邱漢琛，孫悅文，羅舜仁，陳燕燕，付麗香，廖智紅，黃修影，劉布鳴，唐安洲，梁鋼

(1廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧530021；2柳州市婦幼保健院；3廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

·論著·

裂果薯總皂苷對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖、遷移、凋亡的影響及對(duì)正常肝細(xì)胞的毒性作用

邱漢琛1，孫悅文1，羅舜仁1，陳燕燕1，付麗香2，廖智紅1，黃修影1，劉布鳴3，唐安洲4，梁鋼1

(1廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧530021；2柳州市婦幼保健院；3廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

目的 觀察裂果薯總皂苷(SFSP)對(duì)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721增殖、遷移、凋亡的影響及對(duì)人正常肝細(xì)胞HL-7702的毒性作用。方法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721細(xì)胞，分為給藥組和對(duì)照組(不加SFSP),給藥組分別加入0.625、1.25、2.5、5 μg/mL的SFSP培養(yǎng)24 h，采用MTT法觀察并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率和IC50；分別以0、2、4、6 μg/mL的SFSP作用于SMMC-7721細(xì)胞，分別于培養(yǎng)24、48 h采用劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移能力變化；分別以0、2、4、6 μg/mL的SFSP作用于SMMC-7721細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后采用吖啶橙/溴乙雙熒光染色法觀察SMMC-7721細(xì)胞凋亡情況，免疫熒光法觀察細(xì)胞形態(tài)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-7702細(xì)胞，分別加入0、2.5、12.5、25、50、100 μg/mL的SFSP，測(cè)算細(xì)胞增殖抑制率及IC50。結(jié)果 0.625、1.25、2.5、5 μg/mL的SFSP作用于SMMC-7721細(xì)胞24、48、72 h后，細(xì)胞增殖受到不同程度的抑制，SFSP對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制作用呈現(xiàn)時(shí)間與劑量依賴性(P均<0.05)；SFSP在24、48、72 h時(shí)的IC50值分別為3.75、1.56、0.95 μg/mL。0、2、4、6 μg/ mL的SFSP作用于SMMC-7721細(xì)胞后，細(xì)胞劃痕愈合率逐漸減小，凋亡細(xì)胞逐漸增多(P均<0.05)。SFSP作用后，SMMC-7721細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，呈圓形或紡錘形，微管蛋白β熒光強(qiáng)度降低并高度聚集，觀察到大量阻滯于分裂周期中的細(xì)胞。0、2.5、12.5、25、50、100 μg/mL的SFSP作用于HL-7702細(xì)胞后，細(xì)胞增殖受到不同程度的抑制，SFSP作用24 h的IC50為47.6 μg/mL，低于作用于SMMC-7721細(xì)胞24 h時(shí)的IC50(3.75 μg/mL)。結(jié)論 SFSP可抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖與遷移，誘導(dǎo)其凋亡，阻滯其細(xì)胞周期，且對(duì)正常肝細(xì)胞毒性作用較小。

裂果薯；總皂苷；肝癌；細(xì)胞增殖；細(xì)胞遷移；細(xì)胞凋亡

裂果薯別名屈頭雞、水狗仔、水田七及水蘿卜等，為蒟蒻薯科裂果薯屬植物，其是廣西一種特色中草藥，藥用其根塊莖，具有清熱解毒、散瘀消腫、理氣止痛等功效[1]；瑤族人民用于無(wú)名腫痛和抗腫瘤治療[2]。本課題組前期研究從29種廣西民間抗腫瘤中草藥提取物和含藥血清進(jìn)行篩選，首次發(fā)現(xiàn)裂果薯醇提物和皂苷成分具有明顯抑制人肝癌細(xì)胞和鼻咽癌細(xì)胞增殖的作用[3，4]，裂果薯醇提取物具有抑制人肝癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)與血管生成的作用[5]。但目前國(guó)內(nèi)外仍未有裂果薯總皂苷(SFSP)對(duì)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721作用的相關(guān)報(bào)道，為此，本研究觀察了SFSP對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響及對(duì)人正常肝細(xì)胞HL-7702的毒性作用，為新藥研發(fā)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 裂果薯塊莖購(gòu)自廣西壯族自治區(qū)資源縣瓜里鄉(xiāng)，由廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院黃云峰教授鑒定并出具報(bào)告。SFSP皂苷含量為85.31%。SMMC-7721細(xì)胞和HL-7702細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購(gòu)自Hyclone公司。MTT購(gòu)自AMRESCO公司。4%多聚甲醛溶液和AO-EB試劑盒購(gòu)自碧云天公司?？篃晒獯銣绶馄嘿?gòu)自南京凱基公司。小鼠抗人微管蛋白β單克隆抗體和羊抗小鼠FITC二抗購(gòu)自Abcam公司。

