李雙，李雙雙，張曉瑩，郭春燕，王治寶

(河北北方學(xué)院，河北張家口075000)

帕金森病細(xì)胞模型的構(gòu)建及氨基酸表達(dá)觀察

李雙，李雙雙，張曉瑩，郭春燕，王治寶

(河北北方學(xué)院，河北張家口075000)

目的 建立帕金森病(PD)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞模型，并篩選PD細(xì)胞中的氨基酸標(biāo)志物。方法 將人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y分為正常組、溶媒組、魚(yú)藤酮組。魚(yú)藤酮組分別加入0.15、0.25 μmol/L的魚(yú)藤酮，溶媒組加入二甲基亞砜(DMSO)，正常組不加藥物。分別于給藥24、48 h后采用MTT法測(cè)算細(xì)胞存活率，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，選擇對(duì)細(xì)胞存活、形態(tài)影響較小的魚(yú)藤酮作用濃度及作用時(shí)間(0.15 μmol/L、24 h)，采用Western blotting法檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞中的α-突觸核蛋白以驗(yàn)證PD模型。采用高效液相色譜法檢測(cè)PD細(xì)胞中的谷氨酸(Glu)、絲氨酸(Ser)、谷氨酰胺(Gln)、組氨酸(His)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(Phe)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、賴氨酸(Lys)，對(duì)魚(yú)藤酮組和溶媒組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的氨基酸進(jìn)入偏最小二乘判別分析，選擇P<0.05且變量重要性投影值(VIP)>1的氨基酸為PD的標(biāo)志物。結(jié)果 魚(yú)藤酮組細(xì)胞中α-突觸核蛋白相對(duì)表達(dá)量高于溶媒組(P均<0.05)，表明SH-SY5Y細(xì)胞PD模型制作成功。給藥24 h時(shí)，魚(yú)藤酮組細(xì)胞中Glu、Ser、Gln、His、Gly、Pro、Phe、Ile、Leu、Lys水平低于溶媒組(P均<0.05)；給藥48 h時(shí)，魚(yú)藤酮組除Gln外，其余11種氨基酸水平均低于溶媒組(P均<0.05)。篩選氨基酸標(biāo)志物為Glu、Ser、Gly、Pro(給藥24 h時(shí)VIP值分別為1.016、1.016、1.016、1.009,給藥48 h時(shí)VIP值均為1.001)。結(jié)論 利用魚(yú)藤酮誘導(dǎo)成功建立了PD細(xì)胞模型，篩選出Glu、Ser、Gly、Pro可能為PD的潛在標(biāo)志物。

