劉秀英,李伊涵,李巧素,朱力杰,高 雪,湯軼偉,勵(lì)建榮

(渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013)

基于納米金標(biāo)記-適配體識(shí)別對(duì)魚(yú)中磺胺二甲氧嘧啶的定量檢測(cè)

劉秀英,李伊涵,李巧素,朱力杰,高 雪,湯軼偉,勵(lì)建榮

(渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013)

納米金因具有獨(dú)特的光學(xué)效應(yīng),已成為極具應(yīng)用前景的標(biāo)記材料。適配體對(duì)目標(biāo)分子具有較強(qiáng)特異識(shí)別能力,被廣泛應(yīng)用于分析檢測(cè)領(lǐng)域。本文利用納米金標(biāo)記適配體,構(gòu)建了一種磺胺二甲氧嘧啶的可視化檢測(cè)新方法。利用該方法對(duì)磺胺二甲氧嘧啶進(jìn)行定量分析,在添加水平分別為2、7 ng/mL下,測(cè)得回收率為89.86%和85.64%,日內(nèi)日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.00%、5.28%和5.88%、6.67%。方法的檢測(cè)線性范圍為1～10 ng/mL,檢測(cè)限為1 ng/mL。以上結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度高,精密度好,將其應(yīng)用于鱸魚(yú)、鯰魚(yú)等實(shí)際水產(chǎn)樣品中磺胺二甲氧嘧啶的定量分析具有可行性。

適配體,納米金,磺胺二甲氧嘧啶,定量檢測(cè),水產(chǎn)品

磺胺二甲氧嘧啶(Sulfadimethoxine,SDM),化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。該藥物屬于人工合成的廣譜抗菌藥,是磺胺類藥物中殘留超標(biāo)的主要品種,廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中。長(zhǎng)期低劑量攝入該藥物,可導(dǎo)致慢性中毒,影響機(jī)體的泌尿和免疫系統(tǒng),甚至誘發(fā)甲狀腺癌,嚴(yán)重威脅人類健康[1-2]。隨著SDM的廣泛使用,國(guó)際上許多國(guó)家和地區(qū)都制定了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn),并且對(duì)最高殘留限量的要求也越來(lái)越嚴(yán)格[3-4]。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)SDM的檢測(cè)手段包括HPLC、HPLC-MS等儀器法[5-8],但這些方法所需設(shè)備昂貴、對(duì)操作技術(shù)人員要求較高,不能滿足快速檢測(cè)的需求。近年來(lái)免疫分析方法也有報(bào)道[9],但傳統(tǒng)生物抗體生產(chǎn)周期較長(zhǎng),且保存條件嚴(yán)格,在一定程度上制約了該技術(shù)的應(yīng)用。適配體(Aptamer)是利用體外篩選技術(shù)從核酸分子文庫(kù)中得到的一類單鏈寡核苷酸片段(DNA或RNA)。與抗體相比,適配體具備篩選化學(xué)穩(wěn)定性好,易于修飾、合成成本低等優(yōu)點(diǎn)。更重要的是,其能與靶分子發(fā)生特異性結(jié)合,且親和力高、特異性強(qiáng)[10-11]。作為一種新型生物分子探針,適配體在醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)以及生物分析等領(lǐng)域獲得了快速應(yīng)用和發(fā)展[12-15]。此外,納米金具有制備過(guò)程簡(jiǎn)單、生物相容性好、易于標(biāo)記等諸多優(yōu)點(diǎn)。特別是納米金的粒子間距光學(xué)效應(yīng),在分散狀態(tài)下呈紅色,發(fā)生凝聚后變?yōu)樗{(lán)色,且該效應(yīng)可見(jiàn)度極高,使其在比色分析領(lǐng)域發(fā)展迅速[16-19]。研究中利用納米金特有的粒子間距光學(xué)效應(yīng)為傳感信號(hào),以SDM-aptamer為識(shí)別元件,構(gòu)建一種高靈敏比色檢測(cè)法用于SDM的定量測(cè)定。所構(gòu)建方法檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)單,與儀器法和免疫分析法相比,檢測(cè)成本低,為SDM的高靈敏度檢測(cè)提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

