張弦，蔣道榮，趙華，蔣偉

(1南通大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南通226001；2南通大學(xué))

苦參素聯(lián)合復(fù)方茵陳顆粒預(yù)處理對大鼠急性肝衰竭的防治作用觀察

張弦1，蔣道榮1，趙華1，蔣偉2

(1南通大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南通226001；2南通大學(xué))

目的 觀察苦參素(OMT)聯(lián)合復(fù)方茵陳顆粒(FYK)預(yù)處理對大鼠急性肝衰竭的防治作用，并探討其機(jī)制。方法 雄性SD大鼠90只，隨機(jī)分為實驗1組、實驗2組、實驗3組、OMT組、損傷組、對照組，每組15只。OMT組腹腔注射OMT 120 mg/kg，1次/d；實驗1組、實驗2組、實驗3組分別灌服3、6、12 g/(kg·d)的FYK，2 h后再注射OMT，劑量參照OMT組；對照組和損傷組腹腔注射等容量生理鹽水；各組用藥連續(xù)3 d。用藥2 d后大鼠禁食24 h，除對照組外，其余各組腹腔注射D-氨基半乳糖(D-GalN)、皮內(nèi)注射脂多糖(LPS)。24 h后處死大鼠，HE染色觀察肝組織病理改變、全自動生化分析儀檢測血清ALT、AST(ALT>1 700 IU/L、AST>1 500 IU/L)以評價肝衰竭發(fā)生情況；流式細(xì)胞術(shù)測算肝組織中細(xì)胞凋亡率；Western blotting法檢測肝組織中的TLR4、p38、p-p38、JNK及p-JNK蛋白；免疫組化SP法檢測肝組織中的TLR4、Bax、Bcl-2和active-caspase-3蛋白。結(jié)果 損傷組實驗過程中死亡5只，OMT組死亡1只，死因均為肝衰竭。對照組及實驗1、2、3組大鼠均存活。OMT組及實驗1、2、3組肝組織病理損傷較損傷組減輕。損傷組血清AST、ALT水平高于其余各組，OMT組血清AST、ALT水平低于損傷組，實驗2、3組血清AST、ALT水平低于OMT組(P均<0.05)。損傷組肝衰竭發(fā)生率100%，OMT組為66.7%，實驗1、2、3組分別為53.3%、40%、33.3%，OMT組及實驗1、2、3組肝衰竭發(fā)生率低于損傷組，且OMT組與實驗1、2、3組肝衰竭發(fā)生率依次降低(P均<0.05)。損傷組肝細(xì)胞凋亡率高于其余各組，OMT組肝細(xì)胞凋亡率低于損傷組，實驗3組肝細(xì)胞凋亡率低于OMT組(P均<0.05)。與其余各組相比，損傷組肝組織中TLR4蛋白相對表達(dá)量增高，p-p38/p38、p-JNK/JNK增高；OMT組肝組織中TLR4蛋白相對表達(dá)量和p-p38/p38、p-JNK/JNK低于損傷組；實驗2、3組肝組織中TLR4蛋白相對表達(dá)量和p-p38/p38、p-JNK/JNK低于OMT組，且實驗3組低于實驗2組(P均<0.05)。損傷組肝組織中TLR4、Bax、active-caspase-3蛋白表達(dá)積分高于其余各組，OMT組TLR4、Bax、active-caspase-3蛋白表達(dá)積分低于損傷組，實驗3組低于OMT組(P均<0.05)。損傷組肝組織中Bcl-2蛋白表達(dá)積分低于其余各組，OMT組Bcl-2蛋白表達(dá)積分高于損傷組，實驗3組高于OMT組(P均<0.05)。結(jié)論 OMT聯(lián)合FYK預(yù)處理對肝衰竭有一定防治作用，可減輕肝組織病理損傷，減少肝細(xì)胞凋亡，機(jī)制可能包括TLR4、active-caspase-3蛋白表達(dá)下調(diào)，p-p38/p38、p-JNK/JNK、Bax/Bcl-2下降，TLR4/p38/JNK信號通路功能抑制等。