1.2 SFSP對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721細(xì)胞以1×105/mL接種于96孔板，分為給藥組和對(duì)照組。培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)基，給藥組分別加入含有0.625、1.25、2.5、5 μg/mL SFSP的培養(yǎng)液200 μL。對(duì)照組不加SFSP。孵育24 h后移除培養(yǎng)液，加入含0.5 mg/mL的MTT的DMEM培養(yǎng)液200 μL孵育4 h。4 h后棄去培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150 μL，15 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值(A值)。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(對(duì)照組A值-給藥組A值)/對(duì)照組A值×100%。使用SPSS軟件回歸分析計(jì)算IC50。

1.3 SFSP對(duì)SMMC-7721細(xì)胞遷移的影響觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721細(xì)胞，以2.5×105/mL接種于96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，細(xì)胞增長(zhǎng)至90%融合度時(shí)，以移液槍無(wú)菌槍頭垂直在96孔板的中央劃一條痕跡，用PBS洗滌3次后，分別加入含0、2、4、6 μg/mL SFSP的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基。分別在劃痕后0、24、48 h在固定位置用倒置顯微鏡拍照，以劃痕愈合率評(píng)價(jià)細(xì)胞遷移能力。劃痕愈合率=(0 h劃痕寬度-24 h或48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.4 SFSP對(duì)SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721細(xì)胞，以3×105/mL接種于6孔板，每孔1 mL,培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，分別加入0、2、4、6 μg/mL的SFSP。孵育24 h后，以PBS清洗3次，用4%多聚甲醛固定15 min；PBS清洗3次，分別加入吖啶橙(AO)/溴乙(EB)染色液0.5 mL，避光孵育5 min；PBS清洗細(xì)胞3次，用含有抗熒光淬滅劑的封片液封閉細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況并拍照。隨機(jī)選取5個(gè)視野統(tǒng)計(jì)各濃度組正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞的數(shù)量，并計(jì)算凋亡率。凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5 SFSP對(duì)SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)的影響觀察 采用免疫熒光法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721細(xì)胞，以3×105/mL接種于6孔板，每孔1 mL,培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，分別加入0、2、4、6 μg/mL的SFSP。孵育24 h后，以冰PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定15 min；PBS清洗3次，在室溫下以0.5% Triton X-100通透15 min；PBS清洗3次，以山羊血清室溫封閉30 min；棄去血清，以小鼠抗人微管蛋白β抗體(1∶1 000)在4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜；PBST清洗3次，吸干后加入FITC羊抗小鼠(1∶500)二抗，室溫避光孵育1 h，之后PBST避光清洗3次；滴加DAPI避光孵育5 min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，PBST清洗；用含有抗熒光淬滅劑的封片液覆蓋細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察。

1.6 SFSP對(duì)HL-7702細(xì)胞的毒性作用觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-7702細(xì)胞，以1×105/mL接種于96孔板，每孔100 μL,培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)基，分別加入含0、2.5、12.5、25、50、100 μg/mL SFSP的培養(yǎng)液，每孔200 μL。參考“1.2”中的方法測(cè)算細(xì)胞增殖抑制率及IC50。

2 結(jié)果

2.1 SFSP對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響 0.625、1.25、2.5、5 μg/mL的SFSP作用于SMMC-7721細(xì)胞24、48、72 h后，細(xì)胞增殖受到不同程度的抑制，SFSP對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制作用呈現(xiàn)時(shí)間與劑量依賴性(P均<0.05)。詳見(jiàn)表1。SFSP在24、48、72 h時(shí)的IC50值分別為3.75、1.56、0.95 μg/mL。

表1 SFSP作用不同時(shí)間后給藥組SMMC-7721細(xì)胞增殖抑制率變化

2.2 SFSP對(duì)SMMC-7721細(xì)胞遷移的影響 0、2、4、6 μg/mL的SFSP作用于SMMC-7721細(xì)胞24 h后劃痕愈合率分別為32.23%±0.67%、27.82%±0.98%、13.39%±1.23%、10.78%±1.25%；作用48 h后分別為62.81%±0.86%、53.34%±1.32%、33.07%±1.63%、12.46%±1.74%。隨著SFSP作用濃度增大，SMMC-7721細(xì)胞劃痕愈合率減小(P均<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.3 SFSP對(duì)SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響 AO/EB染色后正常細(xì)胞淡綠色熒光；早期凋亡細(xì)胞局部呈現(xiàn)明亮的綠色熒光或黃綠色熒光；晚期凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)橙黃色熒光或橘黃色熒光；壞死細(xì)胞呈現(xiàn)不均勻的橘黃色熒光。0、2、4、6 μg/mL的SFSP作用于SMMC-7721細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率分別為0、12.34%±2.56%、43.87%±4.21%、90.46%±3.57%，不同濃度組相比，P均<0.05。見(jiàn)圖2。