研究中所用的鱸魚(yú)和鯰魚(yú) 均購(gòu)自于當(dāng)?shù)氐乃a(chǎn)市場(chǎng)；SDM-aptamer 委托上海生物工程有限公司合成,序列為:GAGGGCA ACGAGTGTTTATAGA[20]。氯金酸 成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司;磺胺二甲氧嘧啶(CAS:122-11-2,純度 99%) 上海阿拉丁試劑有限公司;檸檬酸鈉、氯化鈉等化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

TU-1801型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;DF-101D型集熱式磁力加熱攪拌器 河南鞏義市予華儀器廠。

1.2 檢測(cè)原理

檢測(cè)原理如圖2所示。本研究中的納米金是采用檸檬酸鈉還原氯金酸的方法制備得到的,因此在納米金粒子表面存在大量的檸檬酸根離子,由于靜電排斥力作用,納米金不會(huì)發(fā)生凝聚而呈現(xiàn)紅色[21]。而高濃度鹽溶液會(huì)破壞納米金溶液的穩(wěn)定性,使其發(fā)生凝聚,由于納米金的顏色具有光距離依賴特性,粒子間距縮小導(dǎo)致溶液顏色發(fā)生變化,由紅色變?yōu)樗{(lán)色。單鏈DNA能夠附著在納米金表面,進(jìn)而可以有效防止納米金顆粒在高濃度鹽溶液中發(fā)生凝聚,使溶液保持紅色[22]。因此,在向反應(yīng)體系加入氯化鈉溶液之前,預(yù)先加入SDM-aptamer,可以有效防止溶液顏色發(fā)生變化。然而當(dāng)反應(yīng)體系中存在被測(cè)物SDM時(shí),由于SDM能夠與 SDM-aptamer特異性識(shí)別結(jié)合,同時(shí)SDM-aptamer的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,使SDM-aptamer從納米金表面脫落。部分納米金失去SDM-aptamer保護(hù)后,暴露于氯化鈉溶液中,發(fā)生聚集,顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)色。加入的靶標(biāo)分子的濃度不同,納米金聚集的程度不同,導(dǎo)致納米金呈現(xiàn)不同顏色的變化,從而實(shí)現(xiàn)可視化的定量檢測(cè)。

圖2 檢測(cè)原理示意圖Fig.2 Schematic diagram of detection principle

1.3 納米金的制備

參考MAYE等的方法稍作改進(jìn)[23]。具體步驟:將50 mL濃度為2 mmol/L的氯金酸溶液置于100 ℃集熱式磁力攪拌器中加熱10 min后,加入5 mL濃度為38.8 mmol/L檸檬酸鈉溶液,繼續(xù)在100 ℃下劇烈攪拌反應(yīng)20 min,溶液變紅,取出反應(yīng)液室溫放冷,得到納米金溶液。

1.4 磺胺二甲氧嘧啶的檢測(cè)

分別取100 μL SDM-aptamer與50 μL不同濃度的SDM溶液,室溫下孵育5 min后,加入100 μL納米金溶液,繼續(xù)反應(yīng)5 min后,加入10 μL濃度為1 mol/L氯化鈉溶液,充分混合后再孵育5 min,最后吸取最終反應(yīng)液200 μL于微量比色皿中,用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)450～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)吸光度值的變化計(jì)算SDM的濃度。

1.5 實(shí)際水產(chǎn)樣品的測(cè)定

樣品前處理參照農(nóng)業(yè)部958號(hào)公告-12-2007的方法并進(jìn)行了一定改進(jìn)[24]。稱取一定量樣品于離心管中,加乙酸乙酯,渦旋提取10 min,4000 r/min離心5 min,收集上清液,重復(fù)提取一次,合并兩次提取液。將提取液濃縮至5 mL。向濃縮后的樣品溶液中加入正己烷5 mL,渦旋混和30 s,3000 r/min離心5 min,棄正己烷,取下層液備用。樣品具體測(cè)定過(guò)程按照1.4磺胺二甲氧嘧啶的檢測(cè)中步驟進(jìn)行。