肝衰竭；苦參素；復(fù)方茵陳顆粒；Toll樣受體4；p38絲裂原活化蛋白激酶；c-Jun氨基末端激酶；細(xì)胞凋亡；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶

急性肝衰竭的主要病理變化是肝細(xì)胞大量死亡，引起肝功能嚴(yán)重受損[1]。在急性肝衰竭的發(fā)病過程中，細(xì)胞凋亡起著非常重要的作用，但肝細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚未知。TLR4主要識別革蘭陰性菌胞壁成分脂多糖(LPS)。研究[2～4]發(fā)現(xiàn)，在肝衰竭小鼠中TLR4表達(dá)顯著升高。Tournier等[5]研究認(rèn)為，在絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，p38與JNK通路參與介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。對于急性肝衰竭時肝細(xì)胞凋亡過程中是否有TLR4介導(dǎo)的p38/JNK信號通路參與，目前尚未明確?？鄥⑺?OMT)具有抗過敏、抗凋亡、抗炎、抗氧化、抗纖維化及抗病毒等作用。復(fù)方茵陳顆粒(FYK)由茵陳、丹參及大黃按一定比例配置而成，其中茵陳可促進(jìn)內(nèi)毒素從膽汁排出，丹參可改善肝臟微循環(huán)、減輕中毒性肝損傷，大黃可抗菌消炎、排毒、通里攻下，減輕急性肝衰竭時肝細(xì)胞損傷。本研究觀察了OMT聯(lián)合FYK預(yù)處理對大鼠急性肝衰竭的防治作用，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料 雄性SD大鼠90只，SPF級別，體質(zhì)量200～250 g，由南通大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號SYXK(蘇)2012-0031。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為實驗1組、實驗2組、實驗3組、OMT組、損傷組、對照組，每組15只。復(fù)方茵陳顆粒劑為南通市中醫(yī)院制劑室將茵陳、丹參、大黃按2∶1∶1比例制成的顆粒劑，1劑10 g，含茵陳、丹參、大黃分別為5、2.5、2.5 g。用前以雙蒸水配制，分為小、中、大3個劑量，其劑量比例分別為1∶2∶4，濃度分別為1.5、3、6 g/mL，中劑量相當(dāng)于臨床應(yīng)用劑量。

1.2 用藥方法及肝衰竭情況觀察 OMT組腹腔注射OMT 120 mg/kg，1次/d，給藥容量均為2 mL/kg；實驗1組、實驗2組、實驗3組分別灌服3、6、12 g/(kg·d)的FYK，2 h后再注射OMT，劑量參照OMT組；對照組和損傷組腹腔注射等容量生理鹽水；各組用藥連續(xù)3 d。D-GalN和LPS聯(lián)合用藥是建立大鼠急性肝衰竭模型最常用的方法之一，參照文獻(xiàn)[6]方法，各組用藥2 d后將大鼠禁食24 h，除對照組外，其余各組大鼠腹腔注射D-GalN 700 mg/kg、同時皮內(nèi)注射LPS 10 μg/kg。肝衰竭判定標(biāo)準(zhǔn)為：血ALT>1 700 IU/L、AST>1 500 IU/L，病理檢查見肝細(xì)胞大量壞死、無正常肝小葉結(jié)構(gòu)、纖維網(wǎng)狀支架塌陷、匯管區(qū)大量炎癥細(xì)胞浸潤。

1.3 肝細(xì)胞凋亡率測算 取出大鼠肝組織，將0.2 g肝中葉組織塊剪碎成小塊，放入研磨器中并加入3 mL生理鹽水研磨至勻漿，反復(fù)用生理鹽水沖洗研磨器，收集細(xì)胞懸液，用300目尼龍網(wǎng)濾去細(xì)胞團(tuán)塊，800 r/min離心5 min，PBS清洗3次，500 r/min離心5 min，棄上清。加入250 μL的loading buffer重懸細(xì)胞。加入2.5 μL的Annexin V-FITC輕輕混勻。室溫避光孵育10 min。500 r/min離心5 min，棄上清。加入250 μL的loading buffer輕輕重懸細(xì)胞。加入2.5 μL的PI輕輕混勻，冰浴避光放置。1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測。