帕金森??；魚(yú)藤酮；人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞；氨基酸

帕金森病(PD)是最常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病之一，嚴(yán)重威脅人類健康和生活質(zhì)量[1～3]。大量研究表明經(jīng)常接觸工農(nóng)業(yè)毒性物質(zhì)的人群患PD的風(fēng)險(xiǎn)較大。魚(yú)藤酮是一種廣泛使用的天然殺蟲(chóng)劑，研究[4，5]證實(shí)與其接觸可引起PD。α-突觸核蛋白的聚集與PD發(fā)病和相關(guān)功能障礙密切相關(guān)[6，7]。目前PD初期有少量對(duì)癥治療方法，但尚無(wú)病因治療方法，中后期PD的治療方法仍在探尋中[8，9]。故PD的早期診斷對(duì)有效治療和提高患者生活質(zhì)量有重要意義。已有文獻(xiàn)[9～12]報(bào)道了興奮性氨基酸變化在PD發(fā)病過(guò)程可能發(fā)揮作用。已知與神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能發(fā)揮重要作用的必需氨基酸有賴氨酸(Lys，K)、色氨酸(Trp，W)、苯丙氨酸(Phe，F(xiàn))、異亮氨酸(Ile，I)、亮氨酸(Leu，L)，非必需氨基酸有組氨酸(His，H)、谷氨酸(Glu，E)、絲氨酸(Ser，S)、谷氨酰胺(Gln，Q)、甘氨酸(Gly，G)、丙氨酸(Ala，A)、脯氨酸(Pro，P)[13～17]，而在PD的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中上述氨基酸發(fā)生了怎樣的變化，能否作為PD診斷的潛在標(biāo)志物仍有待研究。為此，我們采用魚(yú)藤酮誘導(dǎo)建立了PD人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞模型，觀察PD模型中上述12種氨基酸的代謝變化，以篩選有望作為PD標(biāo)志物的氨基酸，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SH-SY5Y購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。DMEM/F-12培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液干粉(PBS固體)、0.25%胰蛋白酶溶液、胎牛血清(FBS)、噻唑藍(lán)(MTT)、魚(yú)藤酮、兔抗α-突觸核蛋白、色譜純甲醇、乙腈。Glu、Ser、Gln、His,、Gly、Ala、Pro、Trp、Phe、Ile、Leu、Lys標(biāo)準(zhǔn)品純度均>98%。2,4-二硝基氟苯(DNFB)、碳酸氫鈉、無(wú)水乙酸鈉，生理鹽水。CO2細(xì)胞培養(yǎng)孵箱，分析天平，sigma3K30超速離心機(jī)，HH-4恒溫水浴箱，SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)，WH-2旋渦振蕩器，ECLIPSE Ti-U倒置熒光顯微鏡，XDS-1B光學(xué)顯微鏡，美國(guó)waters e2695高效液相色譜儀，自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱及色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，waters2998二極管陣列檢測(cè)器。

1.2 PD細(xì)胞模型的建立 SH-SY5Y細(xì)胞在含10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)液中，于37 ℃飽和濕度、5% CO2條件下培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為正常組、溶媒組、魚(yú)藤酮組。消化細(xì)胞配制成密度為6×104/mL的細(xì)胞懸液，種于96孔板，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，每組6個(gè)復(fù)孔，當(dāng)細(xì)胞貼壁、匯合度達(dá)70%～80%時(shí)，魚(yú)藤酮組分別加入終濃度為0.15、0.25 μmol/L的魚(yú)藤酮；溶媒組加入終濃度為0.012 5%的DMSO，正常組不加藥物。分別于給藥24、48 h后采用MTT法測(cè)算細(xì)胞存活率，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。給藥24、48 h魚(yú)藤酮組細(xì)胞存活率低于正常組和溶媒組，且魚(yú)藤酮0.25 μmol/L亞組細(xì)胞存活率低于0.15 μmol/L亞組(P均<0.05)；給藥48 h魚(yú)藤酮組細(xì)胞存活率低于給藥24 h時(shí)(P均<0.05)。正常組與溶媒組細(xì)胞形態(tài)無(wú)顯著性變化，魚(yú)藤酮組與溶媒組相比，細(xì)胞皺縮、變圓，體積變小，排列松散；其中0.25 μmol/L亞組較0.15 μmol/L亞組存活細(xì)胞數(shù)量更少，大多數(shù)細(xì)胞漂浮(見(jiàn)圖1)。選擇對(duì)細(xì)胞存活、形態(tài)影響較小的魚(yú)藤酮作用濃度0.15 μmol/L、作用時(shí)間24 h。采用Western blotting法檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞中的α-突觸核蛋白驗(yàn)證PD模型制作情況。α-突觸核蛋白表達(dá)顯著升高判定為模型制作成功。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白光密度值/內(nèi)參蛋白光密度值。

