張娟，李明勇，賀元，白懷，范平

(1．四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川成都610072; 2．四川大學(xué)華西第二醫(yī)院/西部婦幼醫(yī)學(xué)研究院，四川成都610041)

微電場(chǎng)通過(guò)非整合素途徑活化粘著斑激酶促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移/侵襲研究

張娟1，李明勇1，賀元1，白懷2，范平2

(1．四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川成都610072; 2．四川大學(xué)華西第二醫(yī)院/西部婦幼醫(yī)學(xué)研究院，四川成都610041)

目的 探討生理性微電場(chǎng)促進(jìn)體外培養(yǎng)的人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞遷移/侵襲功能是否與滋養(yǎng)細(xì)胞表面整合素(integrin)表達(dá)有關(guān)。方法 用150 mV/mm的直流微電場(chǎng)刺激滋養(yǎng)細(xì)胞，時(shí)間分別為5、10和15 h，測(cè)定其遷移情況并觀察細(xì)胞形態(tài)變化。Western blot檢測(cè)刺激前后1 h內(nèi)粘著斑激酶FAK活化情況和細(xì)胞表面integrinα1、integrinα5、integrinαV和integrinα1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 在含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，150 mV/mm電場(chǎng)刺激下滋養(yǎng)細(xì)胞向負(fù)極定向遷移，遷移速度和距離較對(duì)照組明顯增加(P= 0.021)，胞體拉長(zhǎng)，垂直于電場(chǎng)方向排列；胞內(nèi)FAKTyr397位點(diǎn)于刺激后5、10、30、60 min內(nèi)迅速活化并逐漸加強(qiáng)(P<0.05)；刺激前后滋養(yǎng)細(xì)胞表面integrinα1、integrinα5、integrinαV、和integrinα1蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯改變(P> 0.05)。結(jié)論 生理性直流微電場(chǎng)可能通過(guò)非整合素途徑活化FAK從而促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移/侵襲功能，但其詳細(xì)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

微電場(chǎng)；滋養(yǎng)細(xì)胞；整合素；粘著斑激酶；遷移/侵襲

生物電現(xiàn)象是生命活動(dòng)的基本屬性，在機(jī)體的一切生命活動(dòng)中都伴隨著生物電的產(chǎn)生[1]。研究結(jié)果顯示，生理強(qiáng)度的直流微電場(chǎng)(direct current electric field，DCEF)可介導(dǎo)包括微血管內(nèi)皮細(xì)胞、大血管內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等在內(nèi)的多種細(xì)胞的定向遷移。關(guān)于細(xì)胞對(duì)微電場(chǎng)的應(yīng)激反應(yīng)，可能與細(xì)胞表面相關(guān)受體重排、離子通道開(kāi)放、胞內(nèi)骨架蛋白及細(xì)胞器極化排列以及胞內(nèi)多條信號(hào)傳導(dǎo)通路活化密切相關(guān)，但不同類型的細(xì)胞應(yīng)答特性有所不同[2～4]。我們前期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)[5～7]，微電場(chǎng)中培養(yǎng)的滋養(yǎng)細(xì)胞在常氧和缺氧條件下均能產(chǎn)生定向運(yùn)動(dòng)和垂直于電場(chǎng)方向排列的應(yīng)答反應(yīng)，提示微電場(chǎng)可能作為一種重要的信號(hào)促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移/侵襲等功能。

