封安強，張南征

(1徐州醫(yī)科大學研究生學院，江蘇徐州221002；2徐州醫(yī)科大學附屬淮海醫(yī)院)

生長抑素14肽聯(lián)合5-FU腹腔注射治療人胃癌細胞裸鼠移植瘤的效果及機制

封安強1，張南征2

(1徐州醫(yī)科大學研究生學院，江蘇徐州221002；2徐州醫(yī)科大學附屬淮海醫(yī)院)

目的 觀察生長抑素14肽(SST-14)聯(lián)合5-氟尿嘧啶(5-FU)腹腔注射治療人胃癌細胞BGC-823裸鼠移植瘤的效果，并探討其作用機制。方法 構(gòu)建人胃癌細胞BGC-823裸鼠移植瘤模型28只，隨機分為對照組、5-FU組、SST組、聯(lián)合組各7只。聯(lián)合組聯(lián)合應(yīng)用SST-14和5-FU，其中SST-14 1 mg/kg腹腔注射，用4 d、停3 d；5-FU 20 mg/kg腹腔注射，1次/周。SST組以SST-14 1 mg/kg腹腔注射，用4 d、停3 d。5-FU組用5-FU 20 mg/kg腹腔注射，1次/周。對照組給予同體積無菌生理鹽水。各組連續(xù)用藥21 d。末次用藥24 h后經(jīng)頸椎脫臼處死荷瘤裸鼠，完整剝離腫瘤組織，測量瘤體積，計算抑瘤率。TUNEL法測算移植瘤組織內(nèi)細胞凋亡率。采用免疫組化SP法檢測移植瘤組織中的Bcl-2、Bax蛋白；采用Western blotting法檢測移植瘤組織中的pERK、ERK。結(jié)果 5-FU組、SST組、聯(lián)合組治療后瘤體體積小于對照組，聯(lián)合組瘤體體積小于5-FU組、SST組(P均<0.05);5-FU組、SST組、聯(lián)合組抑瘤率分別為26.24%、25.45%、44.43%。5-FU組、SST組、聯(lián)合組腫瘤組織內(nèi)細胞凋亡率高于對照組，且聯(lián)合組高于5-FU組、SST組(P均<0.05)。與對照組相比，5-FU組、SST組、聯(lián)合組移植瘤組織中Bcl-2蛋白相對表達量、Bcl-2/Bax降低，Bax蛋白相對表達量增高(P均<0.05)；與5-FU組、SST組相比，聯(lián)合組Bcl-2蛋白相對表達量、Bcl-2/Bax降低，Bax蛋白相對表達量增高(P均<0.05)。SST組、聯(lián)合組移植瘤組織中pERK蛋白相對表達量低于對照組(P均<0.05)。結(jié)論 SST-14聯(lián)合5-FU腹腔注射可抑制BGC-823裸鼠移植瘤增長、促進胃癌細胞凋亡，效果優(yōu)于SST-14或5-FU單獨用藥，其機制可能與SST-14下調(diào)胃癌細胞中pERK的表達有關(guān)。