1.6 方法學(xué)考察

研究對(duì)所建立方法的線性范圍進(jìn)行考察,并通過(guò)回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的測(cè)定對(duì)方法的準(zhǔn)確度與精密度進(jìn)行評(píng)價(jià)。數(shù)據(jù)主要是通過(guò)Origin8軟件進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米金的表征

納米金隨其直徑大小不同可以呈現(xiàn)紅色至藍(lán)色的不同顏色變化,因此合成粒徑均勻的金納米粒子是關(guān)鍵。本研究利用掃描電子顯微技術(shù)對(duì)合成的納米金粒子進(jìn)行表征,結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖可知,在放大倍率為2萬(wàn)倍時(shí)觀察發(fā)現(xiàn),制備得到的納米金是具有單分散性的近正圓形納米顆粒。此外,隨機(jī)選取10個(gè)顆粒測(cè)定其粒徑,計(jì)算金納米粒子的平均粒徑為(0.24±0.05) μm。

表1 SDM定量測(cè)定的準(zhǔn)確度和精密度評(píng)價(jià)

圖3 納米金的掃描電鏡圖像Fig.3 SEM image of gold nanoparticle

注：測(cè)得量用平均值±SD表示。2.2 SDM的定量測(cè)定

2.2.1 線性范圍 當(dāng)體系中含有目標(biāo)分子SDM,SDM-aptamer優(yōu)先與SDM結(jié)合,使部分納米金失去SDM-aptamer的保護(hù)而發(fā)生凝聚。SDM的濃度不同,導(dǎo)致納米金凝聚程度也不同。如圖4所示,在波長(zhǎng)530 nm處的特征峰值最大的光譜曲線為未加入SDM時(shí)納米金(Aunp)的掃描結(jié)果。隨著加入SDM的濃度不斷增大(從上至下分別為1、2、4、7、10 ng/mL),納米金凝聚程度也越大,在波長(zhǎng)530 nm處的特征峰值逐漸減小,且吸光值之比隨著SDM的濃度的增加呈現(xiàn)規(guī)律性地變化。以加入的SDM的濃度為橫坐標(biāo),以納米金溶液與對(duì)應(yīng)反應(yīng)液在波長(zhǎng)530 nm處的吸光值之比為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到該方法的線性范圍為1～10 ng/mL,線性回歸方程為y=0.2114x+1.3078 (R2=0.9909),線性關(guān)系良好,檢測(cè)限為1 ng/mL。

圖4 不同濃度下體系的紫外光譜圖Fig.4 Ultraviolet spectrogram under differdent concentration注:插圖為標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.2 方法的準(zhǔn)確度 準(zhǔn)確度是定量測(cè)定的必要條件。為了更好的了解方法的準(zhǔn)確性,研究中還利用添加回收實(shí)驗(yàn)測(cè)定了不同加標(biāo)水平下SDM的回收率值,每個(gè)水平進(jìn)行6次重復(fù)測(cè)定。結(jié)果如表1所示,在添加水平分別為2、7 ng/mL下,得到樣品的回收率值分別為89.86%和85.64%。說(shuō)明本研究中所建立的方法準(zhǔn)確度良好。

2.2.3 方法的精密度 研究中還通過(guò)計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)對(duì)方法的日內(nèi)和日間精密度進(jìn)行了評(píng)價(jià)。日內(nèi)精密度選取2、7 ng/mL兩種濃度樣品,每種濃度的樣品均進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn),根據(jù)重復(fù)測(cè)定的結(jié)果計(jì)算日內(nèi)RSD值。結(jié)果如表1所示,兩種濃度水平的日內(nèi)RSD值分別為4.00%和5.28%。日間精密度同樣選取2、7 ng/mL兩種濃度樣品,每種濃度配制6份,置冰箱中冷藏,自配制樣品之日開(kāi)始,按研究中所建立的方法操作,每天取出一份測(cè)定,計(jì)算每種濃度樣品的RSD值。兩種濃度水平的日間RSD值分別為5.88%和6.67%。日內(nèi)和日間精密度實(shí)驗(yàn)所得RSD值均在10%以內(nèi),說(shuō)明研究中所建立的方法精密度良好。

