李師思，史達，李欣明，覃淑萍，全顯躍

(南方醫(yī)科大學附屬珠江醫(yī)院，廣州510282)

大鼠S0～S4期肝纖維化的拉曼光譜觀察

李師思，史達，李欣明，覃淑萍，全顯躍

(南方醫(yī)科大學附屬珠江醫(yī)院，廣州510282)

目的 觀察不同分期肝纖維化大鼠近紅外線激光拉曼光譜檢查結果變化，并探討其意義。方法 SD雄性大鼠65只，分為空白組15只、模型組50只。模型組大鼠皮下注射50%四氯化碳橄欖油溶液制作肝纖維化模型(7只在造模過程中死亡)，造模后取肝臟組織進行病理檢查，按肝纖維化分期標準，S0期(空白組)15只、S1期11只、S2期12只、S3期10只、S4期10只。取大鼠病變肝組織，進行拉曼光譜檢測，觀察S0～S4期病變組織拉曼光譜特征并比較各分期不同譜帶處的拉曼光譜峰值。結果 不同分期肝纖維化組織平均拉曼光譜譜峰位置變化較小。入選大鼠肝組織的典型拉曼譜峰位于848 cm-1、1 006 cm-1、1 268 cm-1、1 305 cm-1、1 442 cm-1、1 595 cm-1、1 658 cm-1譜帶處，其分子歸屬分別為酪氨酸和膠原蛋白、苯丙氨酸呼吸鏈和β胡蘿卜素、酰胺Ⅲ和脂質(zhì)、脂類、脂質(zhì)/磷脂脂肪酸和膽固醇、醌型環(huán)、膠原蛋白和彈力蛋白。S0～S4期組織在1 658 cm-1譜帶處的峰值依次遞增(P均<0.05)，在1 006 cm-1譜帶處的峰值依次遞減(P均<0.05)；在1 268 cm-1、1 305 cm-1、1 442 cm-1譜帶處，以S2期組織峰值最高(P均<0.05)；在1 595 cm-1譜帶處，以S0期組織峰值最高，S1期組織峰值最低(P均<0.05)。結論 不同分期肝纖維化大鼠近紅外線激光拉曼光譜檢查結果存在差異；拉曼光譜檢查有助于肝纖維化的早期發(fā)現(xiàn)及分期評估。

肝臟；肝纖維化；紅外線激光；拉曼光譜

肝纖維化是繼發(fā)于各種形式慢性肝損傷后組織修復過程中的代償反應，是許多慢性肝病發(fā)展為肝硬化的共同病理過程，其本質(zhì)是細胞外基質(zhì)的合成與降解失衡，導致細胞外基質(zhì)在肝內(nèi)過量沉積。目前肝纖維化分為S0～S4期：S0期，無纖維化；S1期，匯管區(qū)及其周圍纖維化和局限竇周纖維化；S2期，纖維間隔形成，但大部分小葉結構保留；S3期，大量纖維間隔分隔并破壞肝小葉，但尚無肝硬化；S4期，早期肝硬化[1]。肝纖維化病變進展過程中，肝功能逐漸減退、喪失，若損傷因素持續(xù)存在，肝纖維化可逐步進展至終末期肝硬化，并發(fā)癥多，預后差，病死率高[2,3]。現(xiàn)已證實早期肝纖維化具有可逆轉(zhuǎn)性[4,5]。肝纖維化早期治療可阻遏或延緩其發(fā)展，早期診斷肝纖維化對延緩病情發(fā)展、提高患者生活質(zhì)量有著非常重要的意義。研究[6,7]表明，激光拉曼光譜技術可精確提供細胞及組織中分子特征信息，常被用于多種疾病的診斷。本研究制作了肝纖維化大鼠模型，觀察不同分期肝纖維化大鼠近紅外線激光拉曼光譜檢查結果變化，并探討其意義，以期為肝纖維化的早期診斷提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動物分組及肝纖維化模型制作 健康清潔雄性SD大鼠65只[動物許可證編號：SCXK(粵)2011-0015]，體質(zhì)量180～220 g，由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供，在SPF級環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度18～20 ℃，濕度60%～70%，實驗期間自由飲食。65只大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，分為空白組15只、模型組50只，將空白組大鼠麻醉取肝組織行拉曼光譜檢測并行病理檢查；模型組大鼠皮下注射50%四氯化碳橄欖油溶液0.2 mL/100 g制作肝纖維化模型，每周2次，每次注射前稱取體質(zhì)量，以調(diào)整用藥量。分別于造模后第14、21、28、35、42、49、56、63、70、77天從模型組隨機選取3～5只大鼠，采用過量麻醉法處死大鼠，取肝組織，依次行拉曼光譜檢測及病理檢查。造模過程中，模型組有7只大鼠死亡。按肝纖維化分期標準[1]，最終納入S0期(空白組)15只、S1期11只、S2期12只、S3期10只、S4期10只。