1.3 PD模型細(xì)胞中氨基酸標(biāo)志物的篩選

1.3.1 PD細(xì)胞中氨基酸檢測(cè) 采用高效液相色譜法。①氨基酸的衍生化：參照文獻(xiàn)[18]方法，采用DNFB柱前衍生化法進(jìn)行細(xì)胞中氨基酸衍生化。②液相色譜條件：色譜柱為Thermo BDS Hypersil(5 μm，4.6 mm×250 mm)，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm，體積流量1 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流動(dòng)相為甲醇-水(0.1 mol/L乙酸鈉)；梯度洗脫條件為15%甲醇0～10 min，15%～42%甲醇10～15 min，42%～51%甲醇15～18 min，65%甲醇18～26 min，維持5 min。③線性范圍的考察：配制12種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，以氨基酸峰面積(Y)對(duì)濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得到12種氨基酸的回歸方程。④系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)：在上述色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品混合物，計(jì)算氨基酸峰面積的日內(nèi)精密度；連續(xù)進(jìn)樣5 d，計(jì)算日間精密度；取已知含量的樣品，分別加入高、中、低三個(gè)濃度的氨基酸對(duì)照品儲(chǔ)備液，每個(gè)濃度平行3份，測(cè)定峰面積，代入回歸方程，計(jì)算氨基酸含量和各種氨基酸的回收率。樣品含量測(cè)定：分別于適宜濃度的魚(yú)藤酮作用細(xì)胞24、48 h后收集細(xì)胞，DNFB柱前衍生化，在上述色譜條件下進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖，將峰面積帶入回歸方程計(jì)算細(xì)胞內(nèi)氨基酸水平，并與溶媒組進(jìn)行比較。

注：A、B、C、D分別為給藥24 h正常組、溶媒組、魚(yú)藤酮0.15 μmol/L亞組、魚(yú)藤酮0.25 μmol/L亞組細(xì)胞形態(tài)；E、F、G、H分別為給藥48 h正常組、溶媒組、魚(yú)藤酮0.15 μmol/L亞組、魚(yú)藤酮0.25 μmol/L亞組細(xì)胞形態(tài)。

1.3.2 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS18.0軟件。組間比較采用單因素方差分析。對(duì)魚(yú)藤酮組和溶媒組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的氨基酸再應(yīng)用SIMCA-P+11軟件進(jìn)行偏最小二乘分析法(PLS-DA)分析，以P<0.05且變量重要性投影值(VIP)>1判定為PD模型的氨基酸標(biāo)志物。

2 結(jié)果

2.1 PD細(xì)胞模型建立情況 溶媒組和魚(yú)藤酮組細(xì)胞中α-突觸核蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.23和0.47，魚(yú)藤酮組細(xì)胞中α-突觸核蛋白相對(duì)表達(dá)量高于溶媒組(P均<0.05)，表明SH-SY5Y細(xì)胞PD模型制作成功。

2.2 PD細(xì)胞模型中氨基酸標(biāo)志物的篩選結(jié)果 Glu、Ser、Gln、His、Gly、Ala、Pro、Trp、Phe、Ile、Leu、Lys回歸方程分別為y=3.98x+9.32、y=6.26x+8.06、y=4.87x+8.38、y=4.66x+1.79、y=12.17x+4.59、y=7.14x+21.03、y=9.50x+3.98、y=13.90x+3.21、y=6.28x+3.01、y=6.47x+4.65、y=6.04x+4.94、y=6.98x+6.45，相關(guān)系數(shù)r>0.988 7，所試濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。12種氨基酸日內(nèi)、日間精密度良好，RSD均小于2.5%。在實(shí)驗(yàn)色譜條件下各氨基酸分離良好(圖2)。12種氨基酸的平均回收率在90%～105%，RSD<3.6%，方法回收率良好。給藥24 h時(shí)，魚(yú)藤酮組10種氨基酸(Glu、Ser、Gln、His、Gly、Pro、Phe、Ile、Leu、Lys)水平低于溶媒組(P均<0.05)；給藥48 h時(shí)，除Gln外，其余11種氨基酸水平均低于溶媒組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。應(yīng)用SIMCA-P+11軟件分析得出氨基酸得分圖與載荷圖(圖3)，選取遠(yuǎn)離原點(diǎn)且VIP>1的氨基酸為標(biāo)志物，分別為Glu、Ser、Gly、Pro(給藥24 h時(shí)VIP值分別為1.016、1.016、1.016、1.009，給藥48 h時(shí)VIP值均為1.001)。

