趙小芳，王紅

(1遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義563000；2遵義市第一人民醫(yī)院)

DAPT對結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29增殖及乙醛脫氫酶1、Notch信號通路受體和配體表達(dá)的影響

趙小芳1，2，王紅1

(1遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義563000；2遵義市第一人民醫(yī)院)

目的 觀察γ-分泌酶抑制劑(GSIs)DAPT對結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29增殖及結(jié)直腸癌腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物乙醛脫氫酶1(ALDH1)、Notch信號通路受體Notch4、Notch信號通路配體DLL1表達(dá)的影響。方法 體外培養(yǎng)HT-29細(xì)胞，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。分別以0、5、10、20、40、80 μmol/L的DAPT作用于HT-29細(xì)胞24、48、72 h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，用MTT比色法檢測細(xì)胞增殖能力(以O(shè)D值表示)。分別以0、20、40 μmol/L的DAPT作用于HT-29細(xì)胞24 h后，采用RT-PCR法檢測細(xì)胞中的ALDH1、Notch4、DLL1 mRNA，分別采用Western blotting法和免疫組化法檢測ALDH1、Notch4、DLL1蛋白。分析HT-29細(xì)胞中ALDH1、Notch4、DLL1 mRNA及蛋白表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果 DAPT對HT-29細(xì)胞的增殖抑制作用呈一定劑量、時間依賴性，40、80 μmol/L濃度組培養(yǎng)48、72 h時細(xì)胞增殖能力低于培養(yǎng)24 h時(P均<0.05)。DAPT處理后的細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)典型凋亡狀態(tài)改變。20、40 μmol/L的DAPT作用后HT-29細(xì)胞中ALDH1、Notch4、DLL1 mRNA相對表達(dá)量低于0 μmol/L組(P均<0.05)。0、20、40 μmol/L的DAPT作用后HT-29細(xì)胞中ALDH1、Notch4、DLL1蛋白相對表達(dá)量依次降低(P均<0.05)。免疫組化染色圖像分析結(jié)果示，0、20、40 μmol/L的DAPT作用后HT-29細(xì)胞中ALDH1、Notch4、DLL1蛋白表達(dá)OD值依次降低(P均<0.05)。HT-29細(xì)胞中ALDH1、DLL1 mRNA表達(dá)與Notch4 mRNA表達(dá)均呈正相關(guān)關(guān)系(r分別為0.997、0.998，P均<0.05)。HT-29細(xì)胞中ALDH1、DLL1蛋白表達(dá)與Notch4蛋白表達(dá)均呈正相關(guān)關(guān)系(r分別為0.998、0.999，P均<0.05)。結(jié)論 DAPT作用后，細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞中ALDH1、Notch4、DLL1 mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)；DAPT對HT-29細(xì)胞的增殖抑制作用可能與降低腫瘤干細(xì)胞特性、下調(diào)Notch信號通路受體與配體表達(dá)實現(xiàn)的。

結(jié)腸癌；HT-29細(xì)胞；γ-分泌酶抑制劑；(2S)-N-N-(3,5-氟苯乙?；?-L-丙氨酰-2-苯基甘氨酸叔丁酯；腫瘤干細(xì)胞；乙醛脫氫酶1；Notch信號通路；Notch4；DLL1

近年來結(jié)直腸癌在我國的發(fā)病率、病死率呈逐年保持上升趨勢，且發(fā)病年齡提前[1]，嚴(yán)重威脅人們健康。Notch信號通路參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Notch受體和配體分子表達(dá)失調(diào)及Notch信號異常激活現(xiàn)象存在于多種惡性腫瘤中。研究[2，3]還發(fā)現(xiàn)，Notch信號通路是維持腫瘤干細(xì)胞特性的關(guān)鍵，腫瘤干細(xì)胞自我更新也需要Notch信號的調(diào)節(jié)。部分大腸癌的形成可能與Notch信號通路對結(jié)直腸腫瘤干細(xì)胞調(diào)控異常有關(guān)。本實驗將Notch信號通路阻斷劑γ-分泌酶抑制劑(GSIs)DAPT作用于結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29，觀察DAPT對HT-29增殖及結(jié)直腸癌腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物ALDH1、Notch信號通路受體Notch4、Notch信號通路配體DLL1表達(dá)的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29由遵義醫(yī)學(xué)院消化內(nèi)科研究所實驗室常規(guī)傳代保種，培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)的改良型1640培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)中，靜置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中。每48 h換液、傳代1次，觀察細(xì)胞生長情況，處于對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。MTT試劑購自中國凱基生物公司；二甲基亞砜(DMSO)及DAPT購于美國Sigma公司；RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及擴(kuò)增試劑盒均購自中國北京索萊寶科技有限公司；ALDH1單克隆抗體、Notch4單克隆抗體及DLL1多克隆抗體購于美國Abcam公司；倒置顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品。

