梗死的發(fā)病有關(guān)。

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孫麗(E-mail: 875826289@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.15.022

R743.3

B

1002-266X(2017)15-0074-04

2016-12-26)