注：A為標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖；B為細(xì)胞中氨基酸色譜圖；C為衍生試劑及衍生化副產(chǎn)物色譜圖。

3 討論

魚(yú)藤酮具有極強(qiáng)的親脂性，能透過(guò)血腦屏障和細(xì)胞膜，魚(yú)藤酮模型不僅能復(fù)制PD的行為學(xué)改變，而且能再現(xiàn)人類PD的病理學(xué)特征。人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y具有神經(jīng)突樣的細(xì)胞質(zhì)突起，可以表達(dá)多巴胺-β 羥化酶、α-突觸核蛋白，被廣泛用于PD模型的建立。所以，我們選擇魚(yú)藤酮作用于SH-SY5Y細(xì)胞誘導(dǎo)PD模型。目前PD確切的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，公認(rèn)的臨床病理特征有黑質(zhì)紋狀體多巴胺功能障礙、紋狀體α-突觸核蛋白聚集。本研究結(jié)果顯示，魚(yú)藤酮可使SH-SY5Y細(xì)胞存活率下降、細(xì)胞固縮、α-突觸核蛋白表達(dá)增高，且作用呈濃度、時(shí)間依賴性，選擇對(duì)細(xì)胞存活、形態(tài)影響較小的魚(yú)藤酮作用濃度0.15 μmol/L、作用時(shí)間24 h，魚(yú)藤酮組細(xì)胞中α-突觸核蛋白相對(duì)表達(dá)量高于溶媒組，成功建立了SH-SY5Y細(xì)胞PD模型。

表1 魚(yú)藤酮組與溶媒組細(xì)胞中12種氨基酸水平比較

注：與相同給藥時(shí)間溶媒組相比，▲P<0.01。

注：A、C為得分圖；B、D為載荷圖；得分圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣本；從圖A、C可見(jiàn)，溶媒組和魚(yú)藤酮組區(qū)分明顯，說(shuō)明魚(yú)藤酮作用細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)氨基酸的表達(dá)有了較明顯的變化；在載荷圖B、D中，每點(diǎn)代表一個(gè)氨基酸變量，離原點(diǎn)距離較遠(yuǎn)的點(diǎn)可能為標(biāo)志物，進(jìn)一步通過(guò)VIP值確定為標(biāo)志物。

氨基酸是細(xì)胞中蛋白合成的生物底物，氨基酸的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝對(duì)生物體生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。神經(jīng)系統(tǒng)中存在著大量的游離氨基酸，參與神經(jīng)系統(tǒng)的代謝、神經(jīng)興奮及抑制調(diào)節(jié)[19]。其中，Glu和Gly是重要的氨基酸遞質(zhì)[13]；Glu、Gln、Gly、Ala、Ser、His、Trp在谷氨酰胺合成酶反饋抑制系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用；谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)是星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元代謝耦聯(lián)最重要的途徑之一[14]；Gly、Ser、His、Trp代謝是一碳單位的重要來(lái)源；Leu及其異構(gòu)體Ile是最重要的支鏈氨基酸；Pro、Phe、Lys在細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[15]。Lys對(duì)人中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)均起重要作用，在mTORC1信號(hào)通路中也發(fā)揮重要作用[16]。基于上述理論，我們選取了12種氨基酸作為待測(cè)指標(biāo)。

代謝組學(xué)主要考察生物體系受擾動(dòng)或損傷后內(nèi)源性代謝物的變化[20，21]，統(tǒng)計(jì)分析方法包括主成分分析、聚類分析、顯著性分析和PLS-DA[22]。PLS-DA是一種多因變量對(duì)多自變量的回歸建模方法，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)多元線性回歸、主成分分析及兩組變量間的典型相關(guān)分析，是代謝組學(xué)中最常規(guī)的方法。我們首先對(duì)魚(yú)藤酮組和溶媒組細(xì)胞中12種氨基酸水平進(jìn)行比較，對(duì)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的氨基酸進(jìn)行PLS-DA，以VIP>1為依據(jù)[23]，篩選出4種氨基酸生物標(biāo)志物(Glu、Ser、Gly、Pro)。

