龍曉燕,葉 林,蔡林軍,劉 藝

(西南科技大學生命科學與工程學院,四川綿陽 621010)

枸杞子殘渣中多糖的提取工藝研究

龍曉燕,葉 林,蔡林軍,劉 藝

(西南科技大學生命科學與工程學院,四川綿陽 621010)

以煎煮法提取枸杞子殘渣中的枸杞多糖,以提取次數(shù)、提取時間和料液比三個因素為考察因素,以枸杞多糖得率為評價指標,在單因素實驗基礎(chǔ)上采用正交實驗優(yōu)選枸杞多糖提取工藝。優(yōu)化的枸杞多糖的提取條件如下:水煎煮提取3次,每次提取40 min,料液比為1∶40 (g/mL),此條件下的枸杞多糖平均得率為10.65%。正交實驗對枸杞子殘渣中的枸杞多糖的提取條件優(yōu)化合理可行,為提高枸杞多糖的得率提供了理論依據(jù)。

枸杞子殘渣,提取工藝,多糖,正交實驗

枸杞為茄科枸杞屬植物(Lycium linn.),是茄目茄科枸杞屬植物[1],其干燥成熟的果實-枸杞子是傳統(tǒng)的滋養(yǎng)肝腎、明目中藥,在我國和其它亞洲國家應用已達2000多年[2-3]。為中國食品藥品監(jiān)督管理總局規(guī)定的既是食品又是藥品的物品。枸杞的藥用價值在我國有著悠遠的歷史,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,被列為上品,謂之:“久服堅筋骨,輕身不老,耐寒暑”?，F(xiàn)代研究表明枸杞子中的主要化學成分有多糖、類胡蘿卜素、多酚、蛋白質(zhì)、生物堿、超氧化物歧化酶等[4-5]。枸杞子殘渣是提取枸杞油后的副產(chǎn)物,常做動物飼料利用或作為藥渣直接丟棄,枸杞子殘渣中枸杞多糖含量豐富,是一種具有多種生物活性的糖蛋白。枸杞的視神經(jīng)保護作用的物質(zhì)基礎(chǔ)是枸杞多糖[6]。枸杞具有的抗缺氧、抗疲勞、防衰老、降血糖、強免疫、保護視力、抗氧化、抗癌等的藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)都與枸杞多糖密切相關(guān)[7-10]。因此,考慮從枸杞子殘渣中提取并研究枸杞多糖,變廢為寶。目前,對枸杞多糖的提取方法有水提法、堿提法、酶解提取、微波提取以及超聲提取[11-13]。但是,中藥最常用的使用方法是水煎法,盡管目前對枸杞多糖的提取研究方法中涉及水提法,其提取時間長達5.5 h[14]。枸杞作為傳統(tǒng)的補益中藥,煎煮時間以1 h左右為宜。本文采用傳統(tǒng)煎煮法提取枸杞子殘渣,通過單因素和正交實驗來探討枸杞多糖的提取工藝,為枸杞子殘渣資源綜合開發(fā)提供技術(shù)支持,同時為藥食兩用藥材枸杞子的煎煮方法提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枸杞子殘渣(為CO2超臨界萃取枸杞油后的殘渣) 青?？灯丈锕こ逃邢薰咎峁?濃硫酸、苯酚、葡萄糖、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、無水乙醇、3-5-二硝基水楊酸鈉 均購自綿陽市信捷商貿(mào)有限公司 為分析純。

RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠;SHB-ⅢS循環(huán)水式真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;HD4917電磁爐 珠海經(jīng)濟特區(qū)飛利浦家庭電器有限公司;KQ5200 B超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;DH-030(A)電熱恒溫鼓風干燥箱 上海齊欣科學儀器有限公司;X63L-6多功能分體煲 潮州市潮安區(qū)奇巧貿(mào)易有限公司;J-26XP Beckman冷凍離心機 Beckman Coulter;U-3900H分光光度計 HITACHI。

1.2 實驗方法

1.2.1 總糖的含量測定 采用苯酚-硫酸法測定溶液在490 nm處的吸光度[15]。對照品溶液的制備:取無水葡萄糖加純水制成每1 mL含0.2 mg的溶液,作為對照品溶液;標準曲線的制備:量取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,分別置具塞試管中,加純水補至2 mL,各管精密加入5%苯酚溶液1 mL,搖勻,迅速精密加入濃硫酸5 mL,搖勻,靜置10 min,冷卻至室溫,置40 ℃水浴中保溫15 min,取出,迅速冷卻至室溫,以相應的試劑為空白對照,在490 nm波長處測定吸光度,以葡萄糖濃度作為橫坐標,以吸光度為縱坐標,繪制標準曲線。