1.2 DAPT對HT-29細(xì)胞增殖的影響觀察 調(diào)整DAPT濃度為0、5、10、20、40、80 μmol/L，分別加入含有相同數(shù)目的HT-29細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，分別培養(yǎng)24、48、72 h后PBS漂洗，將培養(yǎng)瓶置于Olympus倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍攝照片。采用MTT法觀察細(xì)胞增殖情況。取對數(shù)生長期的細(xì)胞消化制成單細(xì)胞懸液，接種于96孔板內(nèi)，每孔100 μL細(xì)胞懸液，接種密度為1×104/mL，貼壁后血清培養(yǎng)細(xì)胞。將細(xì)胞分組，每組設(shè)置5個復(fù)孔，分別加入0、5、10、20、40、80 μmol/L的DAPT和10%FBS-1640培養(yǎng)基100 μL，并以0.2%體積分?jǐn)?shù)的DMSO替代DAPT作為溶酶對照組。使用MTT比色法觀察培養(yǎng)24、48、72 h后細(xì)胞增殖情況，實驗重復(fù)3次。以O(shè)D值代表細(xì)胞增殖能力。

1.3 DAPT對HT-29細(xì)胞中ALDH1、Notch4、DLL1表達(dá)的影響觀察 取對數(shù)生長期的HT-29細(xì)胞，以5×104/孔接種于12孔板，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后分別加入含0、20、40 μmol/L DAPT的10%FBS-1640培養(yǎng)基2 mL，用于Notch4、DLL1、ALDH1 mRNA和蛋白檢測。

1.3.1 ALDH1、Notch4、DLL1 mRNA檢測 按照RT-PCR試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，總RNA定量為0.2 μg/μL。將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件為37 ℃×15 min，85 ℃×5 s，4 ℃保持。cDNA產(chǎn)物放-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩LDH1基因上游引物序列為5′-TTGTCCAGCCCACAGTGTTCTC-3′，下游引物序列為5′-TGTCTTTGGTAAACACTCCTGCTGA-3′；Notch4基因上游引物序列為5′-CTTCGGGACTTCTGTTCAGC-3′，下游引物序列為5′-TCGTTGACATCACGTTCACA-3′；DLL1基因上游引物序列為5′-GATGTGATGAGCAGCATGGA-3′，下游引物序列為5′-CCATGGAGACAGCCTGGATA-3′；內(nèi)參基因β-actin上游引物序列為5′-TGGCACCCAGCACAATGA-3′，下游引物序列為5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAG-3′。按擴(kuò)增體系進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃×5 min、95 ℃×30 s、56.9 ℃退火×30 s、72 ℃×1 min 30 s、72 ℃×10 min；擴(kuò)增產(chǎn)物-20 ℃冰箱保存。以2-ΔΔCt表示目的基因相對表達(dá)量。