Glu是主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，以往研究[24]發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激性抑郁發(fā)生時(shí)Glu水平顯著升高。Glu的聚集具有神經(jīng)毒性[25]，是神經(jīng)性疾病發(fā)生的誘因之一。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PD細(xì)胞中Glu水平顯著下降，由此可認(rèn)為Glu水平變化并不是誘發(fā)PD的原因，而是PD發(fā)生后機(jī)體細(xì)胞做出應(yīng)激的結(jié)果，提示Glu可作為評(píng)估PD進(jìn)程的氨基酸標(biāo)志物[26]。除Glu聚集會(huì)誘發(fā)神經(jīng)毒性外，未見(jiàn)其他氨基酸神經(jīng)毒性的報(bào)道，可認(rèn)為PD體外細(xì)胞模型內(nèi)其他氨基酸水平變化也是疾病發(fā)生后引起的機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)所致。Ser是N-甲基-D天冬氨酸發(fā)揮其神經(jīng)傳遞作用的激動(dòng)劑，Gly可抑制神經(jīng)細(xì)胞過(guò)度興奮[27，28]，Pro的初級(jí)代謝為氧化應(yīng)激反應(yīng)必不可少的過(guò)程[29，30]，這三種氨基酸會(huì)隨著細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的增強(qiáng)而代謝加速[31]。另外Glu、Ser、Gly同為谷氨酰胺合成酶反饋抑制系統(tǒng)的關(guān)鍵氨基酸，均可在一定情況下參與Gln的轉(zhuǎn)化。在PD細(xì)胞中，為防止興奮性氨基酸Glu的聚集造成進(jìn)一步神經(jīng)損傷，Glu轉(zhuǎn)化為Gln的速度加快，同時(shí)帶動(dòng)此反饋抑制系統(tǒng)中的Ser、Gly代謝轉(zhuǎn)化加快，致使Gln水平隨著損傷加重下降程度降低，甚至超過(guò)正常水平。

總之，魚(yú)藤酮可引起SH-SY5Y細(xì)胞損傷，誘導(dǎo)PD模型；利用PLS-DA技術(shù)篩選得到Glu、Ser、Gly、Pro為PD的潛在標(biāo)志物。本研究結(jié)果為PD的早期診斷提供了新思路和新方法。

[1] 尹雪,蘇新云,王秀華,等.原兒茶酸對(duì)帕金森病模型小鼠中腦和紋狀體D2DR、iNOS和TH表達(dá)的影響[J].中草藥,2015,46(6):866-870.

[2] 胡雅瓊,羅理勇,曾亮.茶葉提取物對(duì)帕金森病的防治作用研究進(jìn)展[J].中草藥,2014,45(9):1342-1348.

[3] Chorfa A, Temps D, Morignat E, et al. Specific pesticide-dependent increases inα-synuclein levels in human neuroblastoma (SH-SY5Y) and melanoma(SK-MEL-2) cell lines[J]. Toxicol Sci, 2013,133(2):289-297.

[4] Klingelhoefer L, Reichmann H. Pathogenesis of Parkinson disease--the gut-brainaxis and environmental factors[J]. Nat Rev Neurol, 2015,11(11):625-636.

[5] Sequra-Aquilar J, Kostrzewa RM. Neurotoxin mechanisms and processes relevantto Parkinson′s disease: an update[J]. Neurotox Res, 2015,27(3):328-354.

[6] 白瑩,徐斌.利用誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞技術(shù)研究環(huán)境致病因素誘導(dǎo)帕金森病發(fā)病的進(jìn)展[J].環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué),2015,32(2):181-185.

[7] 柴星星,鮑波,葉成,等.魚(yú)藤酮誘導(dǎo)制備SD大鼠帕金森病模型的可行性[J].山東醫(yī)藥,2015,55(1):9-14.