1.2.2 還原糖含量的測定 采用3,5-二硝基水楊酸比色法在540 nm處測定其吸光度[16]。3,5-二硝基水楊酸(DNS)溶液的配制:取酒石酸鉀鈉182 g,溶于500 mL純水中,加熱溶液但溫度不超過50 ℃,并依次加入6.3 g 3,5-二硝基水楊酸,21 g氫氧化鈉,5.0苯酚和5.0 g無水亞硫酸鈉,攪拌至完全溶解,冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移到1000 mL的棕色容量瓶中,并用純水定容至刻度。對照品溶液的制備:取無水葡萄糖加純水制成每1 mL含0.2 mg的溶液,作為對照品溶液。標準曲線的制備:取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,分別置具塞試管中,加純水補至1 mL,各管分別加入1 mL DNS溶液,混勻后于沸水中加熱5 min,冷卻至室溫,每管再加入8 mL純水,搖勻。以相應的試劑為空白對照,在540 nm波長處測定吸光度,以葡萄糖濃度作為橫坐標,以吸光度為縱坐標,繪制標準曲線。

1.2.4 枸杞子殘渣中枸杞多糖提取的單因素實驗及正交實驗設(shè)計 取枸杞子殘渣約20 g,于70 ℃烘干至恒重,精密稱定,按下述方法分別置于中藥煎煮鍋中提取相應的次數(shù)和時間,實驗結(jié)束時補充損失的水分。在提取料液比為1∶35 (g/mL)、提取時間30 min條件下,探究提取1、2、3、4次對枸杞多糖得率的影響;在提取料液比為1∶35 (g/mL)、提取次數(shù)為3次條件下,探究提取時間15、25、35、45、55 min對枸杞多糖得率的影響;在提取次數(shù)為3次、提取時間為30 min條件下,探究料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 (g/mL)對枸杞多糖得率的影響。

在單因素實驗的基礎(chǔ)上,依照L9(34)空一列正交實驗設(shè)計方案,對提取次數(shù)、提取時間和料液比三因素的條件進行優(yōu)化提取枸杞多糖,實驗方案如表1。

表1 煎煮法提取枸杞多糖的正交實驗因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 總糖及還原糖標準曲線

根據(jù)不同方法及不同濃度的葡萄糖標準溶液及其對應的吸光度,得到苯酚-硫酸法的回歸方程為y=6.0007x-0.0048,R2=0.9985,表明在總糖在0. 041～0.204 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。3,5-二硝基水楊酸法的回歸方程為y=1.4544x-0.0203,R2=0.9996,表明在還原糖在0. 204～1.018 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

圖1 總糖測定標準曲線Fig.1 Standard curve for total sugar determination

圖2 還原糖測定標準曲線Fig.2 Standard curve for reducing sugar determination

2.2 單因素對枸杞多糖得率的影響

2.2.1 提取次數(shù)對枸杞多糖得率的影響 從圖3可知,枸杞多糖得率隨提取次數(shù)的增多而增大,這是因為煎煮枸杞子殘渣時,枸杞多糖首先溶解在枸杞子殘渣組織的水中,再擴散到枸杞子殘渣外部的溶液中,至枸杞子殘渣內(nèi)外溶液的濃度達平衡時,枸杞多糖不再繼續(xù)溶出。這時只有將藥液濾出、重新加水,建立新的濃度差,枸杞多糖才能繼續(xù)溶出。煎煮次數(shù)少,枸杞多糖提取不完全[19]。提取次數(shù)為3次時的枸杞多糖得率為10.21%,之后隨著提取次數(shù)的增加而平緩上升,當提取次數(shù)增加到4次時,枸杞多糖得率達到最大值,為10.24%。方差分析結(jié)果表明,提取次數(shù)為3次時的枸杞多糖得率顯著(p<0.05)大于提取1次和提取2次的枸杞多糖得率。綜合考慮產(chǎn)率、能耗以及長時間加熱對枸杞多糖的影響等因素,選取提取1次、2次、3次三個水平用于正交實驗設(shè)計。

圖3 提取次數(shù)對枸杞多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction times on the rate of crude polysaccharides from Lycium barbarum residue

2.2.2 提取時間對枸杞多糖得率的影響 由圖4可以看出,當提取時間為15～35 min時,枸杞多糖得率明顯增加,這是由于當枸杞多糖濃度未達飽和時,增加煎煮時間有利于枸杞多糖的溶出。提取時間過短,枸杞多糖浸出不完全,枸杞子殘渣中的枸杞多糖轉(zhuǎn)移率低,易造成枸杞子殘渣的浪費。隨著枸杞多糖提取時間的延長,枸杞多糖大分子就有充分的時間從枸杞子殘渣中擴散到水溶液中。當提取時間為35～55 min時,枸杞多糖得率增加平緩。方差分析結(jié)果表明,提取時間為35 min時的枸杞多糖得率顯著(p<0.05)高于提取30 min。再延長提取時間,對枸杞多糖的得率趨于平穩(wěn)。故選取提取35、40、45 min三個水平用于正交實驗設(shè)計。

圖4 提取時間對枸杞多糖得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the rate of crude polysaccharides from Lycium barbarum residue