2.3 實(shí)際樣品的測(cè)定

因?yàn)镾DM作為細(xì)菌性疾病的治療藥物,被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中。像魚(yú)類等水產(chǎn)樣品基質(zhì)較復(fù)雜,為了進(jìn)一步考察該方法檢測(cè)實(shí)際樣品時(shí)的基質(zhì)效應(yīng),選取鱸魚(yú)和鯰魚(yú)兩種市場(chǎng)上常見(jiàn)魚(yú)類作為樣品,利用研究中所建立的方法進(jìn)行實(shí)際樣品檢測(cè)。測(cè)定結(jié)果如表2所示,鱸魚(yú)和鯰魚(yú)的添加回收分析得到的回收率分別為82.41%和76.96%,RSD值為4.95%和2.80%,說(shuō)明本方法可用于實(shí)際水產(chǎn)樣品中SDM的檢測(cè)分析。

表2 實(shí)際樣品中SDM的定量分析

注：測(cè)得量用平均值±SD表示。

3 結(jié)論

本研究將適配體識(shí)別技術(shù)與納米金粒子間距光學(xué)效應(yīng)相結(jié)合,建立一種新型SDM檢測(cè)方法,并綜合考察了該方法的線性范圍、準(zhǔn)確度、精密度。結(jié)果表明所建立方法線性范圍為1～10 ng/mL。通過(guò)對(duì)兩種實(shí)際水產(chǎn)樣品鱸魚(yú)和鯰魚(yú)中SDM進(jìn)行定量分析,得到回收率為82.41%和76.96%,RSD值為4.95%和2.80%,證明該方法應(yīng)用于水產(chǎn)樣品中SDM的檢測(cè)分析具有可行性。將適配體與納米金相結(jié)合的分析研究雖已有報(bào)道,但多集中于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域分析,如對(duì)溶血酶等目標(biāo)分子進(jìn)行測(cè)定,應(yīng)用于食品分析領(lǐng)域中抗菌劑測(cè)定的相關(guān)報(bào)道很少。本研究中所建立的方法為水產(chǎn)品中SDM簡(jiǎn)單、高效、低成本、可視化的定量分析提供了一種全新而且可行的思路。

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Quantitative detection of sulfadimethoxine in fish based on the recognition of gold nanoparticles labeled aptamers

LIU Xiu-ying,LI Yi-han,LI Qiao-su,ZHU Li-jie,GAO Xue,TANG Yi-wei,LI Jian-rong

(College of Food Science and Technology,Bohai University;Food Safety Key Lab of Liaoning Province; National & Local Joint Engineering Research Center of Storage,Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products,Jinzhou 121013,China)

Gold nanoparticles(Aunps)have been investigated as novel marking materials for their unique luminescent properties. Aptamer is a type of recognition materials with specific binding ability to capture target molecules and have been widely applied in the field of analysis and detection. In our study,a novel detection method for quantitative analysis of sulfadimethoxine was developed based on AuNPs and aptamer. The proposed method was applied to the analysis of real samples. The recoveries were 85.64% and 89.86%,and the relative standard deviation(RSD)values were 4.00%,5.28%,and 5.88%,6.67%,for intra-and inter-day tests,respectively. The linear range of the method was 1～10 ng/mL,and the detection limit was 1 ng/mL. The above results suggested that the proposed method was highly accurate,and precise,and was feasible for the quantification of target sulfadimethoxine in aquatic product.

aptamer;gold nanoparticles;sulfadimethoxine;quantitative detection;aquatic product

2016-10-28

劉秀英(1987-)，女，博士，講師，研究方向：食品質(zhì)量與安全，E-mail:xiuyingliu727@126.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31601510)；遼寧省農(nóng)業(yè)領(lǐng)域青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)計(jì)劃(2015001)。

TS207.3

A

1002-0306(2017)09-0281-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.09.045