林中原，李音音，石祥，李文朝，莫麗軍，黎小紅，莫武寧

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

CYFIP1過表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞株CNE2增殖、遷移能力觀察

林中原，李音音，石祥，李文朝，莫麗軍，黎小紅，莫武寧

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

目的 觀察胞質(zhì)FMRP相互作用蛋白1(CYFIP1)過表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞株CNE2增殖、遷移能力變化。方法 將含CYFIP1基因片段和空載片段的慢病毒轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞株CNE2，分別作為實(shí)驗(yàn)組和空載組；以不進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作的CNE2細(xì)胞為對照組。分別于培養(yǎng)24、48、72、96 h采用MTT實(shí)驗(yàn)觀察各組細(xì)胞增殖情況(以O(shè)D值表示)。進(jìn)行細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)，待平板中出現(xiàn)肉眼可見克隆時(shí)，終止培養(yǎng)并計(jì)算克隆形成數(shù)。分別采用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移能力，測量細(xì)胞遷移距離，記錄穿膜細(xì)胞數(shù)。結(jié)果 三組不同培養(yǎng)時(shí)間OD值相比，P均>0.05。實(shí)驗(yàn)組、空載組和對照組克隆形成數(shù)分別為(414±29)、(426±30)、(381±59)個(gè)，三組相比，P均>0.05。實(shí)驗(yàn)組、空載組、對照組細(xì)胞相對遷移距離分別為(6.71±0.10)、(9.82±0.12)、(9.98±0.10)mm，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移距離小于空載組和對照組(P均<0.05)。實(shí)驗(yàn)組、空載組、對照組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(37.33±1.53)、(62.67±5.03)、(62.13±4.36)個(gè)，實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)少于空載組和對照組(P均<0.05)。結(jié)論 CYFIP1過表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞株CNE2遷移能力受到抑制。CYFIP1表達(dá)異?？赡芘c鼻咽癌的浸潤、發(fā)展有關(guān)。

鼻咽癌；鼻咽癌細(xì)胞；胞質(zhì)FMRP相互作用蛋白1；細(xì)胞增殖；細(xì)胞遷移

鼻咽癌在我國的發(fā)病率和病死率均較高[1]，鼻咽癌好發(fā)于咽隱窩，早期可出現(xiàn)鼻腔出血、頭痛等癥狀，晚期可出現(xiàn)顱神經(jīng)損害、淋巴結(jié)腫大及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等[2]。鼻咽癌初發(fā)隱匿性高，病情發(fā)展迅速且容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，治療效果有限，5年復(fù)發(fā)率高達(dá)88.3%[3]，但發(fā)病機(jī)制尚未明確。已知鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展與多種因素有關(guān)，包括EB病毒感染、環(huán)境因素和遺傳因素等。抑癌基因可調(diào)節(jié)細(xì)胞正常發(fā)育、生長和分化，在抑制細(xì)胞增殖和細(xì)胞遷移中發(fā)揮重要作用，抑癌基因失活是惡性腫瘤的一大特征[4]。胞質(zhì)FMRP相互作用蛋白1(CYFIP1)被認(rèn)為是候選的抑癌基因。CYFIP1在部分腫瘤如肺癌、乳腺癌、食道癌和卵巢癌等組織中低表達(dá)，然而其表達(dá)變化是否影響鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展尚不清楚。我們前期研究發(fā)現(xiàn)CYFIP1基因在鼻咽癌組織中的表達(dá)水平低于正常鼻咽組織。本研究觀察了CYFIP1過表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞株CNE2增殖、遷移能力變化，探討CYFIP1與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 低分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE2(一種CYFIP1低表達(dá)細(xì)胞株)為廣西醫(yī)科大學(xué)耳鼻喉實(shí)驗(yàn)室獲得。含CYFIP1基因片段和空載片段的慢病毒由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并包裝?？俁NA提取試劑RNAiso Plus reagent、逆轉(zhuǎn)錄試劑PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser reagent和cDNA擴(kuò)增試劑SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ購自日本TaKaRa公司，RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Gibco公司，嘌呤霉素和MTT試劑購于美國Sigma公司，Transwell小室購自美國Corning公司，蛋白提取試劑RIPA lysis buffer、4%多聚甲醛和1%結(jié)晶紫染液購自北京索萊寶公司，BCA蛋白質(zhì)分析試劑購自北京碧云天公司。