1.4 Western blotting法檢測肝組織中TLR4、p38、p-p38、JNK及p-JNK蛋白 稱取100 mg肝組織，盡量剪碎成小塊置于預(yù)冷的PBS(含0.1 mmol/L PMSF)中清洗，反復(fù)3次，去除紅細(xì)胞。加入預(yù)冷的蛋白裂解液(含1 mmol/L PMSF)中冰浴勻漿至充分裂解。4 ℃、12 000 r/min離心5 min，吸取上清，BCA法測定蛋白濃度。經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入對應(yīng)一抗孵育，放入4 ℃冰箱過夜，用1×TBST溶液洗3次，加入二抗孵育2 h，再用1×TBST溶液洗3次。將顯影液A、B液滴加到膜上，于ChemiDox XRS型凝膠電化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下顯影，掃描成灰度照片。Image J軟件分析各組條帶灰度值，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示目的蛋白相對表達(dá)量。

1.5 免疫組化法檢測肝組織中TLR4、Bax、Bcl-2、active-caspase-3蛋白 取大鼠肝臟，將肝中葉組織一部分切成6 mm×5 mm×5 mm小塊浸入10%中性甲醛溶液中固定，用于HE染色及免疫組化分析。組織塊固定24 h后按脫水、透明、浸蠟、包埋、切片等步驟制成石蠟切片。采用SP法染色觀察肝組織中TLR4、Bax、Bcl-2、active-caspase-3蛋白表達(dá)情況。結(jié)果判定：TLR4陽性細(xì)胞為胞質(zhì)呈棕黃色，Bax陽性細(xì)胞為胞膜、胞質(zhì)有棕黃色顆粒沉著，Bcl-2陽性細(xì)胞為胞膜、胞質(zhì)有棕黃色顆粒沉著，active-caspase-3陽性細(xì)胞為胞核、胞質(zhì)呈棕黃色。參照Formwitz法進(jìn)行評分，每張切片觀察10個高倍視野(400×)，按著色深淺和陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行半定量分析：無明顯著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，深棕色為3分；陽性細(xì)胞百分比<5%為0分，5%～<25%為1分，25%～<50%為2分，50%～<75%為3分，≥75%為4分；兩項得分相乘，記錄各目的蛋白的表達(dá)積分。

2 結(jié)果

2.1 各組肝衰竭發(fā)生情況 實驗過程中損傷組死亡5只，OMT組死亡1只，死因均為肝衰竭。對照組及實驗1、2、3組大鼠均存活且一般情況較好。損傷組可見肝臟大體腫脹明顯，表面彌漫出血，大片瘀斑，呈暗紅色；HE染色見損傷組肝細(xì)胞明顯壞死，僅少量肝細(xì)胞殘存、散在分布，無正常肝小葉結(jié)構(gòu)，纖維網(wǎng)狀支架塌陷，匯管區(qū)大量炎癥細(xì)胞浸潤。OMT組及實驗1、2、3組肝組織病理損傷逐漸減輕。損傷組血清ALT、AST水平高于其余各組，OMT組血清AST、ALT水平低于損傷組，實驗2、3組血清AST、ALT水平低于OMT組(P均<0.05，見表1)。損傷組肝衰竭發(fā)生率100%，OMT組為66.7%，實驗1、2、3組分別為53.3%、40.0%、33.3%，OMT組及實驗1、2、3組肝衰竭發(fā)生率低于損傷組，且OMT組與實驗1、2、3組肝衰竭發(fā)生率依次降低(P均<0.05)。

2.2 各組大鼠肝細(xì)胞凋亡率比較 實驗1組、實驗2組、實驗3組、OMT組、損傷組、對照組大鼠肝細(xì)胞凋亡率分別為49.38±5.90%、42.72%±4.92%、35.42%±3.60%、52.67%±4.69%、67.82%±8.73%、18.34%±2.37%，其中損傷組肝細(xì)胞凋亡率高于其余各組(P均<0.05)，OMT組肝細(xì)胞凋亡率低于損傷組，實驗3組肝細(xì)胞凋亡率低于OMT組(P均<0.05)。

