封全靈，王智霆，劉慧云

(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院，鄭州450052)

子宮肌瘤細(xì)胞中孕激素受體M、A/B及porin蛋白表達(dá)觀察

封全靈，王智霆，劉慧云

(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院，鄭州450052)

目的 觀察子宮肌瘤細(xì)胞中孕激素受體M(PR-M)、孕激素受體A/B(PR-A/B)及porin蛋白的表達(dá)變化，并探討其意義。方法 子宮肌瘤切除術(shù)中切取子宮肌瘤組織及瘤旁正常子宮平滑肌組織后冰上盡快送實驗室，原代培養(yǎng)子宮肌瘤細(xì)胞和正常子宮平滑肌細(xì)胞并鑒定。取第3代子宮肌瘤細(xì)胞(實驗組)和正常平滑肌細(xì)胞(對照組)，采用Western blotting法檢測細(xì)胞中的PR-M、PR-A、PR-B、porin蛋白，分析PR-M、PR-A、PR-B蛋白與porin蛋白表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果 實驗組細(xì)胞中PR-M、PR-A、PR-B、porin蛋白相對表達(dá)量分別為0.130±0.012、0.432±0.052、0.456±0.045、0.525±0.082，對照組分別為0.086±0.015、0.223±0.036、0.269±0.026、0.202±0.034，實驗組細(xì)胞中PR-M、PR-A、PR-B蛋白和porin蛋白相對表達(dá)量均高于對照組(P均<0.01)。實驗組中PR-M蛋白與porin蛋白相對表達(dá)量呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.464，P<0.05)。結(jié)論 子宮肌瘤細(xì)胞中PR-M、PR-A、PR-B、porin蛋白表達(dá)升高，PR-M、PR-A、PR-B、porin蛋白表達(dá)異常可能與子宮肌瘤的發(fā)病有關(guān)，且PR-M蛋白與porin蛋白可能在子宮肌瘤發(fā)病中起協(xié)同作用。

子宮肌瘤；子宮肌瘤細(xì)胞；孕激素受體M；孕激素受體A；孕激素受體B；porin蛋白

子宮肌瘤發(fā)病率呈逐年上升趨勢，是臨床子宮切除的主要原因，其病因病機仍未明確。孕激素受體M(PR-M)是2003年發(fā)現(xiàn)的定位于核外線粒體的孕激素受體[1]，研究發(fā)現(xiàn)孕激素可誘導(dǎo)PR-M使線粒體膜電位增加，抑制乳腺癌細(xì)胞、原代及永生化子宮平滑肌細(xì)胞凋亡[2，3]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)PR-M、孕激素受體A(PR-A)和孕激素受體(PR-B)在子宮肌瘤組織中的表達(dá)量均顯著高于瘤旁正常子宮平滑肌組織，提示PR-M在子宮肌瘤生長過程中發(fā)揮促進(jìn)作用。porin是參與形成線粒體外膜小孔的線粒體標(biāo)志性蛋白，可誘導(dǎo)細(xì)胞代謝與凋亡[4,5]。本研究分離培養(yǎng)原代子宮平滑肌瘤細(xì)胞和正常子宮平滑肌細(xì)胞，觀察了子宮肌瘤細(xì)胞中PR-M、PR-A、PR-B與porin的表達(dá)變化，現(xiàn)在報告如下。

1 材料與方法

1.1 組織與材料 子宮肌瘤組織和相應(yīng)瘤旁組織來自行子宮肌瘤切除術(shù)的子宮肌瘤患者(20例)，患者年齡33～50歲。術(shù)中留取組織后立即置于4 ℃含雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，冰上盡快運回實驗室進(jìn)行處理。所有患者均無其他性激素相關(guān)合并癥，術(shù)前至少6個月內(nèi)未服用類固醇激素。組織標(biāo)本均經(jīng)病理檢查證實，標(biāo)本收集均經(jīng)患者知情同意。DMEM、DMEM-F12培養(yǎng)基(Hyclone公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶-EDTA、PBS、Ⅰ型膠原酶(索萊寶公司)，SP試劑盒、DAP染色試劑盒(北京中山金橋公司)，一抗β-actin、一抗Anti-smooth muscle Actin antiboby、線粒體porin蛋白(武漢三鷹生物科技有限公司)，一抗c-19(抗PR抗體，Santa Cruz公司)。