[8] Corbillé AG, Letournel F, Kordower JH, et al. Evaluation of alpha-synuclein Immuno-histochemical methods for the detection of Lewy-type synucleinopathy in gastrointestinal biopsies[J]. Acta Neuropathol Commun, 2016,4(1):35-41.

[9] Wenzel S, Mollenhauer B, Trenkwalder C. Diagnosis and clinical therapy for Parkinson′s disease[J]. Nervenarzt, 2006,77(12):1439-1443.

[10] Meredith GE, Totterdell S, Beales M, et al. Impaired glutamate homeostasis and programmed cell death in a chronic MPTP mouse model of Parkinson′s disease[J]. Exp Neuro, 2009,219(1):334-340.

[11] Assous M, Had-Aissouni L, Gubellini P, et al. Progressive Parkinsonism by acute dysfunction of excitatory amino acid transporters in the rat substantia nigra[J]. Neurobio Dis, 2014,65(1):69-81.

[12] 羅瑞靜,何建成.興奮性氨基酸與帕金森病研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2010,39(10):13-15.

[13] 王軍玲,楊陽(yáng),高健,等.基于氨基酸代謝的抗腦缺血益氣解毒配伍中藥協(xié)同作用研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2014,30(5):725-731.

[14] Xia T, Zhang Q, Xiao Y, et al. CREB/TRH pathway in the central nervous system regulates energy expenditure in response to deprivation of an essential amino acid[J]. Int J Obes (Lond), 2015,39(1):105-113.

[15] 楊曉運(yùn),李智,秦綠葉,等.星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元之間谷氨酸-谷氨酰胺的代謝偶聯(lián)[J].生理科學(xué)進(jìn)展,2003,34(4):350-352.

[16] Phang JM, Liu W, Hancock CN, et al. Proline metabolism and cancer: emerginglinks to glutamine and collagen[J]. Curr Opin Clin Nutr Metab Care, 2015,18(1):71-77.

[17] Wolfson RL, Chantranupong L, Saxton RA, et al. Sestrin2 is a leucine sensor for the mTORC1 pathway[J]. Science, 2016,351(6268):43-48.

[18] 李雙,王小琴,郭春燕,等.低濃度DMSO對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率和氨基酸代謝的影響[J].神經(jīng)藥理學(xué)報(bào),2015,5(4):9-13.

[19] Maynard TM, Manzini MC. Balancing Act: Maintaining Amino Acid Levels in the Autistic Brain[J]. Neuron, 2017,93(3):476-479.

[20] 李鞠,唐鳳英.原發(fā)性腎病綜合征患者血清異常代謝通路的代謝組學(xué)分析[J].山東醫(yī)藥,2016,56(30):1-4.

[21] 王風(fēng)萍,郭春燕.代謝組學(xué)及其研究新進(jìn)展[J].神經(jīng)藥理學(xué)報(bào),2012,2(6):49-55.

[22] Zheng P, Chen JJ, Zhou CJ, et al. Identification of sex-specific urinary biomarkers for major depressive disorder by combined application of NMR- and GC-MS-based metabonomics[J]. Transl Psychiatry, 2016,6(11):e955.

[23] 吳宏偉,高健,李韶菁,等.基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的氨基酸代謝組學(xué)方法研究黃芪注射液治療腦缺血[J].分析化學(xué),2013,41(3):344-348.

[24] Da Silva LB, Poulsen JN, Arendt-nielsen L, et al. Botulinum neurotoxin type A modulates vesicular release of glutamate from satellite glial cells[J]. J Cell Mol Med, 2015,19(8):1900-1909.

[25] 吳帥,安書成,陳慧彬,等.慢性應(yīng)激性抑郁發(fā)生中大鼠眶額葉多巴胺D1受體對(duì)谷氨酸及其NMDA受體的調(diào)節(jié)[J].心理學(xué)報(bào),2014,46(1):69-78.

[26] 吳倩,汪寧,王艷,等.藁本內(nèi)酯對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2015,50(2):162-168.