胃癌；胃癌細胞；移植瘤；生長抑素14；5-氟尿嘧啶；細胞凋亡；細胞外信號調(diào)節(jié)激酶

胃癌作為全球最常見的惡性腫瘤，多數(shù)患者首診時已為進展期，失去手術(shù)機會，且化療效果不佳，腫瘤耐藥率高[1，2]。生長抑素(SST)是一種天然的環(huán)形多肽抑制性激素，天然SST主要以生長抑素14肽(SST-14)和生長抑素28肽(SST-28)兩種形式存在[3]。研究[4，5]發(fā)現(xiàn)SST-14單獨應(yīng)用時可有效抑制裸鼠胃癌移植瘤細胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。5-氟尿嘧啶(5-FU)是目前胃癌化療最常用的藥物，但部分患者應(yīng)用5-FU進行多療程化療時出現(xiàn)不同程度耐藥[6]。馮丹等[7]研究發(fā)現(xiàn)，ERK磷酸化可能在胃癌細胞對5-FU的耐藥機制中發(fā)揮重要作用。我們前期研究證實，SST-14、5-FU聯(lián)合應(yīng)用時，對胃癌移植瘤的抑瘤作用明顯優(yōu)于單獨應(yīng)用5-FU組[8]，而SST-14在該過程中是否同時調(diào)節(jié)pERK水平，目前尚未得知。本研究觀察了SST-14聯(lián)合5-FU腹腔注射對胃癌裸鼠移植瘤生長及凋亡的影響，并初步探索其機制，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 人胃腺癌細胞BGC-823(低分化)由徐州醫(yī)科大學腫瘤研究所保存，培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，1～2 d換液1次，3～4 d傳代，待細胞貼壁生長至70%～80%匯合時，用0.05%胰酶消化后傳代培養(yǎng)。Balb/c雄性裸鼠28只，4～6周齡，體質(zhì)量18～22 g，SPF級，購自上海斯萊克實驗動物有限公司[動物合格證號：SCXK(滬)2008-0016]，在徐州醫(yī)學院動物實驗中心SPF屏障系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)。SST-14為默克雪蘭諾公司生產(chǎn)。Bax、Bcl-2多克隆抗體及pERK、ERK、GAPDH兔單克隆抗體購自南京巴傲得生物科技有限公司。SP三步法檢測試劑盒和DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物公司。TUNEL凋亡試劑盒購自瑞士羅氏公司。

1.2 胃癌細胞裸鼠移植瘤模型建立及SST-14用法 取對數(shù)生長期的BGC-823細胞，臺盼藍染色檢測細胞活力≥90%，用PBS制備成1×107/mL的細胞懸液，以0.2 mL/只接種于裸鼠右腋皮下，構(gòu)建胃癌移植瘤裸鼠模型28只。將小鼠在SPF條件下飼養(yǎng)，密切觀察皮下移植瘤生長情況。待接種部位腫瘤長至100～300 mm3時，將荷瘤裸鼠隨機分為聯(lián)合組、SST組、5-FU組和對照組，每組各7只。聯(lián)合組聯(lián)合應(yīng)用SST-14和5-FU，其中SST-14 1 mg/kg腹腔注射，用4 d、停3 d；5-FU 20 mg/kg腹腔注射，1次/周。SST組以SST-14 1 mg/kg腹腔注射，用4 d、停3 d。5-FU組用5-FU 20 mg/kg腹腔注射，1次/周。對照組給予同體積無菌生理鹽水。各組連續(xù)用藥21 d。末次用藥24 h后經(jīng)頸椎脫臼處死荷瘤裸鼠，完整剝離腫瘤組織后分為兩份以備后續(xù)實驗。

1.3 移植瘤體積測量 用藥前及末次用藥24 h后用游標卡尺測量各組移植瘤瘤體的長徑、短徑并計算瘤體體積及抑瘤率：瘤體積=0.52×長徑×短徑2；抑瘤率=(對照組瘤體體積-治療組瘤體體積)/對照組瘤體體積×100%。

1.4 腫瘤細胞凋亡觀察 按照TUNEL試劑盒說明書進行操作，每個腫瘤標本取5張切片，每張切片觀察10個以上高倍視野，鏡下計數(shù)凋亡細胞并計算凋亡率。凋亡細胞鏡下判斷標準：未染色細胞變小，胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，晚期出現(xiàn)凋亡小體，貼壁細胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落；染色細胞呈現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解，染色質(zhì)分割成塊狀/凋亡小體。

1.5 移植瘤組織中Bax、Bcl-2蛋白檢測 用4%甲醛溶液固定腫瘤組織，經(jīng)脫水、包埋、4 μm連續(xù)切片，Bax、Bcl-2抗體稀釋度為1:50，按SP試劑盒說明書進行染色，用PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性片作陽性對照。核膜、胞質(zhì)呈棕黃色為Bcl-2蛋白陽性細胞，胞質(zhì)呈棕黃色為Bax蛋白陽性細胞。低倍鏡下(100×)選擇切片中陽性細胞最密集的區(qū)域(熱點區(qū))，高倍鏡下(400×)拍照。采用Image Pro Plus6.0軟件分析各組圖片熱點區(qū)的總光密度(IOD)值，以IOD值代表目的蛋白相對表達量。