1.2 CYFIP1轉(zhuǎn)染與細(xì)胞分組 分別將含CYFIP1基因片段和空載片段的慢病毒轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞株CNE2，熒光顯微鏡下見細(xì)胞中有綠色熒光后用含2 μg/mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選，獲得穩(wěn)定細(xì)胞株CYFIP1-CNE2和empty vector-CNE2，分別作為實(shí)驗(yàn)組和空載組;以不進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作的CNE2細(xì)胞為對照組。三組細(xì)胞使用含10%胎牛血清和1%混合抗生素(青霉素和鏈霉素)的RPMI1640培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和Western blotting法檢測CYFIP1 mRNA及蛋白，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組、空載組和對照組CYFIP1 mRNA相對表達(dá)量分別為3.491±0.169、1.079±0.037、1.000±0.010，CYFIP1蛋白相對表達(dá)量分別為0.326±0.018、0.169±0.013、0.149±0.011，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中CYFIP1 mRNA及蛋白相對表達(dá)量高于空載組、對照組(P均<0.05)。詳見圖1。表明CYFIP1過表達(dá)CNE2細(xì)胞構(gòu)建成功。

圖1 各組細(xì)胞中CYFIP1蛋白電泳結(jié)果

1.3 細(xì)胞增殖能力觀察 ①M(fèi)TT實(shí)驗(yàn)：用0.25%胰蛋白酶消化各組細(xì)胞并重懸，以2×103/孔種到96孔板中；分別于孵育24、48、72、96 h后添加5 mg/mL的MTT 25 μL，37 ℃孵育4 h，加入100 μL二甲基亞砜充分溶解晶體；采用酶標(biāo)儀測量490 nm波長的吸光度值(OD值)。②細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)各組細(xì)胞至對數(shù)生長期，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞并用完全培養(yǎng)基重懸，以500/孔種到6孔板中，在37 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)；每3 d更換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)至平板出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞團(tuán)時(shí)終止細(xì)胞培養(yǎng)，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，1%結(jié)晶紫染色；將細(xì)胞數(shù)大于30個(gè)的細(xì)胞團(tuán)記為一個(gè)克隆，計(jì)算各組克隆數(shù)。

1.4 細(xì)胞遷移能力觀察 ①劃痕實(shí)驗(yàn)：三組細(xì)胞按2×106/孔種在6孔板中，待第2天細(xì)胞貼壁后用黃色吸頭在細(xì)胞中畫線形成劃痕，PBS洗去漂浮細(xì)胞。每孔添加無血清培養(yǎng)基，分別于培養(yǎng)0、48、96 h后用Olympus顯微鏡拍照記錄劃痕區(qū)域的變化，測量周邊細(xì)胞向劃痕區(qū)域中央遷移的距離。②Transwell遷移實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)各組細(xì)胞至對數(shù)生長期并用胰酶消化，將含2×104個(gè)細(xì)胞的無血清細(xì)胞懸液200 μL添加至小室上層，小室下層添加含10%血清的培養(yǎng)基500 μL，48 h后終止細(xì)胞培養(yǎng)，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞后1%結(jié)晶紫染色；輕輕擦去小室上層未穿膜細(xì)胞，在空氣中晾干小室，用Olympus顯微鏡觀察穿膜細(xì)胞并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖能力比較 三組不同培養(yǎng)時(shí)間OD值相比，P均>0.05(見表1)。實(shí)驗(yàn)組、空載組和對照組克隆形成數(shù)分別為(414±29)、(426±30)、(381±59)個(gè)，三組相比，P均>0.05(見圖2)。