整合素是細(xì)胞表面一種重要的粘附分子和跨膜蛋白大家族，由α和β兩種亞基構(gòu)成的異二聚體。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，滋養(yǎng)層細(xì)胞早期侵入子宮內(nèi)膜與細(xì)胞表面特異性整合素的表達(dá)密切相關(guān)[8～10]。黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)是一種非受體蛋白酪氨酸激酶，在生長(zhǎng)因子和整合素介導(dǎo)的細(xì)胞黏附和遷移以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起著關(guān)鍵的作用[5～7]，但微電場(chǎng)促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移/侵襲功能是否與滋養(yǎng)細(xì)胞表面整合素表達(dá)相關(guān)，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)其它報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)擬研究微電場(chǎng)刺激是否通過(guò)滋養(yǎng)細(xì)胞表面整合素途徑活化FAK進(jìn)而促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移/侵襲功能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/Svneo，由四川大學(xué)華西二院彭冰教授惠贈(zèng)。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素均購(gòu)自GIBCO公司，兔抗人integrinα1、integrinα5、integrinαV和integrinα1單克隆抗體均購(gòu)自博士德公司，兔抗人總FAK抗體、兔抗人磷酸化FAK 397位點(diǎn)(p-FAKTyr397)抗體、兔抗人磷酸化FAK 576/577位點(diǎn)(p-FAK pY576/577) 抗體、兔抗人磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體和辣根過(guò)氧化物酶(HRP) 標(biāo)記的羊抗兔Ig G(H + L) 二抗均購(gòu)自Cell Signaling 公司。FITC-Phalloidin和DAPI均購(gòu)自Sigma公司。十二烷基硫酸鈉(SDS)、甘氨酸、二硫蘇糖醇(DTT) 以及RIPA裂解液、BCA 法蛋白質(zhì)定量測(cè)定試劑盒、電場(chǎng)組裝相關(guān)材料(3140膠，Dow Corning硅酮膠、萬(wàn)用電表、電線、銅絲、銀絲、2 mL空針、蓋玻片、細(xì)胞培養(yǎng)皿) 均購(gòu)自溶海生物公司。DYY-2C 型直流電泳儀(北京六一儀器廠)，E200 光 學(xué) 顯 微 鏡 (Nikon公司)，Quantity one 凝膠成像儀(Bio-Rad 公司) 。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 滋養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)及加電 具體操作方法同文獻(xiàn)[5]所述。在本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)培養(yǎng)小室內(nèi)HTR-8/SVneo細(xì)胞以150 mV/mm微電場(chǎng)分別刺激5、10和15 h作為實(shí)驗(yàn)組，F(xiàn)AK的活化水平檢測(cè)電刺激時(shí)間分別為5、10、30、60 min。以同樣培養(yǎng)條件下不加電組作為對(duì)照組。加電完成后收集細(xì)胞，BCA法測(cè)定蛋白濃度。

1.2.2 Western blot 具體操作方法同文獻(xiàn)[6]所述。此次 Western blot 時(shí)蛋白質(zhì)上樣量均為30μg，經(jīng)10% SDS-PAGE 70 V 恒壓電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，50 g/L 脫脂奶粉震蕩封閉1 h，然后分別加入兔抗人integrinα1、integrinα5、integrinαV和integrinα1抗體(均為 1∶500稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜，清洗，HRP 標(biāo)記的羊抗兔Ig G(H + L) 二抗(1∶1 000 稀釋) 室溫震蕩孵育2 h，清洗，化學(xué)發(fā)光ECL顯色試劑盒顯色，放入凝膠成像儀掃描顯色條帶并拍照存檔，Quantity one 軟件分析計(jì)算各條帶的灰度比值，以GAPDH 或總FAK表達(dá)量作為內(nèi)參照。整合素相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/GAPDH 灰度值，F(xiàn)AK相對(duì)活化值=FAK磷酸化灰度值/FAK總灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 微電場(chǎng)對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移行為的影響 課題組前期研究結(jié)果顯示[5～7]，在含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中應(yīng)用150 mV/mm的直流電場(chǎng)刺激滋養(yǎng)細(xì)胞，滋養(yǎng)細(xì)胞呈現(xiàn)特定的應(yīng)答反應(yīng)，比如，細(xì)胞由正極向負(fù)極定向遷移，經(jīng)不同遷移時(shí)間統(tǒng)計(jì)分析，滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移距離和遷移速度明顯高于同樣條件下未加電場(chǎng)刺激的對(duì)照組細(xì)胞(P= 0.021)。在電場(chǎng)分別刺激10 h后，滋養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯改變，比如胞體明顯拉伸延長(zhǎng)，且隨電刺激時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞縱軸/橫軸比值增大。對(duì)胞內(nèi)骨架蛋白和細(xì)胞核分別用FITC- Phalloidin和DAPI染色后結(jié)果顯示，電場(chǎng)刺激后滋養(yǎng)細(xì)胞骨架蛋白F-actin逐漸由無(wú)序隨機(jī)排列轉(zhuǎn)為垂直于電場(chǎng)方向排列，未加電場(chǎng)刺激組細(xì)胞遷移方向隨機(jī)，無(wú)上述反應(yīng)，見(jiàn)圖1。

圖1 微電場(chǎng)對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移行為的影響 a：電刺激前細(xì)胞形態(tài)；b：電刺激10 h后細(xì)胞垂直于電場(chǎng)方向排列；c：電刺激前細(xì)胞熒光染色圖；d：電刺激后細(xì)胞熒光染色圖

