許 芳,吳雨龍,王俏娜,付愛葉,汪振炯,王仁雷,華 春,*

(1.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 210046; 2.南京曉莊學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 211171; 3.江蘇第二師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)化工學(xué)院，江蘇南京 210013)

超聲波協(xié)同酶法提取菊苣根多糖工藝優(yōu)化

許 芳1,2,吳雨龍2,王俏娜2,付愛葉1,2,汪振炯2,王仁雷3,華 春2,*

(1.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 210046; 2.南京曉莊學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 211171; 3.江蘇第二師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)化工學(xué)院，江蘇南京 210013)

目的:優(yōu)化超聲波協(xié)同酶法提取菊苣根多糖的工藝條件。方法:采用中心組合設(shè)計(jì)方法(Box-Behnken Design),建立以超聲溫度、超聲時(shí)間、加酶量、酶解時(shí)間和液料比對菊苣根多糖得率的影響的二次回歸模型。結(jié)果:菊苣根多糖提取的最佳工藝條件為超聲溫度45 ℃、超聲時(shí)間35 min、加酶量1.6%、酶解時(shí)間1.8 h、液料比44∶1 (mL/g),在此條件下,菊苣根多糖的得率為46.75%,與預(yù)測得率47.71%接近。結(jié)論:該回歸模型有極顯著性,可以作為菊苣根多糖提取工藝的回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。

菊苣根,多糖,超聲波,纖維素酶,中心組合設(shè)計(jì)方法

菊苣(CichoriumintybusL.)為菊科菊苣屬多年生藥食兩用草本植物,根肉質(zhì)、短粗。菊苣主要分布在歐洲、亞洲、北非,我國北京、遼寧、新疆、江西等省市也有分布[1],是維吾爾族和蒙古族常用藥材。菊苣根富含多糖、生物堿、萜類等多種生物活性物質(zhì)[2-5],而菊苣多糖在降血糖[6-7]、降血脂[8]、抗氧化[9]、保肝[10]、延緩衰老[11-12]、提高機(jī)體免疫力[14]等方面都表現(xiàn)出了較好的生物活性。陳立閣等[13]更是發(fā)現(xiàn)奇可力多糖(菊苣多糖)具有抗腫瘤作用,主要體現(xiàn)在菊苣多糖能明顯抑制S180荷瘤小鼠腫瘤的生長,延長S180荷瘤小鼠的生存時(shí)間,另對肝癌、胃癌細(xì)胞生長亦具有一定抑制作用。菊苣多糖的開發(fā)與應(yīng)用也已成為食品、醫(yī)藥、生物工程等領(lǐng)域的重要研究方向。

關(guān)于植物多糖的提取方法有很多種,如熱水浸提法、酸提、堿提、超濾膜法提取、CO2超臨界萃取法等,但傳統(tǒng)的熱水浸提法提取的效率較低且耗時(shí);酸提法和堿提法的酸堿度和作用時(shí)間需嚴(yán)格控制,否則會(huì)引起多糖的糖苷鍵斷裂,影響多糖的提取率;超濾膜法必須知道多糖的相對分子質(zhì)量,對于未知的多糖則無法控制;CO2超臨界萃取法成本相對較高。目前,菊苣多糖的提取通常采用熱水浸提法[15],近年來還出現(xiàn)了超聲波提取法、微波提取法以及膜分離集成技術(shù)等[16-17],但有關(guān)超聲波協(xié)同酶法提取菊苣根多糖的研究尚未見報(bào)道。超聲波法在植物活性成分提取中具有提高提取率,縮短提取時(shí)間,增強(qiáng)提取物活性,節(jié)約能源等優(yōu)勢,具有常規(guī)提取方法難以達(dá)到的提取效果[18]。植物細(xì)胞的細(xì)胞壁主要由纖維素組成,而植物細(xì)胞中的活性成分被包裹在細(xì)胞壁內(nèi),利用纖維素酶特異性水解纖維素,破壞細(xì)胞壁,有利于胞內(nèi)活性成分溶出,從而提高了植物活性成分的提取率[19]。有研究表明,在植物多糖的提取中,超聲波與纖維素酶同時(shí)使用,具有協(xié)同作用,能顯著提高多糖的提取率[20]。本實(shí)驗(yàn)利用中心組合設(shè)計(jì)方法(Box-Behnken Design),采用五因素三水平的響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化了超聲波協(xié)同酶法提取菊苣根多糖的工藝條件,不僅大大的提高了菊苣根多糖的得率,降低了成本,而且不影響菊苣根多糖的結(jié)構(gòu)與生物活性,為合理開發(fā)利用菊苣資源,提高其附加值以及綜合應(yīng)用提供可靠的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菊苣根 黃石市潤生農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司,烘干后粉碎備用；纖維素酶(酶比活力>400 U/mg) 南京奧多福尼生物科技有限公司;其它試劑均為分析純。

