蔡夢(mèng)月，郝美玲，李春輝

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德067000)

·臨床研究·

胃癌組織中ADD1、Ptch1、Gli1表達(dá)觀察

蔡夢(mèng)月，郝美玲，李春輝

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德067000)

目的 觀察胃癌組織中細(xì)胞膜骨架蛋白α-Adducin(ADD1)及Hedgehog(Hh)信號(hào)通路分子跨膜蛋白Patched1(Ptch1)、轉(zhuǎn)錄因子Gli1的表達(dá)變化，并分析其相關(guān)性。方法 行手術(shù)治療的胃癌患者60例，術(shù)中留取胃癌組織和癌旁正常胃組織各60例。采用Western blotting法檢測(cè)胃癌組織及正常胃組織中的ADD1、Ptch1、Gli1蛋白，采用real-time PCR法檢測(cè)ADD1、Ptch1、Gli1 mRNA。分析ADD1、Ptch1、Gli1蛋白及mRNA表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，分析胃癌組織中ADD1、Ptch1、Gli1蛋白及mRNA表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果 胃癌組織中ADD1、Ptch1、Gli1蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于正常胃組織(P均<0.05)。低分化、Ⅲ～Ⅳ期、有漿膜浸潤(rùn)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中ADD1、Ptch1、Gli1蛋白及mRNA表達(dá)分別高于高分化、Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)漿膜浸潤(rùn)、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織(P均<0.05)。胃癌組織中ADD1蛋白與Ptch1蛋白、Gli1蛋白表達(dá)均呈正相關(guān)關(guān)系(r分別為0.759、0.681，P均<0.01)，ADD1 mRNA與Ptch1 mRNA、Gli1 mRNA表達(dá)也呈正相關(guān)關(guān)系(r分別為0.811、0.719，P均<0.01)。結(jié)論 胃癌組織中ADD1、Ptch1、Gli1蛋白及mRNA呈高表達(dá)，ADD1、Ptch1、Gli1可能共同參與胃癌的發(fā)生發(fā)展，且ADD1與Hh信號(hào)通路之間可能存在一定相互作用關(guān)系。

胃癌；細(xì)胞膜骨架蛋白；α-Adducin；Hedgehog信號(hào)通路；Patched1蛋白；Gli1蛋白

研究[1～4]表明胃癌的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移與Hedgehog(Hh)信號(hào)通路的激活有著密切關(guān)系。Hh信號(hào)通路抑制劑已被研發(fā)并在臨床試驗(yàn)中取得一定效果，但由于腫瘤有著極其復(fù)雜的微環(huán)境[5，6]，加之多藥耐藥性的產(chǎn)生使得Hh信號(hào)通路抑制劑療效并不十分理想[7～11]，有必要尋找更為合適的靶點(diǎn)。細(xì)胞膜骨架蛋白α-Adducin(ADD1)參與構(gòu)建細(xì)胞膜骨架網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)，有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的功能，這提示ADD1很可能與Hh信號(hào)通路有著密切的關(guān)系。本研究觀察了胃癌組織中ADD1及Hh信號(hào)通路分子Patched1(Ptch1)、Gli1的表達(dá)變化，并分析其相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2014年9月～2015年9月在承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院手術(shù)治療的胃癌患者60例，男37例、女23例，>50歲34例、≤50歲26例，腫瘤高中分化24例、低分化有36例，TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期28例、Ⅲ～Ⅳ期32例，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32例、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例，伴有漿膜浸潤(rùn)40例、無(wú)漿膜浸潤(rùn)20例。留取術(shù)中切除的胃癌組織60例及其癌旁正常胃組織60例。

1.2 胃癌組織與正常胃組織中ADD1、Ptch1、Gli1蛋白檢測(cè) 提取組織總蛋白，檢測(cè)蛋白濃度后加入緩沖液煮沸使蛋白變形；配置SDS-PAGE膠(12%分離膠+5%濃縮膠)進(jìn)行電泳，蛋白跑至濃縮膠底部時(shí)停止電泳進(jìn)行轉(zhuǎn)膜；將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜后用5%封閉液封閉2 h，分別加入一抗ADD1、Ptch1、Gli1孵育，放入4 ℃冰箱過(guò)夜后取出，洗膜3次，加入二抗常溫下孵育1 h，洗膜3次，顯影；用Quantity One462圖像分析軟件分析蛋白條帶，以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 胃癌組織與正常胃組織中ADD1、Ptch1、Gli1 mRNA檢測(cè) 采用real-time PCR法。提取組織總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；按照real-time PCR試劑盒體系加入ADD1、Ptch1、Gli1引物(引物序列見(jiàn)表1)，置于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增；得出ADD1、Ptch1、Gli1mRNA溶解曲線(xiàn)和擴(kuò)增曲線(xiàn)及Ct值，以2-ΔΔCt表示目的基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 ADD1、Ptch1、Gli1、GAPDH基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織與正常胃組織中ADD1、Ptch1、Gli1蛋白及mRNA表達(dá)比較 胃癌組織中ADD1、Ptch1、Gli1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.59±0.01、1.17±0.01、0.93±0.02，正常胃組織中分別為2.14±0.04、1.88±0.02、2.89±0.05，胃癌組織中ADD1、Ptch1、Gli1蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于正常胃組織(P均<0.05)。胃癌組織中ADD1、Ptch1、Cli1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.37±0.00、0.74±0.00、1.22±0.01，正常胃組織中分別為4.14±0.10、1.75±0.09、4.89±0.05，胃癌組織中ADD1、Ptch1、Gli1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于正常胃組織(P均<0.05)。