2.2 微電場(chǎng)對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移/侵襲相關(guān)FAK磷酸化活性的影響 研究表明，F(xiàn)AK在介導(dǎo)整合素與胞內(nèi)信號(hào)通路活化中起著關(guān)鍵性作用。本研究采用western blot 對(duì)微電場(chǎng)刺激滋養(yǎng)細(xì)胞胞內(nèi)FAK的活化水平進(jìn)行了檢測(cè)。首先對(duì)FAK的主要磷酸化位點(diǎn)，即自主磷酸化FAK Tyr397位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，該位點(diǎn)對(duì)電場(chǎng)反應(yīng)迅速，于5 min內(nèi)開(kāi)始出現(xiàn)磷酸化，在10、30、60 min各時(shí)間點(diǎn)磷酸化水平迅速升高，條帶灰度值與總FAK相比分別為(4.76±0.04)、(6.89±0.05)、(9.20±0.10)、(10.21±0.10)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為2.34、3.67、5.01、5.96，均P< 0.05)。此外，我們還對(duì)FAK另一個(gè)活化位點(diǎn) FAK pY576/577位點(diǎn)磷酸化水平也進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，在上述對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)該位點(diǎn)磷酸化相對(duì)表達(dá)量分別為(0.91±0.02)、(1.25±0.03)、(1.26±0.03)、(1.29 ± 0.04)、(1.31 ± 0.05)，總FAK及GAPDH表達(dá)水平在兩組內(nèi)及組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。在常氧和缺氧條件下微電場(chǎng)對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移/侵襲相關(guān)FAK磷酸化活性的影響結(jié)果相似，見(jiàn)圖2。

2.3 微電場(chǎng)對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞表面整合素integrin表達(dá)的影響 整合素對(duì)于細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)傳導(dǎo)具有重要作用。已有研究顯示，滋養(yǎng)細(xì)胞表面integrin的活化可以通過(guò)激活胞內(nèi)FAK而影響細(xì)胞的遷移/侵襲功能。本研究應(yīng)用Western blot對(duì)微電場(chǎng)刺激下滋養(yǎng)細(xì)胞integrin α1﹑α5﹑αV 和β1的表達(dá)分別進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，微電場(chǎng)刺激滋養(yǎng)細(xì)胞5、10和15 h后未見(jiàn)上述相關(guān)分子在各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)水平發(fā)生明顯改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。見(jiàn)圖3。E代表加電組，C代表對(duì)照組。

圖3 微電場(chǎng)刺激對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞integrinα1，α5，αV和β1的表達(dá)影響

3 討論

現(xiàn)有研究表明[7～10]，妊娠胚胎植入早期，滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖、分化、侵入子宮蛻膜和血管是胚胎著床及胎盤形成過(guò)程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲能力受到精確地調(diào)控，過(guò)強(qiáng)可能與滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤發(fā)生有關(guān)，過(guò)弱則可能導(dǎo)致一系列產(chǎn)科異常結(jié)局，因此，絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞適度地侵入子宮內(nèi)膜是維持妊娠和胎兒發(fā)育的重要前提條件。

滋養(yǎng)細(xì)胞侵入子宮內(nèi)膜由粘附、定植、降解細(xì)胞外基質(zhì)等環(huán)節(jié)構(gòu)成。整合素是細(xì)胞表面一種由α和β兩種亞基構(gòu)成的異二聚體，是重要的粘附分子和跨膜蛋白大家族，可將胞外的基質(zhì)分子與細(xì)胞內(nèi)的骨架蛋白連接起來(lái)形成焦點(diǎn)粘附物，構(gòu)成整合素信號(hào)傳導(dǎo)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[8～10]，整合素在滋養(yǎng)層細(xì)胞的表達(dá)具有顯著的時(shí)空分布性，且滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲過(guò)程可能與滋養(yǎng)層細(xì)胞膜上的特異性整合素的表達(dá)密切相關(guān)。Furmento等[8]發(fā)現(xiàn)，粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF) 能通過(guò)上調(diào)β1整合素的表達(dá)，活化胞內(nèi)PI3K 和 MAPK 信號(hào)通路從而介導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移功能；Lim等[9]發(fā)現(xiàn)，垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因-1可通過(guò)整合素/Rho家族信號(hào)通路調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲功能；Liao等[10]發(fā)現(xiàn)，β-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶III可通過(guò)糖基化修飾β1整合素從而抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲功能；而劉萬(wàn)錢等[11]發(fā)現(xiàn)整合素β1參與了滋養(yǎng)層細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附并調(diào)控了滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移行為。本研究發(fā)現(xiàn)微電場(chǎng)刺激能促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞向負(fù)極定向遷移，但未發(fā)現(xiàn)微電場(chǎng)刺激促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移功能與細(xì)胞表面整合素β1以及α1、α5和αV的表達(dá)水平密切相關(guān)，說(shuō)明微電場(chǎng)刺激促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移/侵襲功能可能通過(guò)非整合素途徑來(lái)完成。關(guān)于細(xì)胞在直流微電場(chǎng)中定向遷移的機(jī)理，迄今尚未完全闡明。一些特定細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，可能與細(xì)胞在電場(chǎng)作用下其胞膜生長(zhǎng)因子受體表達(dá)和分布發(fā)生改變有關(guān)，如角膜上皮細(xì)胞在電場(chǎng)中遷移與表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β受體(TGF-βR)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(FGFR)等聚集在細(xì)胞遷移方向的陰極側(cè)，引起下游的信號(hào)通路活化，從而促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生定向移動(dòng)[12，13]有關(guān)。直流微電場(chǎng)誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞定向遷移/侵襲功能是否也與細(xì)胞表面特定生長(zhǎng)因子受體的重新分布及相關(guān)信號(hào)通路的活化有關(guān)或有其他機(jī)制參與，值得進(jìn)一步研究。