1.6 移植瘤組織中pERK、ERK蛋白檢測 取100 mg腫瘤組織剪碎后置入高溫消毒的玻璃勻漿器中，加100 μL裂解緩沖液冰上放置10 min，冰浴中超聲粉碎6～8次，每次30 s。然后4 ℃下15 000 r/min離心20 min，取上清液，測定蛋白質(zhì)總量。提取腫瘤組織中的總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，TBST洗膜后一抗孵育，4 ℃過夜，TBST洗膜后二抗室溫孵育2 h，ECL顯色試劑盒顯色并拍照。采用Image J圖像分析系統(tǒng)對結(jié)果進行分析。以GAPDH作為對照，以目的蛋白灰度值與GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組治療后移植瘤體積比較 實驗過程中各組裸鼠飲食、活動及生長均未見異常。對照組、5-FU組、SST組、聯(lián)合組治療后瘤體體積分別為(1.006±0.069)、(0.742±0.019)、(0.750±0.025)、(0.559±0.029)cm3，5-FU組、SST組、聯(lián)合組瘤體體積小于對照組，聯(lián)合組瘤體體積小于5-FU組、SST組(P均<0.05)。5-FU組、SST組、聯(lián)合組抑瘤率分別為26.24%、25.45%、44.43%。

2.2 各組移植瘤組織內(nèi)細胞凋亡率比較 對照組、5-FU組、SST組、聯(lián)合組腫瘤組織內(nèi)細胞凋亡率分別為40.50%±1.56%、47.93%±4.68%、48.79%±4.65%、67.29%±4.92%，5-FU組、SST組、聯(lián)合組腫瘤組織內(nèi)細胞凋亡率高于對照組，且聯(lián)合組高于5-FU組、SST組(P均<0.05)。

2.3 各組移植瘤組織中Bax、Bcl-2蛋白表達比較 與對照組相比，5-FU組、SST組、聯(lián)合組移植瘤組織中Bcl-2蛋白相對表達量、Bcl-2/Bax降低，Bax蛋白相對表達量增高；與5-FU組、SST組相比，聯(lián)合組Bcl-2蛋白相對表達量、Bcl-2/Bax降低，Bax蛋白相對表達量增高(見表1)。

2.4 各組移植瘤組織中pERK、ERK蛋白表達比較

表1 各組移植瘤組織中Bcl-2、Bax蛋白相對表達量及Bcl-2/Bax比較

注：與對照組相比，*P<0.05；與SST組、5-FU組相比，ΔP<0.05。

對照組、5-FU組、SST組、聯(lián)合組移植瘤組織中pERK蛋白相對表達量分別為0.882±0.011、0.863±0.014、0.674±0.009、0.640±0.053，ERK蛋白相對表達量分別為0.925±0.011、0.950±0.028、0.928±0.011、0.937±0.029，SST組、聯(lián)合組移植瘤組織中pERK蛋白相對表達量低于對照組(P均<0.05)。詳見圖1。

注：A為對照組；B為5-FU組；C為SST組；D為聯(lián)合組。

3 討論

5-FU作為中晚期胃癌的基礎(chǔ)化療藥物，已在臨床應(yīng)用多年，多項相關(guān)Meta分析顯示其療效肯定[9～11]，然而由于不良反應(yīng)多、耐藥率高，目前臨床上多采取多藥聯(lián)用方式[6]。SST及其類似物可通過直接和間接的機制發(fā)揮抗腫瘤活性：直接機制是通過作用于SSTR1～5，觸發(fā)G蛋白耦聯(lián)的或非G蛋白耦聯(lián)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，繼而發(fā)揮誘導(dǎo)細胞周期阻滯、抑制細胞侵襲、誘導(dǎo)細胞凋亡等作用；間接的抗腫瘤作用包括抑制促腫瘤生長的激素及生長因子釋放、抑制血管生成因子分泌、抗細胞遷移與侵襲等[12，13]。