1.2 拉曼光譜檢測及觀察方法 使用InVia +Plus型共焦顯微拉曼光譜儀(英國Rinishaw公司)，將制備好的樣本置于顯微鏡下，使聚焦于樣本，設置激發(fā)光波長為785 nm，20倍物鏡聚焦激光，收集拉曼光譜信號，累計曝光時間8 s，取譜區(qū)間700～1 800 cm-1，光譜分辨率1 cm-1，每個樣本測8個點，將同一樣本的8條光譜平均，以此代表該樣本的拉曼光譜信號。所有樣本于離體后3 h內(nèi)檢測完畢。將光譜圖輸入計算機，運用Raman-Wire、Matlab、Origin8.5軟件進行數(shù)據(jù)和圖譜處理。觀察S0～S4期肝纖維化大鼠病變組織拉曼光譜特征并比較各分期組織在不同譜帶處的拉曼光譜峰值。

2 結果

不同分期肝纖維化組織平均拉曼光譜譜峰位置變化較小，對比經(jīng)過平滑和歸一化的S0～S4期大鼠平均拉曼光譜，入選大鼠肝組織的典型拉曼譜峰位于848 cm-1、1 006 cm-1、1 268 cm-1、1 305 cm-1、1 442 cm-1、1 595 cm-1、1 658 cm-1譜帶處，其分子歸屬分別為酪氨酸和膠原蛋白、苯丙氨酸呼吸鏈和β胡蘿卜素、酰胺Ⅲ和脂質(zhì)、脂類、脂質(zhì)/磷脂脂肪酸和膽固醇、醌型環(huán)、膠原蛋白和彈力蛋白。S0～S4期組織在1 658 cm-1譜帶處的峰值依次遞增(P均<0.05)，在1 006 cm-1譜帶處的峰值依次遞減(P均<0.05)；在1 268 cm-1、1 305 cm-1、1 442 cm-1譜帶處，以S2期組織峰值最高(P均<0.05)；在1 595 cm-1譜帶處，以S0期組織峰值最高，S1期組織峰值最低(P均<0.05)。詳見表1。

表1 S0～S4期大鼠肝纖維化組織不同譜帶處拉曼光譜峰值比較

注：與S0期比較，*P<0.05；與S1期比較，#P<0.05；與S2期比較，△P<0.05；與S3期比較，☆P<0.05。

3 討論

拉曼光譜是由分子振動能量產(chǎn)生的散射光組成。生物分子如核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及碳水化合物均可產(chǎn)生特征性的拉曼光譜信號。組織細胞發(fā)生病變，歸根結底是由于組成細胞蛋白質(zhì)、核酸、脂類和糖類等分子的變化，與原正常組織相比，上述成分的組成比例和分子空間物理化學排列發(fā)生變化。拉曼光譜作為測量物質(zhì)成分的有效工具[8]，對于惡性腫瘤及其他疾病的診斷及治療效果評估有重要價值。拉曼光譜是一種非破壞性的分析技術，因有望取代病理活檢而成為相關領域研究的熱點[9]。有學者對皮膚癌、宮頸癌、乳腺癌、消化道腫瘤等病變組織進行拉曼光譜檢測，發(fā)現(xiàn)拉曼譜在上述惡性腫瘤的早期診斷中有一定應用價值[10～13]。