2.2 ADD1、Ptch1、Gli1蛋白及mRNA表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 低分化、Ⅲ～Ⅳ期、有漿膜浸潤(rùn)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中ADD1、Ptch1、Gli1蛋白及mRNA表達(dá)分別高于高分化、Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)漿膜浸潤(rùn)、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織(P均<0.05)。見(jiàn)表2、3。

2.3 胃癌組織中ADD1、Ptch1、Gli1蛋白及mRNA表達(dá)的相關(guān)性 胃癌組織中ADD1蛋白與Ptch1蛋白、Gli1蛋白表達(dá)均呈正相關(guān)關(guān)系(r分別為0.759、0.681，P均<0.01)，ADD1 mRNA與Ptch1 mRNA、Gli1 mRNA表達(dá)也呈正相關(guān)(r分別為0.811、0.719，P均<0.01)。

3 討論

胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有多種信號(hào)通路參與，這些信號(hào)通路并不是各自獨(dú)立的，它們之間存在著多種交叉。Hh信號(hào)通路具有誘導(dǎo)個(gè)體胚胎形成及調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化的作用。個(gè)體發(fā)育成熟以后，Hh信號(hào)分子只在特定部位表達(dá)，維持器官功能正常和機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。Hh信號(hào)通路功能紊亂會(huì)導(dǎo)致各種器官組織畸形[12]。已有研究[1～4]表明，胃癌的發(fā)生發(fā)展與Hh信號(hào)通路激活密切相關(guān)。

Ptch是靶基因細(xì)胞膜上的12次跨膜蛋白，是Hh信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子，包括Ptch1、Ptch2兩種亞型，二者表達(dá)部位有所不同。已有研究[13]表明，Ptch1在胃癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常胃組織。Ptch1是Hh信號(hào)通路激活和腫瘤發(fā)病的關(guān)鍵，可能成為早期診斷胃癌的標(biāo)志物。哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，Glis家族共有三個(gè)成員，分別為Gli1、Gli2、Gli3。Gli1是Hh信號(hào)通路末端的直接轉(zhuǎn)錄激活因子，主要負(fù)責(zé)激活Hh信號(hào)[14，15]，其活化標(biāo)志著Hh信號(hào)通路功能異常。Gli1還可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)化[14]，降低細(xì)胞間黏附力，增強(qiáng)細(xì)胞遷移能力，有利于腫瘤侵襲和擴(kuò)散。研究[16]發(fā)現(xiàn)，Gli1高表達(dá)與胃癌的發(fā)生有著密切關(guān)系。

表2 Ptch1、Gli1、ADD1蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

注：與高中分化者相比，*P<0.05；與Ⅰ～Ⅱ期者相比，#P<0.05；與無(wú)漿膜浸潤(rùn)者相比，△P<0.05；與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者相比，☆P<0.05。

表3 Ptch1、Gli1、ADD1 mRNA表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

注：與高中分化者相比，*P<0.05；與Ⅰ～Ⅱ期者相比，#P<0.05；與無(wú)漿膜浸潤(rùn)者相比，△P<0.05；與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者相比，☆P<0.05。

ADD1在構(gòu)建細(xì)胞膜骨架網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中起重要作用，有維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性和細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的作用。ADD1參與細(xì)胞的生命活動(dòng)，如細(xì)胞增殖、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞黏附等。ADD1可被多種蛋白激酶磷酸化，被磷酸化后的ADD1失去了正常調(diào)控功能，導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖。Shen等[17]發(fā)現(xiàn)ADD1磷酸化變體rs4963與結(jié)腸癌易感性相關(guān)。有學(xué)者[18]在人肺癌細(xì)胞株A549、H460、H1299和BEAS-2B中檢測(cè)到ADD1基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)。我們推測(cè)Hh信號(hào)通路與ADD1之間可能存在交叉作用，共同參與胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

本研究選取胃癌組織和癌旁正常胃組織各60例，檢測(cè)ADD1、Ptch1、Gli1蛋白及mRNA后發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中ADD1、Ptch1、Gli1蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于正常胃組織，低分化、Ⅲ～Ⅳ期、有漿膜浸潤(rùn)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中ADD1、Ptch1、Gli1蛋白及mRNA表達(dá)分別高于高分化、Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)漿膜浸潤(rùn)、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織，表明ADD1、Ptch1、Gli1蛋白及mRNA高表達(dá)與胃癌的發(fā)生及進(jìn)展有關(guān)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，胃癌組織中ADD1蛋白與Ptch1蛋白、Gli1蛋白表達(dá)均呈正相關(guān)關(guān)系，ADD1 mRNA與Ptch1 mRNA、Gli1 mRNA表達(dá)也呈正相關(guān)關(guān)系，提示Hh信號(hào)通路與細(xì)胞膜骨架蛋白ADD1之間有著交互作用，但具體機(jī)制尚未明確。我們推測(cè)Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中可能引起ADD1磷酸化位點(diǎn)改變，使得ADD1更容易被磷酸化，而磷酸化后的ADD1可改變細(xì)胞骨架穩(wěn)定性進(jìn)而加速Hh信號(hào)的傳遞。

總之，ADD1、Ptch1、Gli1可能共同參與胃癌的發(fā)生發(fā)展，且ADD1與Hedgehog信號(hào)通路之間可能存在一定相互作用關(guān)系。上述結(jié)論對(duì)進(jìn)一步明確胃癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制、尋找更有效的治療靶點(diǎn)有重要價(jià)值。

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河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題項(xiàng)目(ZL20140103)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.15.013

R735.2

B

1002-266X(2017)15-0048-03

2016-11-24)