1.3.2 ALDH1、Notch4、DLL1蛋白檢測 ①Western boltting法：按照試劑盒說明提取細(xì)胞總蛋白，于酶標(biāo)儀上做蛋白定量測量；按Western boltting實驗步驟進(jìn)行凝膠電泳，用脫脂奶粉封閉1 h，分別加入最適比例的相應(yīng)一抗和β-actin，4 ℃冰箱搖床上封閉過夜，洗膜后加入與一抗來源相同的二抗(1∶5 000)；顯色曝光，掃描儀掃描膠片，用Image-plus軟件測量灰度值，結(jié)果用Image Pro Plus圖像處理軟件統(tǒng)計灰度值，以目的蛋白IOD值/內(nèi)參β-actin IOD值表示蛋白相對表達(dá)量。②免疫組化法：按照免疫組化染色步驟進(jìn)行，一抗4 ℃孵育過夜，加二抗生物素標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG工作液50 μL，培養(yǎng)30 min，DAB顯色劑顯色，顯微鏡下觀察，ALDH1、Notch4、DLL1陽性細(xì)胞為細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色至棕色顆粒，采集圖像后用Image Pro Plus6.0圖像分析軟件進(jìn)行分析，得出OD值，計算視野內(nèi)平均OD值。

2 結(jié)果

2.1 DAPT對HT-29細(xì)胞增殖的影響 與未用DAPT處理細(xì)胞對比，DAPT處理后的細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)典型凋亡狀態(tài)改變：細(xì)胞呈近似圓形或橢圓形，細(xì)胞間隙增大，數(shù)量逐漸減少，細(xì)胞分散，細(xì)胞輪廓欠清晰，部分胞體變圓。相同時間下，DAPT作用濃度增高，細(xì)胞增殖能力下降；相同DAPT作用濃度下，隨作用時間延長，細(xì)胞增殖能力也下降；DAPT對HT-29細(xì)胞的增殖抑制作用呈一定劑量、時間依賴性，其中40、80 μmol/L濃度組培養(yǎng)48、72 h時細(xì)胞增殖能力低于培養(yǎng)24 h時(P均<0.05)。詳見表1。

表1 不同濃度DAPT作用不同時間后各組細(xì)胞增殖能力比較

注：與相同培養(yǎng)時間對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與相同濃度培養(yǎng)24 h時比較，#P<0.05。

2.2 DAPT對HT-29細(xì)胞中ALDH1、Notch4、DLL1 mRNA表達(dá)的影響 20、40 μmol/L的DAPT作用后HT-29細(xì)胞中ALDH1、Notch4、DLL1 mRNA相對表達(dá)量低于0 μmol/L組(P均<0.05，見表2)。

表2 不同濃度DAPT作用后HT-29細(xì)胞中ALDH1、Notch4、DLL1 mRNA及蛋白表達(dá)比較

注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與20 μmol/L組比較，#P<0.05。

2.3 DAPT對HT-29細(xì)胞中ALDH1、Notch4、DLL1蛋白表達(dá)的影響 0、20、40 μmol/L的DAPT作用后HT-29細(xì)胞中ALDH1、Notch4、DLL1蛋白相對表達(dá)量依次降低(P均<0.05)，見表2。免疫組化染色顯示，0 μmol/L組細(xì)胞胞膜、胞質(zhì)呈棕黃色染色，細(xì)胞形態(tài)正常；20、40 μmol/L組ALDH1、Notch4、DLL1陽性細(xì)胞數(shù)量較0 μmol/L組減少，且著色程度減弱。0、20、40 μmol/L的DAPT作用后HT-29細(xì)胞中ALDH1蛋白OD值分別為2.00±0.24、1.03±0.09、0.54±0.10，Notch4蛋白表達(dá)OD值分別為1.33±0.19、0.86±0.11、0.27±0.05，DLL1蛋白表達(dá)OD值分別為1.08±0.10、0.72±0.12、0.33±0.05，0、20、40 μmol/L的DAPT作用后HT-29細(xì)胞中ALDH1、Notch4、DLL1蛋白OD值依次降低(P均<0.05)。

2.4 HT-29細(xì)胞中ALDH1、DLL1、Notch4 mRNA及蛋白表達(dá)的相關(guān)性 HT-29細(xì)胞中ALDH1、DLL1 mRNA表達(dá)與Notch4 mRNA表達(dá)均呈正相關(guān)關(guān)系(r分別為0.997、0.998，P均<0.05)。HT-29細(xì)胞中ALDH1、DLL1蛋白表達(dá)與Notch4蛋白表達(dá)均呈正相關(guān)關(guān)系(r分別為0.998、0.999，P均<0.05)。