本研究發(fā)現(xiàn)，實驗大鼠肝組織拉曼光譜譜峰穩(wěn)定，重復性好，在代表膠原蛋白、彈力蛋白的1 658 cm-1譜帶處譜峰值隨大鼠肝纖維化程度加重而呈現(xiàn)遞增趨勢，表明隨著大鼠纖維化程度加重，肝組織內(nèi)膠原蛋白、彈力蛋白等纖維成分逐漸增加，與肝纖維化發(fā)展的病理過程相符合。拉曼光譜在肝纖維化早期即檢測出纖維相關成分變化，為拉曼光譜在肝纖維化早期診斷中的應用提供了有力依據(jù)。

β-胡蘿卜素已被證明能抑制包括皮膚、乳腺、肝、肺、結腸等器官發(fā)生癌變[14]。在肝臟，β-胡蘿卜素為合成維生素A的前體物質(zhì)，當各種損傷因素作用于肝組織后，肝星狀細胞(HSC)激活，活化后的HSC貯存維生素A的能力減低，含維生素A脂滴逐漸減少甚至消失，細胞形態(tài)向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化。劉恒興等[15]研究表明β-胡蘿卜素可抑制肝纖維化過程中膠原合成、HSC活化及肝星狀細胞內(nèi)脂滴丟失。本研究中，代表β-胡蘿卜素的1 006 cm-1處峰值隨著肝纖維化程度進展而逐漸降低，說明肝纖維化組織內(nèi)β-胡蘿卜素含量逐漸減少，隨肝纖維化進展，β-胡蘿卜素對肝組織的保護作用逐漸減弱。

肝細胞脂肪變性是指肝細胞的胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大小不等的游離脂肪滴，是常見的肝臟病理改變之一，普遍存在于各種慢性肝臟損害性疾病。有文獻報道，肝硬化患者發(fā)生肝細胞脂肪變性的比例高達30.7%[16]。目前肝細胞脂肪變性的發(fā)生機制尚未完全明確[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，在代表脂類物質(zhì)的1 268 cm-1、1 305 cm-1、1 442 cm-1譜帶處，S0期大鼠的拉曼光譜峰值最弱，S2期大鼠的拉曼光譜峰值最強，表明S2期大鼠肝組織內(nèi)脂類相關物質(zhì)含量最高，間接說明在S0期正常肝組織向S4期肝硬化轉(zhuǎn)變的過程中，S2期大鼠肝組織內(nèi)肝細胞脂肪變性最明顯。但本實驗結果未能揭示大鼠肝纖維化過程中肝細胞脂肪變性的發(fā)生機制及肝細胞脂肪變性在各分期間的演變過程。對于肝纖維化過程中肝細胞脂肪變的發(fā)展規(guī)律及具體機制還有待尋找更完善的模型進行深入分析。

在代表醌類物質(zhì)的1 595 cm-1譜帶處，S0期大鼠肝組織譜峰最強，S1期譜峰最弱。肝臟代謝產(chǎn)物中涉及一系列醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)是含有共軛環(huán)已二烯二酮結構的一類化合物，包括苯醌、萘醌、蒽醌及其諸多衍生物，其中萘醌類物質(zhì)在控制凝血方面有重要作用，萘醌中的β-甲基萘醌即為維生素K的前體物質(zhì)。正常情況下，這些物質(zhì)儲存在肝臟中，負責合成維生素K依賴的相關物質(zhì)。當肝脂肪變性或肝硬化時，肝臟產(chǎn)生這些物質(zhì)的能力明顯減低，凝血因子合成減少，從而導致凝血功能障礙[18,19]。本研究發(fā)現(xiàn)，這些物質(zhì)在S0期向S1期病變肝組織轉(zhuǎn)變的過程中下降最明顯，S2期較S1期增加，S3、S4期逐漸下降。由此可見，代表醌類物質(zhì)的1 595 cm-1處譜峰可作為S0期向S1期過渡的重要標志，醌類物質(zhì)可能是肝纖維化過程中最早發(fā)生明顯變化的物質(zhì)，有望為肝纖維化的早期診斷提供重要依據(jù)[18]。

總之，拉曼光譜檢查不僅有助于區(qū)分正常肝組織與纖維化肝組織，還可體現(xiàn)肝纖維化各分期間的差別。不同分期肝纖維化大鼠近紅外線激光拉曼光譜檢查結果存在差異,拉曼光譜檢查有助于肝纖維化的早期發(fā)現(xiàn)及分期評估。

[1] Bedossa P, Poynard T. An algorithm for the grading of activity in chronic hepatitis C. The METAVIR Cooperative Study Group[J]. Hepatology,1996,24(2):289-293.