本實驗培養(yǎng)低分化人胃癌細胞BGC-823并構(gòu)建裸鼠移植瘤，觀察SST-14聯(lián)合5-FU的治療效果并探討作用機制。我們發(fā)現(xiàn)，5-FU組、SST組、聯(lián)合組治療后瘤體體積小于對照組，聯(lián)合組瘤體體積小于5-FU組、SST組，5-FU組、SST組、聯(lián)合組抑瘤率分別為26.24%、25.45%、44.43%；5-FU組、SST組、聯(lián)合組腫瘤組織內(nèi)細胞凋亡率高于對照組，且聯(lián)合組高于5-FU組、SST組。上述結(jié)果表明5-FU、SST-14單藥應(yīng)用或聯(lián)合應(yīng)用均可抑制胃癌細胞移植瘤生長、抑制胃癌細胞凋亡，且兩藥聯(lián)用效果優(yōu)于單獨用藥，5-FU、SST-14聯(lián)用可能發(fā)揮了協(xié)同抑瘤作用。

Bcl-2蛋白家族與腫瘤細胞凋亡密切相關(guān)，其中Bcl-2蛋白抑制細胞凋亡，Bax蛋白促進細胞凋亡[14]。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，5-FU組、SST組、聯(lián)合組移植瘤組織中Bcl-2蛋白相對表達量、Bcl-2/Bax降低，Bax蛋白相對表達量增高；與5-FU組、SST組相比，聯(lián)合組Bcl-2蛋白相對表達量、Bcl-2/Bax降低，Bax蛋白相對表達量增高。這提示5-FU、SST-14的抑瘤作用均與調(diào)控Bcl-2和Bax表達、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡有關(guān)，且SST-14、5-FU聯(lián)用對Bcl-2和Bax表達的調(diào)控作用更強，進而發(fā)揮更強的促凋亡作用，SST-14有望作為5-FU聯(lián)合用藥的重要選擇。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，負責調(diào)節(jié)細胞周期、細胞分化及有絲分裂等細胞活動[15]。ERK是MAPK通路的重要成員之一，包括ERK1和 ERK2兩個亞型，由MEK1和MEK2介導(dǎo)其磷酸化過程。p-ERK是ERK的磷酸化形式，且是Ras/Raf/MEK/ERK途徑重要的下游信號分子。許多細胞因子通過Ras/Raf/MEK/ERK途徑使ERK磷酸化，p-ERK將胞質(zhì)內(nèi)信號傳入胞核，導(dǎo)致多種癌基因及細胞周期調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄與表達，啟動細胞惡性增殖，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。目前，ERK及其下游信號分子已成為新的腫瘤治療靶點。抑制ERK通路功能有助于促進腫瘤細胞發(fā)生凋亡[16，17]。Florio等[18]研究發(fā)現(xiàn)在甲狀腺乳頭狀癌PCCL3細胞系中，SSTR能激活類PTP樣受體，從而抑制生長因子介導(dǎo)的ERK1/2表達增高。Massa等[19]認為SST可通過抑制ERK1/2表達引起膠質(zhì)瘤細胞增殖抑制。江興松等[20]發(fā)現(xiàn)胃癌組織中SST1、SST3表達與p-ERK表達呈負相關(guān)。鑒于5-FU的部分耐藥機制與ERK磷酸化有關(guān)，我們同時觀察了SST-14聯(lián)合5-FU治療后胃癌移植瘤組織中ERK、pERK蛋白的表達變化，結(jié)果顯示，SST組、聯(lián)合組移植瘤組織中pERK蛋白相對表達量低于對照組，提示SST-14在促胃癌細胞凋亡過程中參與調(diào)節(jié)pERK表達，且呈現(xiàn)出負向調(diào)節(jié)趨勢，SST-14可能參與了MAPK-ERK信號通路功能調(diào)節(jié)。