超聲波清洗儀KQ.250B 江蘇省昆山市超聲儀器有限公司;RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠;T6紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;IEC1010-1臺(tái)式冷凍干燥機(jī) 美國Labconco公司;BR4I高速冷凍離心機(jī) 美國熱電公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菊苣根多糖的提取工藝 菊苣根(切成片狀)→烘干(60 ℃干燥至水分含量為5%)→粉碎→過60目篩→除脂→準(zhǔn)確稱取一定量菊苣根粉末→加蒸餾水→加纖維素酶→調(diào)節(jié)pH→酶解→滅酶→超聲波處理→離心取上清液(4500 r/min,10 min)→加5倍體積95%乙醇沉淀→4 ℃冰箱靜置過夜→離心取沉淀(4500 r/min,10 min)→收集沉淀冷凍干燥得菊苣根多糖→加水溶解→苯酚-硫酸法測吸光度[21]。

1.2.2 菊苣根多糖含量的測定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱取10.00 mg葡萄糖(105 ℃干燥至質(zhì)量恒重),置于100 mL容量瓶中定容。精確量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL,分別置于比色管中,按苯酚-硫酸法測定各管吸光度,另取蒸餾水2 mL(按苯酚-硫酸法進(jìn)行顯色反應(yīng)),作為空白對照,于波長 490 nm 處測定吸光度,以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程:y=7.56x+0.175,R2=0.9982。

1.2.2.2 菊苣根多糖得率的測定 取菊苣根多糖供試液1 mL于試管中,以去離子水補(bǔ)加到2 mL,按苯酚-硫酸法進(jìn)行操作,于490 nm處測定吸光度,按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算菊苣根多糖含量。菊苣根多糖得率按以下公式計(jì)算:

式中:C為菊苣根多糖濃度,mg/mL;V為菊苣根多糖溶液體積,mL;N為稀釋倍數(shù);M為菊苣根粉末質(zhì)量,g。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 以蒸餾水為提取溶劑,超聲功率為250 W,依次固定超聲溫度40 ℃、超聲時(shí)間40 min、加酶量2%、酶解時(shí)間1.5 h、液料比40∶1 (mL/g),分別考察不同超聲溫度、超聲時(shí)間、加酶量、酶解時(shí)間和料液比對菊苣根多糖得率的影響,各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 中心組合設(shè)計(jì)方法優(yōu)化提取工藝設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken Design設(shè)計(jì)方法[22],以超聲溫度、超聲時(shí)間、加酶量、酶解時(shí)間和料液比為自變量,以菊苣根多糖得率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),并采用響應(yīng)面分析法來分析各因素之間的交互作用,以確定最佳的工藝條件。實(shí)驗(yàn)因素和水平見表1。

表1 中心組合設(shè)計(jì)的因素與水平設(shè)計(jì)

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Graphpad prism 6對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析,并采用Design-Expert 8.0軟件對響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,考察二次回歸模型及因素的顯著性(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 超聲溫度、超聲時(shí)間、加酶量、酶解時(shí)間和液料比對菊苣根多糖得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic temperature,ultrasonic time,enzyme dosage,enzymolysis time and liquid-to-solid ratio on extraction yield of Chicory roots polysaccharides