表1 各組細(xì)胞增殖能力比較

圖2 各組細(xì)胞克隆情況

2.2 各組細(xì)胞遷移能力比較 實(shí)驗(yàn)組、空載組、對照組在96 h的相對遷移距離為(6.71±0.10)、(9.82±0.12)、(9.98±0.10)mm，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移距離小于空載組和對照組(P均<0.05)。詳見圖3。實(shí)驗(yàn)組、空載組、對照組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(37.33±1.53)、(62.67±5.03)、(62.13±4.36)個(gè)，實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)少于空載組和對照組(P均<0.05)。詳見圖4。

圖3 各組細(xì)胞遷移情況

圖4 各組細(xì)胞Transwell小室穿膜細(xì)胞

3 討論

鼻咽癌發(fā)病具有地理分布特點(diǎn)，多發(fā)于北非和東南亞，尤其在中國南方地區(qū)多發(fā)[5]。鼻咽癌病情發(fā)展迅速，早期非特征性癥狀(如耳鳴、流鼻血等)使該病早期檢出率不高，超過半數(shù)的鼻咽癌患者被確診時(shí)已處于晚期階段，而且10%的患者在初次就診時(shí)就已經(jīng)存在腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。鼻咽癌可轉(zhuǎn)移至多種器官，如脾臟、肝臟、肺和骨組織等[6～8]，極大增加了鼻咽癌的治療難度。有17%～54%的鼻咽癌患者因腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而錯(cuò)失治療良機(jī)[9,10]。目前鼻咽癌的發(fā)病及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚未完全清楚。抑癌基因是正常細(xì)胞生長活動(dòng)的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)丟失或功能受到抑制與惡性腫瘤的發(fā)病密切相關(guān)。研究[11～14]表明，鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展經(jīng)歷p53、NAG7、WWOX等抑癌基因的失活，鼻咽癌細(xì)胞的增殖和遷移可被TESTIN、PTEN等基因抑制。鼻咽癌細(xì)胞的生物學(xué)功能與抑癌基因表達(dá)水平密切相關(guān)。

CYFIP1基因位于染色體15q11.2區(qū)域，參與組成蛋白復(fù)合物CYFIP1-FMRP-eIF4E和CYFIP1-NCKAP1-WAVE1-ABI2[15]。CYFIP1對突觸形態(tài)和功能的維持至關(guān)重要，可抑制mRNA翻譯突觸后蛋白。CYFIP1功能缺陷可能導(dǎo)致突觸功能障礙，引起神經(jīng)系統(tǒng)疾病如智力障礙、自閉癥和精神分裂癥等。CYFIP1作為候選抑癌基因，其在肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌和膀胱癌發(fā)病中的作用都有報(bào)道。Teng等[16]報(bào)道稱CYFIP1可限制WASF3的激活，而WASF3的激活可促進(jìn)乳腺癌和前列腺癌細(xì)胞遷移。Beggs等[17]通過處理eIF4E/CYFIP1復(fù)合體間接發(fā)現(xiàn)舌癌中CYFIP1表達(dá)能抑制細(xì)胞遷移。然而CYFIP1對鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的影響尚未見報(bào)道。我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CYFIP1在鼻咽癌組織中的表達(dá)水平低于正常鼻咽組織，因此，我們猜想鼻咽癌組織中CYFIP1的低表達(dá)和病情發(fā)展存在一定聯(lián)系。本研究觀察了CYFIP1過表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞株CNE2增殖、遷移能力變化，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組、空載組和對照組OD值和克隆形成數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移距離小于空載組和對照組，穿膜細(xì)胞數(shù)少于空載組和對照組，提示CYFIP1可能參與鼻咽癌的發(fā)展，其高表達(dá)可抑制細(xì)胞遷移。