[27] Fossat P, Turpin FR, Sacchi S, et al. Glial D-Serine Gates NMDA Receptors at Excitatory Synapses in Prefrontal Cortex[J]. Cereb Cortex, 2012,22(3):595-606.

[28] 何文娟,阮懷珍.D-絲氨酸在神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞間通訊的新進(jìn)展[J].生理科學(xué)進(jìn)展,2009,40(4):303-307.

[29] Maguire EP, Mitchell EA, Greig SJ, et al. Extrasynaptic Glycine Receptors of Rodent Dorsal Raphe Serotonergic Neurons:A Sensitive Target for Ethanol[J]. Neuropsychopharmacology, 2014,39(5):1232-1244.

[30] Lu Y, Dong H, Gao Y, et al. A feed-forward spinal cord glycinergic neural circuit gates mechanical allodynia[J]. J Clin Invest, 2013,123(9):4050-4062.

[31] Wyse AT, Netto CA. Behavioral and neurochemical effects of proline [J]. Metab Brain Dis, 2011,26(3):159-172.

Construction of Parkinson 's disease cell model and observation of amino acid expression

LIShuang,LIShuangshuang,ZHANGXiaoying,GUOChunyan,WANGZhibao

(HebeiNorthUniversity,Zhangjiakou075000,China)

Objective To establish the human neuroblastoma cell model with Parkinson's disease (PD), and screen out the amino acid biomarkers in PD cells. Methods Human neuroblastoma SH-SY5Y cells were divided into the normal group, solvent group and rotenone group. Cells in the rotenone group were given 0.15, 0.25 μmol/L rotenone, cells in the solvent group were given dimethyl sulfoxide (DMSO), and the normal group was not added with any drug. Cell viability was assessed by MTT assay at 24, 48 h after medication, and inverted microscope was used to observe the cell morphology. Then we determined the concentration (0.15 μmol/L) and treatment time (24 h) of rotenone which had the little effect according to the changes of cell viability and cell morphology. The expression of α-synuclein was detected by Western blot to validate the success of PD model. And 12 kinds of amino acids, including glutamic acid (Glu), serine (Ser), glutamine (Gln), histidine (His), glycine (Gly), alanine (Ala), proline (Pro), tryptophan (Trp ), phenylalanine (Phe), isoleucine (Ile), leucine (Leu), and lysine (Lys), in PD cells were determined by high performance liquid chromatography, and we analyzed the significant changed amino acids between solvent group and rotenone group with partial least squares discriminant analysis (PLS-DA). Amino acid biomarkers in the PD model were determined with a variable importance in the projection (VIP) value greater than 1 and a P value less than 0.05. Results The expression of α-synuclein in the cells of the rotenone group was significantly higher than that of the solvent group (P<0.05), indicating the successful construction of SH-SY5Y cell model with PD. At 24 h, the Glu, Ser, Gln, His, Gly, Pro, Phe, Ile, Leu, Lys levels in the rotenone group were lower than those in the solvent group (allP<0.05). At 48 h, the levels of 11 kinds of amino acid except Gln in the rotenone group were lower than those in the solvent group (allP<0.05). Glu, Ser, Gly, Pro were screened out as the amino acid biomarkers (At 24 h, VIP values were 1.016, 1.016, 1.016, 1.009; at 48 h, all VIP values were 1.001). Conclusion The PD cell model is successfully established by rotenone induction and Glu, Ser, Gly, and Pro may be the potential diagnostic biomarkers for PD.

Parkinson's disease; rotenone; human neuroblastoma cells; amino acid

河北省教育廳重大項(xiàng)目(ZD2014075)；河北北方學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目。

李雙(1994-)，女，本科，主要研究方向?yàn)樗幬镏苿?。E-mail: 1037881424@qq.com

郭春燕(1968-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)樯窠?jīng)藥理學(xué)、藥物分析。E-mail: guochy0311@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.15.006

R742.5

A

1002-266X(2017)15-0021-05

2016-12-17)