由圖1A可知,菊苣根多糖得率隨著超聲溫度的增加而提高,當(dāng)溫度達(dá)到40 ℃時(shí)菊苣根多糖得率達(dá)到最高(37.44%),后隨著超聲溫度的增加菊苣根多糖得率開始下降。原因可能是隨著超聲溫度的升高,水中的小氣泡(空化核)增多,對產(chǎn)生空化作用有利,菊苣根細(xì)胞破裂加速,菊苣根多糖溶出增加,但超聲溫度過高時(shí),氣泡中的蒸氣壓太高,將增強(qiáng)氣泡閉合時(shí)的緩沖作用,導(dǎo)致空化作用減弱,導(dǎo)致菊苣根多糖的得率降低[23];另隨著超聲溫度的升高,纖維素酶的活性增強(qiáng),菊苣根多糖溶出增加,但當(dāng)超聲溫度過高時(shí)會(huì)導(dǎo)致纖維素酶失活,從而影響菊苣根多糖的得率[24]。因此,選擇40 ℃作為本實(shí)驗(yàn)超聲溫度。

由圖1B可知,菊苣根多糖得率隨著超聲時(shí)間的增加而提高,當(dāng)時(shí)間達(dá)到40 min時(shí)菊苣根多糖得率達(dá)到最高(38.29%),后隨著超聲時(shí)間的增加菊苣根多糖得率開始下降。原因可能是超聲波具有的機(jī)械效應(yīng),空化效應(yīng)和熱效應(yīng)使得菊苣根的細(xì)胞瞬間破碎,從而使菊苣根多糖快速溶出,而超聲時(shí)間過長可能會(huì)導(dǎo)致多糖被破壞,影響菊苣根多糖的得率[25]。另外,因超聲時(shí)間過長耗能增加,成本升高,考慮到生產(chǎn)成本,暫定超聲時(shí)間為40 min。

由圖1C可知,菊苣根多糖得率隨著添加的纖維素酶量的增加而不斷提高,當(dāng)加酶量為1.5%時(shí),菊苣根多糖含量為35.89%;當(dāng)加酶量超過1.5%后,隨著加酶量的增加,菊苣根多糖得率的增加趨于平緩。原因可能是由于菊苣根細(xì)胞的細(xì)胞壁含大量纖維素,經(jīng)纖維素酶酶解后導(dǎo)致細(xì)胞壁被破壞,從而使得菊苣根多糖快速溶出,菊苣根多糖得率增加;當(dāng)加酶過多時(shí)由于沒有反應(yīng)底物,從而使得菊苣根多糖得率維持在穩(wěn)定的水平[26]。考慮到增加纖維素酶對菊苣根多糖提取率的提高沒有明顯作用,故選擇纖維素酶的添加量為1.5%。

由圖1D可知,菊苣根多糖得率隨著酶解時(shí)間的增加而不斷提高,當(dāng)酶解時(shí)間為2.0 h時(shí),菊苣根多糖含量達(dá)37.58%;當(dāng)酶解時(shí)間超過2.0 h時(shí),隨著時(shí)間的延長,菊苣根多糖得率趨于平緩甚至略有下降。原因可能是剛開始酶的底物比較充足,隨著時(shí)間的延長,底物不斷減少直至酶解反應(yīng)結(jié)束時(shí),即使酶解時(shí)間繼續(xù)延長，菊苣根多糖得率也不會(huì)繼續(xù)增加,甚至可能由于酶解時(shí)間的延長,其它因素對多糖造成破壞,反而使多糖得率降低,這與玄光善等[26]提取樺褐孔菌多糖的結(jié)果類似,所以最適酶解時(shí)間為2.0 h。