CYFIP1如何影響鼻咽癌細(xì)胞的遷移尚未清楚。CYFIP1是一種eIF4E結(jié)合蛋白。eIF4E與帽狀結(jié)構(gòu)的mRNA之間具有親和力，可通過結(jié)合m7GTP帽端結(jié)構(gòu)5′UTR與mRNA連接，并誘導(dǎo)43S起始前復(fù)合物與mRNA結(jié)合形成活躍的翻譯起始復(fù)合物[18]。CYFIP1作為一種抑制蛋白，與eIF4E結(jié)合后可阻止活化多核糖體的形成，從而抑制細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白表達(dá)[17]。CYFIP1/eIF4E復(fù)合體參與調(diào)控mRNA翻譯的穩(wěn)定性。此外，CYFIP1也參與組成Scar/WAVE復(fù)合體，調(diào)控肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)形成。Scar/WAVE復(fù)合體通常以失活形式存在，可被GTPase Rac1激活，使Scar/WAVE復(fù)合體c端VCA區(qū)域處于開放狀態(tài)，促使Arp2/3復(fù)合體構(gòu)建肌動(dòng)蛋白網(wǎng)。由CYFIP1調(diào)控的肌動(dòng)蛋白組裝異常可導(dǎo)致細(xì)胞支架結(jié)構(gòu)異常，從而影響細(xì)胞之間的穩(wěn)定性[19]。Silva等[20]報(bào)道稱上皮細(xì)胞腫瘤中CYFIP1常見突變類型為雜合性缺失。然而，CYFIP1的失活機(jī)制仍待研究。

綜上所述，CYFIP1過表達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞株CNE2遷移能力受到抑制。CYFIP1表達(dá)異常可能與鼻咽癌的浸潤、發(fā)展有關(guān)。CYFIP1可能成為反映鼻咽癌細(xì)胞遷移能力的新指標(biāo)，具體機(jī)制仍待更進(jìn)一步研究。

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Observation of proliferation and migration in nasopharyngeal carcinoma cells with over-expression of CYFIP1

LINZhongyuan,LIYinyin,SHIXiang,LIWenchao,MOLijun,LIXiaohong,MOWuning

(TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To investigate the changes in the proliferation and migration of nasopharyngeal carcinoma cells with over-expression of cytoplasmic FMRP interacting protein 1 (CYFIP1). Methods A human nasopharyngeal carcinoma cell line (CNE2) was infected with a lentiviral vector containing CYFIP1 or the empty vector, which were used as the experimental group and blank group. The uninfected CNE2 cells acted as the control group. Cell proliferation was evaluated by MTT (represented by OD value) after cell culture for 24, 48, 72 and 96 h, separately. In clone formation assays, the cell culture was terminated when clones in plate could be seen by naked eyes and clones were counted. Cell migration was analyzed by Transwell chamber and Scratch assays. The cell migration distance and the number of penetrating cells were calculated. Results No significant difference was found in the OD value at different cell-culture time among these three groups (P>0.05). The number of clones in the experimental group, blank group and control group were 414±29, 426±30 and 381±59, respectively (P>0.05). The cell migration distance of the experimental group, blank group and control group was (6.71±0.1), (9.82±0.12) and (9.98±0.1) mm, respectively. Compared with the blank group and control group, the experimental group had a shorter migration distance (allP<0.05). The penetrating cells of the experimental group, blank group and control group were 37.33±1.53, 62.67±5.03 and 62.13±4.36. The experimental group had less penetrating cells than those of the blank group and control group (allP<0.05). Conclusions The cell migration of nasopharyngeal carcinoma cell line CNE2 with over-expression of CYFIP1 is inhibited. Abnormal expression of CYFIP1 maybe participates in the invasion and development of nasopharyngeal carcinoma.

nasopharyngeal carcinoma; nasopharyngeal carcinoma cells; cytoplasmic FMRP interacting protein 1; cell proliferation; cell migration

廣西壯族自治區(qū)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014GXNSFAA118228)。

林中原(1989-)，男，碩士研究生在讀，主要研究方向?yàn)楸茄拾┑陌l(fā)病機(jī)制。E-mail: 261608602@qq.com

莫武寧(1963-)，女，教授，主要研究方向?yàn)槟[瘤免疫、分子生物學(xué)。E-mail: mown16300@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.15.005

R739.6

A

1002-266X(2017)15-0017-04

2016-11-18)