表1 各組大鼠血清ALT、AST水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與損傷組比較，#P<0.05；與OMT組比較，△P<0.05。

2.3 各組大鼠肝組織中TLR4、p-p38、p38、p-JNK、JNK蛋白表達(dá)比較 與其余各組相比，損傷組肝組織中TLR4蛋白相對表達(dá)量增高，p-p38/p38、p-JNK/JNK增高；OMT組肝組織中TLR4蛋白相對表達(dá)量和p-p38/p38、p-JNK/JNK低于損傷組；實驗2、3組肝組織中TLR4蛋白相對表達(dá)量和p-p38/p38、p-JNK/JNK低于OMT組，實驗3組肝組織中TLR4蛋白相對表達(dá)量和p-p38/p38、p-JNK/JNK低于實驗2組(P均<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠肝組織TLR4蛋白相對表達(dá)量、p-p38/p38、p-JNK/JNK比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與損傷組比較，#P<0.05；與OMT組比較，△P<0.05。

2.4 各組大鼠肝組織中TLR4、Bax、Bcl-2、active-caspase-3蛋白表達(dá)積分比較 損傷組肝組織中TLR4、Bax、active-caspase-3蛋白表達(dá)積分高于其余各組，OMT組TLR4、Bax、active-caspase-3蛋白表達(dá)積分低于損傷組，實驗3組低于OMT組(P均<0.05)。損傷組肝組織中Bcl-2蛋白表達(dá)積分低于其余各組，OMT組Bcl-2蛋白表達(dá)積分高于損傷組，實驗3組高于OMT組(P均<0.05)。詳見表3。

3 討論

研究[7]表明細(xì)胞凋亡是急性肝衰竭的主要病理特征。在病毒和內(nèi)毒素等損傷因子引起的肝損傷相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞凋亡現(xiàn)象明顯[8]。OMT具有多種藥理活性，被廣泛應(yīng)用于一些炎癥性疾病、肝炎、心臟疾病的治療[9]，然而，OMT聯(lián)合FYK對肝衰竭時肝細(xì)胞凋亡的抑制作用及其機(jī)制尚不清楚。

表3 各組大鼠肝組織中TLR4、Bax、Bcl-2、active-caspase-3蛋白表達(dá)積分比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與損傷組比較，#P<0.05；與OMT組比較，△P<0.05。

文獻(xiàn)表明，應(yīng)用D-GalN和LPS聯(lián)合誘導(dǎo)動物急性肝衰竭的實驗方法比較完善，出現(xiàn)的肝損害表現(xiàn)與臨床病毒性肝衰竭較相近，是一種較為理想的肝衰竭動物模型。D-GalN是特異性肝細(xì)胞轉(zhuǎn)錄抑制物，可破壞肝臟的生物合成功能，造成肝彌漫性壞死和炎癥。LPS是重要的毒性成分[10～13]。本研究先給予OMT聯(lián)合FYK預(yù)處理，并給予LPS/D-GalN，觀察各組急性肝衰竭發(fā)生情況、肝臟病理形態(tài)的改變，發(fā)現(xiàn)OMT組和實驗1、2、3組肝組織病理損傷不同程度改善；OMT組及實驗1、2、3組肝衰竭發(fā)生率低于損傷組，且OMT組與實驗1、2、3組肝衰竭發(fā)生率依次降低，提示OMT聯(lián)合FYK預(yù)處理有助于預(yù)防急性肝衰竭的發(fā)生，與相關(guān)研究結(jié)果一致[6]。

在肝細(xì)胞壞死、細(xì)胞膜損傷時，細(xì)胞內(nèi)AST、ALT自細(xì)胞內(nèi)流向血液，使血清中 AST、ALT水平增高，因此，血清AST、ALT水平可反映肝功能受損程度。本研究結(jié)果顯示，損傷組血清AST、ALT水平及肝細(xì)胞凋亡率高于其余各組，OMT組血清AST、ALT水平及肝細(xì)胞凋亡率低于損傷組，實驗2、3組血清AST、ALT水平低于OMT組，實驗3組肝細(xì)胞凋亡率低于OMT組，提示OMT聯(lián)合FYK預(yù)處理可降低大鼠血清ALT、AST水平，減少肝細(xì)胞凋亡，改善肝功能，保護(hù)肝組織。