FAK是一種非受體蛋白酪氨酸激酶，參與滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲能力的調(diào)節(jié)，在生長(zhǎng)因子和整合素介導(dǎo)的細(xì)胞黏附和遷移以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起著關(guān)鍵的作用[5～7]。本課題組前期研究結(jié)果表明[5～7]，微電場(chǎng)刺激能促進(jìn)常氧及缺氧培養(yǎng)條件下滋養(yǎng)細(xì)胞胞內(nèi)FAK Tyr397 位點(diǎn)于5 min內(nèi)磷酸化水平迅速升高，隨加電時(shí)間延長(zhǎng)，60 min內(nèi)各時(shí)間檢測(cè)點(diǎn)磷酸化水平逐漸加強(qiáng)，而對(duì)FAK另一活化位點(diǎn)FAK pY 576/577位點(diǎn)則影響不明顯。不同濃度FAK抑制劑PF-573 228作用于滋養(yǎng)細(xì)胞后，微電場(chǎng)刺激下滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移/侵襲功能受到不同程度地抑制，提示微電場(chǎng)可能主要通過(guò)介導(dǎo)FAK Tyr397 位點(diǎn)發(fā)生自主磷酸化而激活下游信號(hào)分子。關(guān)于FAK在滋養(yǎng)細(xì)胞遷移/侵襲中的作用早已被廣泛證實(shí)，如Tang等[14]發(fā)現(xiàn)環(huán)孢素A 可通過(guò)活化FAK 通路從而促進(jìn)人滋養(yǎng)細(xì)胞的體外遷移生長(zhǎng)；張曦倩等[15]發(fā)現(xiàn) FAK 可通過(guò)調(diào)節(jié)ERK信號(hào)通路從而介導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲作用；而在人鱗癌細(xì)胞系(SSc)的研究也發(fā)現(xiàn)，整合素β1能通過(guò)FAK磷酸化而激活MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)細(xì)胞的遷移，這些發(fā)現(xiàn)都與我們的研究結(jié)果基本一致。但是，我們的研究未發(fā)現(xiàn)微電場(chǎng)刺激下整合素β1以及α1、α5和αV的表達(dá)水平與FAK的活化存在必然聯(lián)系。鑒于FAK的活化存在非整合素途徑，我們推測(cè)微電場(chǎng)刺激對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞FAK的活化可能通過(guò)非整合素途徑實(shí)現(xiàn)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

在FAK上游除了整合素及其它一些已知的信號(hào)環(huán)節(jié)有所報(bào)道外，尚有很多較詳細(xì)的信號(hào)調(diào)控點(diǎn)及其相關(guān)功能尚未闡明，微電場(chǎng)調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞遷移/侵襲功能的上游機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

[1] Wu SY，Hou HS，Sun YS，et al.Correlation between cell migration and reactive oxygen species under electric field stimulation[J].Biomicrofluidics，2015，9(5)：54120.

[2] Fei L，Tunan C，Shengli H，et al.Superoxide Mediates Direct Current Electric Field Induced Directional Migration of Glioma Cells through the Activation of AKT and ERK[J].PLOS ONE，2013，8(4)：e61195.

[3] Bai H，F(xiàn)orrester JV，Zhao M.DC electric stimulation up regulates angiogenic factors in endothelial cells through activation of VEGF receptors[J].Cytokine，2011，55(1)：110-115.

[4] Zhao M，Chalmers L，Cao L，et al.Electrical signaling in control of ocular cell behaviors[J].Prog Retin Eye Res，2012，31(1)：65-88.

[5] 張娟，李明勇，賀元，等.微電場(chǎng)對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移/侵襲相關(guān)MMPs/TIMPs表達(dá)的影響[J].重慶醫(yī)學(xué)雜志，2016，45(7)：869-872.