綜上所述，SST-14聯(lián)合5-FU腹腔注射可抑制BGC-823裸鼠移植瘤增長、促進胃癌細胞凋亡，效果優(yōu)于SST-14或5-FU單獨用藥，其機制可能與SST-14下調(diào)胃癌細胞中pERK的表達有關(guān)。上述發(fā)現(xiàn)為SST作為化療藥物增敏劑與化療藥物聯(lián)用治療胃癌提供了實驗依據(jù)。

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Effect of somatostatin 14 peptide combined with 5-FU by intraperitoneal injection on human gastric cancer xenografts in nude mice

FENGAnqiang1,ZHANGNanzheng

(1GraduateSchoolofXuzhouMedicalUniversity,Xuzhou221002,China)

Objective To observe the effect of somatostatin-14 peptide (SST-14) combined with 5-fluorouracil (5-FU) by intraperitoneal injection on human gastric cancer BGC-823 xenografts in nude mice and to explore its mechanism. Methods We constructed 28 human gastric cancer cell line BGC-823 transplantation tumor models of nude mice, and randomly divided them into the control group, 5-Fu group, SST group and the combination group with 7 mice in each group. The combination group was treated with SST-14 and 5-FU, in which SST-14 was injected intraperitoneally 1 mg/kg for four days a week, stopped for three days; 5-FU was injected intraperitoneally 20 mg/kg one time per week. SST group was injected intraperitoneally with SST-14 (1 mg/kg) for four days a week, stopped for three days. 5-FU group was injected intraperitoneally with 5-FU (20 mg/kg) one time per week. The control group was given the same volume of sterile saline. Each group was treated for 21 d. The nude mice were killed by cervical dislocation at 24 h after the last medication. The tumor tissue was stripped completely.The tumor volume was measured and the tumor inhibition rate was calculated. TUNEL method was used to detect the apoptosis rate in the tumor tissues. The expression of Bcl-2 and Bax in tumor tissues was detected by immunohistochemical SP method, and pERK and ERK was detected by Western blotting. Results The tumor volume of 5-FU group, SST group and the combination group was less than that of the control group after treatment, and the tumor volume of the combination group was less than that of 5-FU group and SST group (allP<0.05). The inhibition rate of tumor volume was 26.243% in the 5-Fu group, 25.447% in the SST group, and 44.433% in the combination group. The apoptosis rate in the 5-FU group, SST group and the combination group was higher than that of the control group, and the apoptosis rate in the combination group was higher than that in the 5-FU group and SST group (allP<0.05). Compared with the control group, Bcl-2 protein expression and Bcl-2/Bax in transplanted tumor tissues decreased, Bax protein expression increased in the 5-FU group, SST group and the combination group (allP<0.05). Compared with 5-FU group and SST group, the relative expression level of Bcl-2 protein and Bcl-2/Bax decreased, but the relative expression level of Bax protein increased in the combination group (allP<0.05). The expression of pERK protein of the SST group and the combination group was lower than that of the control group (P<0.05). Conclusions SST-14 combined with 5-FU by intraperitoneal injection can inhibit the growth of human gastric cancer BGC-823 xenografts in nude mice, promote apoptosis of gastric cancer cells, and the effect is better than that of SST-14 or 5-FU alone. The mechanism may be related to the down-regulation of pERK expression in gastric cancer cells by SST-14.

gastric carcinoma; gastric carcinoma cells; xenografts; somatostatin-14; 5-fluorouracil; apoptosis; extracellular signal-regulated kinase

南京軍區(qū)醫(yī)學科技創(chuàng)新項目(15ms044)。

封安強(1982-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要研究方向為消化道系腫瘤的基礎(chǔ)與臨床。E-mail: international911@163.com

張南征(1950-)，女，博士，主任醫(yī)師，主要研究方向為消化道系腫瘤的基礎(chǔ)與臨床。E-mail: nanzhzhang@sina.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.15.004

R735.2

A

1002-266X(2017)15-0013-04

2017-02-14)