2.2.3 料液比對多枸杞多糖得率的影響 中藥浸出成分的擴散速度符合Ficks 第一擴散定律[dM/dt=-D·S(dC/dX)],式中dM/dt為擴散速度(一定時間內(nèi)物質(zhì)擴散的量),dt為擴散時間,S為擴散面積,D 為擴散系數(shù),dC/dX為濃度梯度[19]。在枸杞多糖的提取過程中,枸杞子殘渣中枸杞多糖的dC/dX不斷減小,而藥液中枸杞多糖濃度逐漸升高,直至枸杞子殘渣中枸杞多糖濃度與藥液中枸杞多糖濃度達平衡狀;但如果水的用量過多,會造成枸杞多糖的生產(chǎn)成本升高,也給枸杞多糖提取液的濃縮造成了困難。故控制水的用量很關(guān)鍵。由圖5可以看出,料液比對枸杞多糖得率的影響較大。在料液比為1∶15～1∶30范圍內(nèi),枸杞多糖的得率從3.68%迅速增大到9.71%,到了1∶30 (g/mL)以后趨于平穩(wěn)。方差分析結(jié)果表明,料液比為1∶30時,枸杞多糖的得率顯著(p<0.05)大于料液比為1∶25的枸杞多糖得率。故選取料液比為1∶30、1∶35和1∶40三個水平用于正交實驗設(shè)計。

圖5 料液比對枸杞多糖得率的影響Fig.5 Effect of solid to liquid ratio on the rate of crude polysaccharides from Lycium barbarum residue

2.3 煎煮法提取枸杞多糖正交實驗及結(jié)果分析

煎煮法提取枸杞多糖的最佳工藝條件。選取因素及實驗結(jié)果見表2。從表2中分析得出,三種考察因素對枸杞多糖得率影響的大小順序為:A>C>B,即提取次數(shù)對于枸杞多糖得率影響最大,料液比影響次之,提取時間影響相比較而言較小。由實驗的結(jié)果可以確定主要的影響參數(shù)A3B2C3,即提取3次,提取時間40 min,提取料液比1∶40 (g/mL)。

表2 煎煮法提取枸杞多糖正交實驗因素及實驗結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

從表3的方差分析可知,只有提取次數(shù)一項因素對枸杞多糖得率的影響達到顯著性(p<0.05)性水平,表明選定的提取時間和料液比水平對枸杞多糖的得率沒有顯著影響,考慮實際操作成本,選取提取時間為30 min,料液比為1∶30 (g/mL)。

2.4 驗證實驗

經(jīng)極差分析,當組合為A3B2C3,即提前次數(shù)為3次,提取時間為40 min,料液比為1∶40 (g/mL)時,枸杞多糖的得率最大,由于最佳工藝條件未出現(xiàn)在正交實驗表之中,故按上述工藝條件進行驗證,計算得出枸杞多糖得率為10.65%±0.21%。

從生產(chǎn)考慮,可選擇提取3次,每次30 min,料液比為1∶30 (g/mL)的工藝進行驗證后,計算得出枸杞多糖得率為:9.71%±0.37%。

3 結(jié)論

本實驗通苯酚-硫酸法和3,5-二硝基水楊酸法測定并計算枸杞多糖的得率,通過單因素實驗找到提取次數(shù)、提取時間、料液比的最佳提取參數(shù),再利用正交實驗進行了優(yōu)化。由正交實驗結(jié)果可知,在影響枸杞多糖提取的三個因素中,其影響大小依次為提取次數(shù),料液比,提取時間,其中提取次數(shù)對實驗結(jié)果有顯著影響。最終確定的提取條件為提取3次,提取時間40 min,提取料液比1∶40 (g/mL)。在此提取條件下,枸杞多糖得率為10.65%。本實驗可以為枸杞殘渣資源綜合開發(fā)提供依據(jù),為枸杞殘渣的再利用提供理論支持,同時為藥食兩用藥材枸杞的煎煮方法提供了科學依據(jù)。

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Extraction of polysaccharide inLyciumbarbarumresidue

LONG Xiao-yan,YE Lin,CAI Lin-jun,LIU Yi

(School of Life Science and Engineering,Southwest University of Science and Technology,Mianyang 621010,China)

The aim of this study was to investigate the effect of extraction times,extraction time and solid to liquid ration on the extraction rate of crude polysaccharides fromLyciumbarbarumresidue(PLB). An orthogonal test was used to confirm the optimal extractive parameters based on the single factor experiments. The results of the optimum extraction conditions were as follows:number of extraction of 3 times,extraction-duration of 40 min every time,water to raw material ratio at 1∶40 (g/mL). The average extraction rate for the polysaccharide was 10.65%. The optimization of PLB was reasonable and feasible. The results provide the theoretical base for improvement of PLB extraction rate.

Lyciumbarbarumresidue;extraction technology;polysaccharide;orthogonal experiment

2016-11-14

龍曉燕(1974-),女,博士研究生,副教授,研究方向:天然產(chǎn)物的研究與開發(fā),E-mail:longxiaoyan@swust.edu.cn。

TS255.1

B

1002-0306(2017)09-0248-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.09.038