[6] 張娟，李明勇，賀元，等.微電場(chǎng)通過(guò)活化粘著斑激酶信號(hào)通路促進(jìn)缺氧培養(yǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移/侵襲[J].臨床檢驗(yàn)雜志，2015，33(11)：813-817.

[7] Zhang J，Ren RM，Luo XF，et al.A Small Physiological Electric Field Mediated Responses of Extravillous Trophoblasts Derived from HTR8/SVneo Cells：Involvement of Activation of Focal Adhesion Kinase Signaling[J].PLOS ONE，2014，3(9)：e92252.

[8] Furmento VA，Marino J，Blank VC，et al.Granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) upregulates β1 integrin and increases migration of human trophoblast Swan 71 cells via PI3K and MAPK activation[J].Exp Cell Res，2016，342(2)：125-134.

[9] Lim SM，Jang HY，Lee JE，et al.Alteration of Pituitary Tumor Transforming Gene-1 Regulates Trophoblast Invasion via the Integrin/Rho-Family Signaling Pathway[J].PLoS One，2016，11(2)：e0149371.

[10]Liao WC，Liu CH，Chen CH，et al.α-1，4-Galactosyltransferase III suppresses extravillous trophoblast invasion through modifying β1-integrin glycosylation[J].Placenta，2015，36(4)：357，364.

[11]劉萬(wàn)錢，管章委，鄧小燕，等.整合素β1對(duì)人體滋養(yǎng)層細(xì)胞黏附和遷移行為的影響[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2010，27(1)：67-70.

[12]Zhao M，Pu J，F(xiàn)orrester JV，et al.Membrane lipids，EGF receptors，and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field[J].Faseb J，2002，16(8)：857-859.

[13]Forrester JV，Lois N，Zhao M，et al.The Spark of Life：the role of electric fields in regulating cell behaviour using the eye as a model system[J].Ophthalmic Res，2007，39(1)：4-16.

[14]Tang CL，Zhao HB，Li MQ，et al.Focal adhesion kinase signaling is necessary for the Cyclosporin A-enhanced migration and invasion of human trophoblast cells[J].Placenta，2012，33(9)：704-711.

[15]張曦倩，陳士嶺，邢福祺.黏著斑激酶對(duì)ERK 介導(dǎo)的滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲行為的調(diào)節(jié)作用[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2011，36(6)：559-564.

Micro-electrical field may activate FAK through non-integrin pathway to promote trophoblast cells migration/invasion

ZHANGJuan1，LIMing-yong1，HEYuan1，BAIHuai2，F(xiàn)ANPing2
(1.ClinicalLaboratory，SichuanAcademyofMedicalScience&SichuanProvincialPeople’sHospital，Chengdu610072，China； 2.WestChinaSecondHospitalSchoolofClinicalMedicineSichuanUniversity，Chengdu610041，China)

Objective To investigate whether the effect of physiological micro-electrical field on migration/invasion of trophoblast cells in vitro was associated with integrins expression of the cells.Methods The trophoblast cells were exposed to the direct current electrical field (DC-EF) at 150 mV/mm for 5，10 and 15 hours.Cell images and migration distance were recorded with continuous photographing and analyzed by image analyzer.The activation of FAK at 5，10，30 and 60 min of DC-EF stimulation were measured and the expression levels of integrinα1，integrinα5，integrinαV and integrinα1 were detected by using Western blot assay.Results The application of 150 mV/mm DC electrical stimulation，trophoblast cells cultured in media containing 10% calf serum showed a cathode migration.The migration velocity and distance were obviously increased when compared to the control group without EF stimulation (P= 0.021).The cells exposed to the EF also showed elongation and perpendicular orientation，while control cells that were not subjected to EF showed no such responsiveness.Compared with the non-EF stimulation controls，trophoblasts under EF stimulation had a quickly activation of FAKTyr397 location within 60 min (P< 0.05)，while no significant changes in expressions of integrinα1，integrinα5，integrinαV and integrinα1 were observed (P> 0.05).Conclusion The physiological direct current electrical field may activate FAK by non-integrin pathway to promote trophoblast cell migration/invasion function.However，its detailed mechanism needs further studies.

Electrical field，EF； Trophoblast cells； Integrin； Focal adhesion kinase，F(xiàn)AK； Migration/invasion

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：30872774/H0418)：四川省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：140071、16PJ469)；四川省人民醫(yī)院博士基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：2015BS18)

R394.2

A

1672-6170(2017)03-0020-04

2016-09-23；

2016-11-24)