1.2 子宮肌瘤細(xì)胞及子宮平滑肌細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定 參照文獻(xiàn)[6]方法并加以改良。分別將子宮肌瘤組織塊和瘤旁正常子宮平滑肌組織塊放入含雙抗PBS液的無菌培養(yǎng)皿中浸泡3～5 min,漂洗3 次，將組織塊盡量剪碎，向管中加入0.2% Ⅰ型膠原酶，在37 ℃水浴消化2～3 h，1 000 r/min離心10 min后棄上清，加入10%完全培養(yǎng)基接種細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁進(jìn)行第1次換液，以后每2～3天換液1次，待細(xì)胞融合達(dá)80%時用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化傳代。傳至第三代細(xì)胞時在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，免疫組化染色進(jìn)行鑒定。細(xì)胞呈長梭形或不規(guī)則，細(xì)胞一般呈放射狀生長，4 d左右細(xì)胞生長數(shù)量有明顯增加，7～10 d細(xì)胞數(shù)量達(dá)高峰，密集處多呈旋渦狀生長，并出現(xiàn)層疊排列及典型的“峰-谷”樣現(xiàn)象(見圖1)，經(jīng)免疫組化檢查鑒定為子宮肌瘤細(xì)胞。子宮平滑肌細(xì)胞分離培養(yǎng)、傳代參考上述方法，細(xì)胞形態(tài)見圖1。

注：A為200倍鏡下子宮肌瘤細(xì)胞形態(tài)；B為200倍鏡下子宮平滑肌細(xì)胞形態(tài)。

1.3 PR-M、PR-A/B、porin蛋白檢測 采用Western blotting法。取第3代子宮肌瘤細(xì)胞(實驗組)和正常平滑肌細(xì)胞(對照組)分別接種于6孔板中，培養(yǎng)細(xì)胞融合至80%～90%時，提取細(xì)胞總蛋白，按25 μg/孔進(jìn)行10%SDS-PAGE凝膠電泳，然后將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至NC膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST漂洗3次，加入1∶800稀釋的PR兔源多克隆抗體，4 ℃冰箱過夜，加入1∶4 000稀釋的紅色熒光標(biāo)記的羊抗兔IgG，室溫反應(yīng)2 h，TBST漂洗，Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)掃描結(jié)果并分析，以目的蛋白蛋白條帶灰度值與β-actin內(nèi)參條帶灰度值的比值表示目的蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

實驗組細(xì)胞中PR-M、PR-A、PR-B、porin蛋白相對表達(dá)量分別為0.130±0.012、0.432±0.052、0.456±0.045、0.525±0.082，對照組分別為0.086±0.015、0.223±0.036、0.269±0.026、0.202±0.034，實驗組細(xì)胞中PR-M、PR-A、PR-B、porin蛋白相對表達(dá)量均高于對照組(P均<0.01)。見圖2。實驗組中PR-M蛋白與porin蛋白相對表達(dá)量呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.464，P<0.05)，實驗組中PR-A、PR-B蛋白與porin蛋白表達(dá)無關(guān)性(r分別為0.340、0.052，P均>0.05)。對照組中PR-M、PR-A、PR-B蛋白與porin蛋白表達(dá)均無相關(guān)性(r分別為0.078、0.199和-0.262，P均>0.05)。

3 討論

體外培養(yǎng)的子宮肌瘤細(xì)胞是研究子宮肌瘤發(fā)病機制和藥物篩選的理想材料，可有效控制相關(guān)實驗條件，重復(fù)性強且節(jié)省實驗用藥和實驗試劑。但由于子宮肌瘤并非惡性腫瘤，缺少無限增殖的特性，高純度且生長狀態(tài)穩(wěn)定的肌瘤細(xì)胞的提取與培養(yǎng)是一個難題。另外，原代培養(yǎng)細(xì)胞容易污染且不易存活，傳代后細(xì)胞狀態(tài)及性狀變化也加大了原代培養(yǎng)的難度及實驗細(xì)胞的均一性。本研究參考文獻(xiàn)[6]方法，并根據(jù)實驗室條件加以改良和優(yōu)化，提高了細(xì)胞提取率、細(xì)胞純度及細(xì)胞數(shù)量，便于進(jìn)行下一步實驗。