圖1 不同濃度SFSP作用于SMMC-7721細(xì)胞24、48 h后劃痕愈合情況

圖2 不同濃度SFSP作用后SMMC-7721細(xì)胞凋亡情況

2.4 SFSP對(duì)SMMC-7721細(xì)胞形態(tài)的影響 未添加SFSP的SMMC-7721細(xì)胞呈伸展伴有觸角的多邊形狀，細(xì)胞核呈規(guī)則的橢圓形，微管蛋白β均勻分布于胞質(zhì)。不同濃度SFSP作用后，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，呈現(xiàn)圓形或紡錘形，微管蛋白β熒光強(qiáng)度降低并高度聚集，觀察到大量阻滯于分裂周期中的細(xì)胞。

2.5 SFSP對(duì)HL-7702細(xì)胞的毒性作用 0、2.5、12.5、25、50、100 μg/mL的SFSP作用于HL-7702細(xì)胞后，細(xì)胞增殖受到不同程度的抑制，SFSP作用24 h的IC50為47.6 μg/mL，低于作用于SMMC-7721細(xì)胞24 h時(shí)的IC50(3.75 μg/mL)，表明SFSP對(duì)HL-7702細(xì)胞毒性較小。

3 討論

肝癌是全球常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，肝癌有惡性程度高、發(fā)展迅速、容易轉(zhuǎn)移、耐藥率高和治療困難等特點(diǎn)，其病死率僅次于肺癌和胃癌。肝癌早期治療主要以手術(shù)為主，但術(shù)后5年復(fù)發(fā)率較高，為70%～80%[6]；伴有轉(zhuǎn)移的中晚期肝癌僅能通過(guò)系統(tǒng)化療、局部介入等方法進(jìn)行治療[7]。目前臨床上常用的化療藥物有順鉑、氟尿嘧啶和蒽環(huán)類抗癌抗生素等，但經(jīng)過(guò)聯(lián)合化療的患者容易出現(xiàn)耐藥，療效不佳，5年生存率未見(jiàn)提高[8，9]。因此，為尋找療效好、毒性作用小的天然抗腫瘤活性組分對(duì)肝癌治療有積極意義。本課題組通過(guò)收集民間治療腫瘤的偏方，并對(duì)中草藥提取物和含藥血清進(jìn)行體外抗癌活性篩選，首次發(fā)現(xiàn)裂果薯醇提物對(duì)肝癌、鼻咽癌細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用，進(jìn)一步通過(guò)活性追蹤的方法發(fā)現(xiàn)其活性成分為皂苷[3，4]。本研究將不同濃度的SFSP作用于SMMC-7721細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)SMMC-7721細(xì)胞增殖抑制率升高，劃痕愈合率降低，且呈劑量、時(shí)間依賴性，提示SFSP能夠抑制SMMC-7721細(xì)胞的增殖與遷移，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步探索。

真核細(xì)胞主要經(jīng)死亡受體介導(dǎo)的外源性凋亡途徑和內(nèi)源性線粒體凋亡途徑介導(dǎo)發(fā)生凋亡。外源性凋亡途徑中，死亡受體通過(guò)與相關(guān)配體結(jié)合發(fā)生寡聚化及結(jié)構(gòu)改變并激活銜接蛋白，引起下游Caspase激活而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[10]；在內(nèi)源性線粒體凋亡途徑中，線粒體膜電位降低引起細(xì)胞色素C向胞質(zhì)釋放，凋亡相關(guān)蛋白(Bax、Bak)和抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-xL)平衡被打破，在Caspase蛋白的參與下，引起細(xì)胞凋亡[11，12]。本研究結(jié)果顯示，SFSP作用于SMMC-7721細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡增多，且作用呈劑量依賴性，說(shuō)明SFSP可誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡，機(jī)制可能涉及上述途徑。微管是細(xì)胞骨架的重要組成部分，由α和β兩種微管蛋白異二聚體聚合而成，與細(xì)胞形態(tài)維持、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)輸和分化、細(xì)胞有絲分裂及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能密切相關(guān)，是抗腫瘤藥的重要靶點(diǎn)之一[13～17]。本研究發(fā)現(xiàn)，SFSP作用于SMMC-7721細(xì)胞后出現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯及微管蛋白β高度聚集，微管蛋白異二聚體的聚合與解聚的動(dòng)態(tài)平衡遭到破壞，進(jìn)一步抑制細(xì)胞增殖并促使其凋亡。