3 討論

Notch信號通路幾乎存在于所有的細(xì)胞、生物中，是一個高度保守的系統(tǒng)，介導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡，參與造血、胚胎發(fā)育、結(jié)直腸上皮細(xì)胞成熟、免疫細(xì)胞成熟等過程，且在相鄰細(xì)胞細(xì)胞間的互相聯(lián)系中也發(fā)揮重要作用[4]。已有研究[5]發(fā)現(xiàn)Notch信號通路分子在許多惡性腫瘤中呈異常表達(dá)，如胰腺癌、前列腺癌、尤因肉瘤、宮頸癌和結(jié)腸癌等。Notch1和Hes-1高表達(dá)與結(jié)直腸癌分期、耐藥有關(guān)[6]，Notch3表達(dá)與Ⅱ、Ⅲ期結(jié)直腸癌的復(fù)發(fā)密切相關(guān)[7]，但Notch2表達(dá)與結(jié)直腸癌進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)[8]。有學(xué)者[9]發(fā)現(xiàn)DLLl基因表達(dá)異?？赡芘c結(jié)直腸癌早期發(fā)病有關(guān)，由此推測Notch信號通路分子可能成為腫瘤早期診斷和預(yù)防的重要靶點。

Notch信號通路中有三個腫瘤治療靶點[10]：①抑制NICD釋放，如使用GSIs DAPT[11，12]；②阻斷受體與配體的結(jié)合，如shRNA沉默大腸癌細(xì)胞中Jagged1表達(dá)；③作用于共激活復(fù)合物，如使用CLS的小分子抑制性肽以減少靶基因的轉(zhuǎn)錄活化[13]。本實驗選擇的Notch信號通路抑制劑為DAPT，一種人工合成的非選擇性GSIs，可阻斷Notch受體第三步酶切過程，使Notch受體分子無法轉(zhuǎn)變成有效的活性片段，從而抑制Notch信號通路激活，阻止Notch活化[14]。且DAPT細(xì)胞毒性小，即使阻斷γ-分泌酶而引起底物堆積也不會產(chǎn)生毒性作用。本研究分別將不同濃度的DAPT作用于HT-29細(xì)胞，結(jié)果顯示，相同時間下，隨著DAPT作用濃度增高，細(xì)胞增殖能力逐漸下降；而在相同DAPT作用濃度下，隨作用時間延長，細(xì)胞增殖能力也逐漸下降；DAPT對HT-29細(xì)胞的增殖抑制作用呈一定劑量、時間依賴性；DAPT處理后的細(xì)胞出現(xiàn)典型凋亡狀態(tài)改變。這說明DAPT可抑制HT-29細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，具有一定的抗腫瘤作用。

研究[15]證實，人結(jié)直腸癌組織中腸道干細(xì)胞表面標(biāo)志物高表達(dá)，后者可通過作用于Notch、Wnt等通路導(dǎo)致腫瘤形成。干細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測有助于對正常干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行鑒別[16]。ALDH1是乙醛脫氫酶家族之一，參與多種組織的分化與基因表達(dá)，也是正常干細(xì)胞與腫瘤干細(xì)胞生長、分化的必需物質(zhì)，在腫瘤發(fā)展過程中也發(fā)揮重要作用。已有研究[17]顯示，Notch誘導(dǎo)ALDH1A1去乙?；赡芘c腫瘤高侵襲性有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，20、40 μmol/L的DAPT作用后HT-29細(xì)胞中ALDH1、Notch4、DLL1 mRNA相對表達(dá)量低于0 μmol/L組；0、20、40 μmol/L的DAPT作用后HT-29細(xì)胞中ALDH1、Notch4、DLL1蛋白相對表達(dá)量依次降低。由上可見結(jié)腸癌細(xì)胞中高表達(dá)的ALDH1經(jīng)Notch信號通路抑制劑DAPT作用后表達(dá)下調(diào)，且細(xì)胞中Notch信號通路分子Notch4和DLL1表達(dá)也發(fā)生下調(diào)，推測DAPT對結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制、促凋亡作用與降低腫瘤干細(xì)胞特性、下調(diào)Notch信號通路受體與配體表達(dá)有關(guān)。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)HT-29細(xì)胞中ALDH1、DLL1 mRNA表達(dá)與Notch4 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，ALDH1、DLL1蛋白表達(dá)與Notch4蛋白表達(dá)也呈正相關(guān)關(guān)系，提示ALDH1、DLL1、Notch4在結(jié)腸癌細(xì)胞增殖中存在協(xié)同作用，詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Effects of DAPT on proliferation of colon cancer cell line HT-29, expression of ALDH1, Notch signaling pathway receptor and ligand