MAPK是公認(rèn)的與細(xì)胞增殖、分化及凋亡有關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)酶類。在LPS/D-GalN誘導(dǎo)的肝損傷中，激活的MAPKs可導(dǎo)致肝組織炎癥反應(yīng)。p38在調(diào)節(jié)炎癥、纖維化和細(xì)胞凋亡中起著至關(guān)重要的作用[14]。蛋白激酶JNK包括JNK1、JNK2、JNK3三個基因，編碼10個不同的剪接變異體[15]。我們采用Western blotting法檢測了肝組織中的TLR4、p38、p-p38、JNK及p-JNK蛋白，發(fā)現(xiàn)與其余各組相比，損傷組肝組織中TLR4蛋白相對表達(dá)量增高，p-p38/p38、p-JNK/JNK增高；OMT組肝組織中TLR4蛋白相對表達(dá)量和p-p38/p38、p-JNK/JNK低于損傷組；實驗2、3組肝組織中TLR4蛋白相對表達(dá)量和p-p38/p38、p-JNK/JNK低于OMT組，且實驗3組低于實驗2組。上述結(jié)果提示，OMT聯(lián)合FYK能降低肝衰竭大鼠肝組織中TLR4表達(dá)，降低p38及JNK的磷酸化水平，OMT聯(lián)合FYK可能通過調(diào)節(jié)TLR4/p38/JNK信號通路保護(hù)肝細(xì)胞。

急性肝衰竭時，LPS、氧化應(yīng)激和炎癥因子作用均可激活肝細(xì)胞內(nèi)的MAPK和caspase-8，導(dǎo)致JNK磷酸化，在肝細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)和執(zhí)行中起著至關(guān)重要的作用。JNK磷酸化可影響B(tài)ax及抗凋亡蛋白Bcl-2的釋放和激活[16,17]。LPS/D-GalN刺激后，大鼠肝細(xì)胞凋亡率明顯增加，細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，激活下游的caspase(如caspase-3)，參與凋亡程序執(zhí)行。LPS誘導(dǎo)Bax蛋白寡聚化，增強(qiáng)細(xì)胞通透性，通過caspase介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡程序損傷線粒體結(jié)構(gòu)。Bcl-2家族Bax是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵效應(yīng)蛋白，可調(diào)控程序性細(xì)胞死亡或凋亡。面對外來刺激時，細(xì)胞存活或凋亡主要取決于Bcl-2家族中促進(jìn)細(xì)胞死亡因子和促進(jìn)細(xì)胞存活因子的比例。本研究結(jié)果顯示，損傷組肝組織中TLR4、Bax、active-caspase-3蛋白表達(dá)積分高于其余各組，OMT組TLR4、Bax、active-caspase-3蛋白表達(dá)積分低于損傷組，實驗3組低于OMT組；損傷組肝組織中Bcl-2蛋白表達(dá)積分低于其余各組，OMT組Bcl-2蛋白表達(dá)積分高于損傷組，實驗3組高于OMT組。上述結(jié)果提示OMT聯(lián)合FYK可使Bax、active-caspase-3表達(dá)進(jìn)一步降低，Bcl-2表達(dá)進(jìn)一步增加，從而減少肝細(xì)胞凋亡，發(fā)揮肝細(xì)胞保護(hù)作用。

結(jié)合上述研究結(jié)果，我們認(rèn)為，OMT聯(lián)合FYK預(yù)處理對肝衰竭有一定防治作用，可減輕肝組織病理損傷，減少肝細(xì)胞凋亡，機(jī)制可能包括TLR4、active-caspase-3蛋白表達(dá)下調(diào)，p-p38/p38、p-JNK/JNK、Bax/Bcl-2下降，TLR4/p38/JNK信號通路功能抑制等。

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江蘇省中醫(yī)藥局科技項目(YB2015177)。

蔣偉(E-mail： zhangxian8412@163.com)

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R575.3

A

1002-266X(2017)15-0037-04

2016-11-11)