[2] 陳宵瑜,楊長青.肝纖維化發(fā)生機制研究新進展[J].實用肝臟病雜志,2016,19(1):121-124.

[3] 陳穎,傅念,陽學風,等.自噬在肝纖維化中作用的研究進展[J].廣東醫(yī)學,2015,36(20):3244-3246.

[4] Prakash R, John P. Reversibility of liver fibrosis[J]. Ann Hepatol,2009,8(4):283-291.

[5] Detlef S, Nezam H. Liver cirrhosis[J]. Lancet, 2008,371(9615):838-851.

[6] 王虹,張少鴻.血清激光拉曼光譜鑒別肺癌、慢性阻塞性肺疾病患者及健康人的價值[J].廣東醫(yī)學,2015,36(6):884-887.

[7] Daniel A, Prakasarao A, Dornadula K, et al. Polarized Raman spectroscopy unravels the biomolecular structural changes in cervical cancer[J]. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc, 2016,152:58-63.

[8] Kast RE, Serhatkulu GK, Cao A, et al. Raman spectroscopy can differentiate malignant tumors from normal breast tissue and detect early neoplastic changes in a mouse model[J]. Biopolymers, 2008,89(3):235-241.

[9] Ellis DI, Cowcher DP, Ashton L, et al. Illuminating disease and enlightening biomedicine: Raman spectroscopy as a diagnostic tool[J]. Analyst, 2013,138(14):3871-3884.

[10] Zhao J, Lui H, Kalia S, et al. Real-time Raman spectroscopy for automatic in vivo skin cancer detection: an independent validation[J]. Anal Bioanal Chem, 2015,407(27):8373-8379.

[11] Lyng FM, Traynor D, Ramos IR, et al. Raman spectroscopy for screening and diagnosis of cervical cancer[J]. Anal Bioanal Chem, 2015,407(27):8279-8289.

[12] Abd El-Hakam R, Khalil S, Mahani R, et al. Dielectric and FT-Raman spectroscopic approach to molecular identification of breast tumor tissues[J]. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc, 2015,151:208-212.

[13] 施穎等,劉赟鵬,許鴻志,等.拉曼光譜學與消化道腫瘤內(nèi)鏡早期診斷[J].中華消化內(nèi)鏡雜志,2014,31(2):118-120.

[14] Buist AS, Mcburnie MA, Vollmer WM, et al. International variation in the prevalence of COPD ( the BOLD Study): a population -based prevalence study[J]. Lancet, 2007,370(9589):741-750.

[15] 劉恒興,邵峰,王環(huán)震,等,β-胡蘿卜素對肝纖維化大鼠肝組織α-平滑肌肌動蛋白和轉(zhuǎn)化生長因子-β1表達的影響[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學院學報,2008,25(1):5-9.

[16] 年媛媛,潘雯,張軍,等,675例肝臟穿刺活檢的肝細胞脂肪變性分析[J].胃腸病學和肝病學雜志,2014,23(8):907-909.

[17] 施軍平,范建高.肝細胞脂肪變與乙型肝炎相關性研究進展[J].國際消化病雜志,2008,28(2):100-102,105．

[18] Gaggini MCR, Navarro RS, Stefanini AR, et al. Correlation between METAVIR scores and Raman spectroscopy in liver lesions induced by hepatitis C virus: a preliminary study[J]. Lasers Med Sci, 2015,30(4):1347-1355.

[19] Meyer AV, Green M, Pautler HM, et al. Impact of vitamin Kadministration on INR changes and bleeding events among patients with cirrhosis[J]. Ann Pharmacother, 2016,50(2):113-117.

廣東省自然科學基金資助項目(2015A030313269)。

全顯躍(E-mail: quanxianyue@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.15.009

R575.2

A

1002-266X(2017)15-0034-03

2016-10-08)