注：A為對照組；B為實驗組。

PR屬于配體激活核轉(zhuǎn)錄因子超家族成員。傳統(tǒng)PR主要是指PR-A 和PR-B，兩者主要分布于胞核和胞質(zhì)。PR-M是2002年從人主動脈細(xì)胞和脂肪組織cDNA文庫克隆到的，PR-M存在于線粒體外膜，孕激素可通過與PR-M結(jié)合使平滑肌細(xì)胞線粒體膜電位(MMP)升高，此過程沒有蛋白質(zhì)合成，孕激素可能通過PR-M發(fā)揮非基因組效應(yīng)(孕激素可不依賴孕激素核受體的轉(zhuǎn)錄活性產(chǎn)生快速調(diào)節(jié)作用)，使細(xì)胞呼吸加強，能量代謝增加，抑制細(xì)胞凋亡最終導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖。PR-M是目前發(fā)現(xiàn)的惟一直接參與孕激素的非基因組效應(yīng)的類固醇激素受體亞型[7]。多項研究[8，9]顯示PR-M在子宮肌瘤組織中的表達(dá)量較正常肌層組織中升高。研究[10]表明，PR-M在孕激素誘導(dǎo)下參與細(xì)胞存活和增殖的能量供給。有學(xué)者[11]提出PR能直接激活信號通路，引起子宮肌瘤細(xì)胞增殖永生化，證明孕激素能增加線粒體膜電位且這一作用可被PR拮抗劑所抑制。Su等[12]發(fā)現(xiàn)雌孕激素可以通過一些生長因子介導(dǎo)的自分泌或旁分泌的方式作用于子宮肌瘤細(xì)胞，刺激細(xì)胞分裂及增殖；該學(xué)者還認(rèn)為，雌孕激素與表皮生長因子及其受體之間可能互為調(diào)控，共同影響子宮肌瘤的發(fā)生[13]。以上研究均證實孕激素可通過其相應(yīng)受體參與子宮肌瘤的發(fā)生發(fā)展。線粒體外膜孔蛋白porin定位于線粒體外膜，組成線粒體外膜小孔蛋白的主要部分，其功能與MMP相關(guān)[14]。研究表明，子宮肌瘤細(xì)胞中porin 表達(dá)顯著高于正常平滑肌細(xì)胞，提示肌瘤細(xì)胞線粒體功能較鄰近平滑肌細(xì)胞活躍。孕激素非基因組作用的機制尚未明確。研究[15]表明孕激素可能通過直接與經(jīng)典細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)合受體發(fā)揮作用。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為，孕激素PR-B和PR-A發(fā)揮調(diào)節(jié)基因表達(dá)的功能[16]。然而，近幾十年來，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)孕激素具有獨立于基因調(diào)控外的作用。這些功能基于孕激素誘導(dǎo)的細(xì)胞事件，它們發(fā)生過于迅速，涉及基因轉(zhuǎn)錄或缺乏活躍的基因轉(zhuǎn)錄，如精子成熟。以往這種“非基因組作用”的特異性受體尚不明確[17]。有學(xué)者[18,19]發(fā)現(xiàn)了一種線粒體孕激素受體PR-M,開啟了直接的線粒體活性配體依賴性調(diào)節(jié)的可能性。

本研究觀察了原代培養(yǎng)的子宮肌瘤細(xì)胞中PR-M、PR-A、PR-B、porin蛋白的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，實驗組細(xì)胞中PR-M、PR-A、PR-B蛋白和porin蛋白相對表達(dá)量均高于對照組；進(jìn)一步分析顯示，實驗組中PR-M蛋白與porin蛋白相對表達(dá)量呈正相關(guān)關(guān)系而PR-A、PR-B蛋白與porin蛋白表達(dá)無關(guān)，對照組PR-M、PR-A、PR-B蛋白與porin蛋白均無相關(guān)性，與先前文獻(xiàn)報道的結(jié)果一致[20]。上述結(jié)果提示，PR-M、PR-A、PR-B、porin蛋白表達(dá)異?？赡芘c子宮肌瘤的發(fā)病有關(guān)，且PR-M蛋白與porin蛋白可能在子宮肌瘤發(fā)病中起協(xié)同作用，但其具體通過何種途徑或方式還有待進(jìn)一步研究。

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河南省高等學(xué)校重點科研項目計劃(16A320047)。

封全靈(E-mail: 614992855@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.15.012

R711.74

A

1002-266X(2017)15-0045-03

2016-08-29)