ZHAOXiaofang1,WANGHong

(1AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563000,China)

Objective To observed the effects of γ-secretase inhibitors (GSIs) DAPT on proliferation of colon cancer cell line HT29, colorectal tumor stem cell marker aldehyde dehydrogenase 1 (ALDH1), Notch signaling pathway receptor Notch4 and Notch signal pathway ligand DLL1 expression. Methods HT-29 cells were cultured in vitro, and the cells in the logarithmic phase were used in the experiment. DAPT (0, 5, 10, 20, 40, 80 umol/L) was used to treat HT-29 cells for 24, 48 and 72 h, we observed the cell morphology under inverted microscope, detected the cell proliferation ability by MTT colorimetry (OD value). DAPT (0, 20, 40 μmol/L) was used to treat HT-29 cells for 24 h, the ALDH1, Notch4, DLL1 mRNA was detected by RT-PCR, the ALDH1, Notch4, DLL1 protein was detected using Western blotting and immunohistochemistry. The correlation of ALDH1, Notch4, DLL1 mRNA and protein expression in HT-29 cells was analyzed. Results The proliferation inhibition of DAPT on HT-29 cells was in a dose- and time-dependent manner. The proliferation ability of cells at 48, 72 h was lower than that at 24 h in the 40, 80 umol/L groups (P<0.05). Cells showed typical apoptosis state change after DAPT treatment. The mRNA expression of ALDH1, Notch4 and DLL1 in HT-29 cells treated with 20, 40 umol/L DAPT was lower than that treated with 0 umol/L DAPT (allP<0.05). The protein expression of ALDH1, Notch4 and DLL1 in HT-29 cells treated with 0, 20, 40 μmol/L DAPT was decreased successively (allP<0.05). Immunohistochemical image analysis, the OD value of protein expression of ALDH1, Notch4, and DLL1 in HT-29 cells treated with 0, 20, 40 umol/L DAPT was reduced in turn (allP<0.05). The mRNA expression of ALDH1 and DLL1 in HT-29 cells was positively correlated with Notch4 mRNA expression (r=0.997, 0.998; allP<0.05). The protein expression of ALDH1and DLL1 was positively correlated with Notch4 protein expression in the HT-29 cells (r=0.998, 0.999, allP<0.05). Conclusions After DAPT treatment, the cell proliferation is inhibited and the mRNA and protein expression of ALDH1, Notch4 and DLL1 is down-regulated. The proliferation inhibition of DAPT on HT-29 cells may be related to reducing the cancer stem cell properties and down-regulating Notch signaling pathwayreceptor and ligand expression.

colorectal carcinoma; HT-29 cells; γ-secretase inhibitors; (2S)-NN-(3,5-fluorophenylacetyl) -L-alanyl-2-phenylglycine tert-Aldehyde dehydrogenase 1; tumor stem cells; aldehyde dehydrogenase 1; Notch signaling pathway; Notch4; DLL1

貴州省科技計劃項目(黔科合SY字2013-3006)；貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項目(黔科合SY字2010-2172)。

趙小芳(1986-)，女，碩士，主要研究方向為結(jié)直腸癌的防治。E-mail: 627813412@qq.com

王紅(1971-)，女，主任醫(yī)師，主要研究方向為結(jié)直腸癌的防治。E-mail: wanghong89zy@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.15.002

R735.3

A

1002-266X(2017)15-0005-04

2016-10-21)