上述結(jié)果顯示，SFSP體外作用于人肝癌SMMC-7721細(xì)胞后，具有明顯的增殖抑制、遷移抑制、誘導(dǎo)凋亡、細(xì)胞周期阻滯和促微管蛋白聚集的作用，初步表明了SFSP的抗腫瘤活性。然而，新藥的研究與開(kāi)發(fā)必須包括安全性評(píng)價(jià)。我們將不同濃度的SFSP作用于人正常肝細(xì)胞HL-7702，測(cè)算細(xì)胞增殖抑制率，結(jié)果顯示，SFSP作用24 h時(shí)對(duì)HL-7702細(xì)胞的IC50為47.6 μg/mL，是其對(duì)SMMC-7721細(xì)胞IC50的10.87倍，提示SFSP對(duì)人正常肝細(xì)胞的毒性作用較小，可能具有良好的安全性。

綜上所述，SFSP可抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖與遷移，誘導(dǎo)其凋亡，阻滯其細(xì)胞周期，且對(duì)正常肝細(xì)胞毒性作用較小，有望成為潛在的抗腫瘤藥，具有較大的新藥研究與開(kāi)發(fā)價(jià)值。至于SFSP的具體抗腫瘤作用機(jī)制目前尚未明確，有待我們進(jìn)一步研究。

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Effects of saponins from Schizocapsa plantaginea Hance on proliferation, migration and apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells and its toxicity to normal hepatocytes

QIUHanchen1,SUNYuewen,LUOShunren,CHENYanyan,FULixiang,LIAOZhihong,HUANGXiuying,LIUBuming,TANGAnzhou,LIANGGang

(1CollegeofPharmacy,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To investigate the effects of saponins from Schizocapsa plantaginea Hance (SFSP) on the proliferation, migration and apoptosis of human hepatocellular carcinoma SMMC-7721 cells and its toxicity to normal human hepatocytes HL-7702. Methods We chose the SMMC-7721 cells in the logarithmic phase and divided them into the administration group and the control group, cells in the administration group were treated with different concentrations of SFSP (0, 0.625, 1.25, 2.5 and 5 μg/mL) for 24 h. MTT assay was used to detect the proliferation inhibition rate of SMMC-7721 cells in order to finally calculate its half inhibitory concentration (IC50). SMMC-7721 cells in the logarithmic phase were treated with final concentrations of SFSP (0, 2, 4, and 6 μg/mL) for 24 h, and 48 h and then the scratch assay was used to observe the changes of cell migration ability. Furthermore, SMMC-7721 cells in the logarithmic phase were treated with final concentrations of SFSP (0, 2, 4, and 6 μg/mL) for 24 h, and meanwhile we observed their apoptosis and morphology by AO-EB double staining and immunofluorescence. We chose the HL-7702 cells in the logarithmic phase and separately treated them with different concentrations of SFSP (0, 2.5, 12.5, 25, 50 and 100 μg/mL) for 24 h. MTT assay was used to detect the proliferation inhibition rate of HL-7702 cells in order to finally calculate its IC50. Results After 0.625, 1.25, 2.5 and 5 μg/mL SFSP were applied to SMMC-7721 cells for 24, 48 and 72 h, the proliferation of cells was inhibited to different degrees. The inhibitory effect of SFSP on SMMC-7721 cells was in a time-and dose-dependent manner (allP<0.05). The IC50values of SFSP at 24, 48 and 72 h were 3.75, 1.56 and 0.95 μg/mL, respectively. After 0, 2, 4, 6 μg/mL SFSP were applied to SMMC-7721 cells, the healing rate of the cells was gradually decreased and the apoptotic cells were gradually increased (allP<0.05). SMMC-7721 cells shrank, appeared round or spindle shape, tubulin β fluorescence intensity decreased and highly aggregated, and a large number of cells in the split cycle. After 0, 2.5, 12.5, 25, 50 and 100 μg/mL SFSP were applied to HL-7702 cells for 24 h, the proliferation of cells was inhibited to different degrees. The IC50of SFSP was 47.6 μg/mL at 24 h, which was lower than that (3.75 μg/mL) of SMMC-7721 cells. Conclusions SFSP could significantly inhibit the proliferation and migration, induce the apoptosis, and block the cell cycle in human hepatocellular carcinoma SMMC-7721 cells. Meanwhile, SFSP have less toxic effect on normal human hepatocytes.

Schizocapsa plantaginea Hance; total saponins; hepatocellular carcinoma; cell proliferation; cell migration; apoptosis

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81460620)；廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014GXNSFDA118025)；廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院)開(kāi)放課題基金項(xiàng)目(桂中重開(kāi)201105)。

邱漢琛(1990-)，男，在讀碩士，主要研究方向?yàn)榭鼓[瘤分子藥理學(xué)和天然藥物化學(xué)。E-mail: 471888837@qq.com

梁鋼(1957-)，男，博士生導(dǎo)師，教授，主要研究方向?yàn)樘烊凰幬锟鼓[瘤分子藥理學(xué)及新藥研發(fā)。E-mail: lianggang22@aliyun.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.15.001

R966

A

1002-266X(2017)15-0001-04

2016-11-13)