由圖1E可知,菊苣根多糖得率隨著液料比的增加而不斷提高,當(dāng)液料比達(dá)40∶1 (mL/g)時(shí),菊苣根多糖得率達(dá)最大值(35.25%),此后隨著液料比的增加菊苣根多糖得率反而降低。原因可能是液料比越大,即水溶劑用量越大,越有利于水溶性菊苣根多糖的溶出,導(dǎo)致菊苣根多糖得率增加,但當(dāng)液料比達(dá)一定值后,隨著水溶劑用量的增加,會(huì)造成提取液中纖維素酶濃度的降低,也會(huì)造成單位提取液中菊苣根多糖濃度的降低,導(dǎo)致菊苣根多糖提取率的下降,同時(shí)還增加了后續(xù)濃縮工作中的能耗[26]。因此,綜合提取效果和降低成本等方面考慮,選擇液料比為40∶1 (mL/g)左右比較合適。

2.2 中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 菊苣根多糖得率回歸模型的建立與分析 中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析見表2,運(yùn)用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行多元回歸擬合,建立以菊苣根多糖得率與各提取條件之間的響應(yīng)面回歸模型,得二次多項(xiàng)式回歸方程:

Y=43.12+2.22X1-2.80X2+4.21X3-1.66X4-1.06X5-3.60X1X2+0.68X1X3-1.68X1X4+8.95X1X5+1.10X2X3+4.45X2X4+0.65X2X5+1.53X3X4-0.15X3X5-4.50X4X5-7.24X12-4.21X22+1.62X32-4.09X42-6.26X52

表2 中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

為驗(yàn)證回歸方程的有效性,對菊苣根多糖得率的回歸模型進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表3。由表3可知,菊苣根多糖得率的回歸模型具有極顯著性(p<0.0001),且失擬性具有不顯著性(p>0.05),說明該回歸模型比較好。Joglekar等[27]指出復(fù)相關(guān)系數(shù)(R2)大于0.80,且校正復(fù)相關(guān)系數(shù)(AdjR2)和預(yù)測復(fù)相關(guān)系數(shù)(PredR2)較為接近的情況下,表明方程的擬合度較好?；貧w方程中R2=0.9700,說明該模型能夠解釋97.00%響應(yīng)值的變化;AdjR2=0.9460,PredR2=0.9263,二者較為接近,說明該模型具有較好的回歸性。因此,該回歸方程可以很好的對超聲波法協(xié)同酶法提取菊苣根多糖的得率進(jìn)行預(yù)測與分析。從5個(gè)因素對菊苣根多糖得率的影響來看,一次項(xiàng)中X2、X3、X5,二次項(xiàng)中X12、X22、X42、X52,交互項(xiàng)中X1X2、X1X5、X2X4、X4X5對菊苣根多糖得率影響極顯著。由F值可知,各因素對菊苣根多糖得率的影響次序依次為X3>X2>X5>X4>X1。

表3 菊苣根多糖得率回歸模型方差分析表

2.2.2 菊苣根多糖得率響應(yīng)面兩因素具明顯交互作用分析 由圖2A可知,當(dāng)超聲時(shí)間一定時(shí),菊苣根多糖得率隨超聲溫度的升高呈先上升后下降的趨勢;當(dāng)超聲溫度一定時(shí),菊苣根多糖得率隨超聲時(shí)間的延長呈先上升后下降趨勢。由圖2B可知,當(dāng)液料比一定時(shí),菊苣根多糖得率隨超聲溫度的升高呈先上升后下降的趨勢;當(dāng)超聲溫度一定時(shí),菊苣根多糖得率隨液料比的增加也呈先上升后下降的趨勢。由圖2C可知,當(dāng)酶解時(shí)間一定時(shí),菊苣根多糖得率隨超聲時(shí)間的增加呈先上升后下降的趨勢;當(dāng)超聲時(shí)間一定時(shí),菊苣根多糖得率隨酶解時(shí)間的延長而上升。由圖2D可知,當(dāng)液料比一定時(shí),菊苣根多糖得率隨酶解時(shí)間的延長而上升;當(dāng)酶解時(shí)間一定時(shí),菊苣根多糖得率隨液料比的增加呈先上升后下降的趨勢。

2.2.3 菊苣根多糖最佳提取工藝條件的確定和驗(yàn)證 根據(jù)二項(xiàng)回歸模型的預(yù)測,得出菊苣根多糖最佳提取工藝條件為超聲溫度44.24 ℃、超聲時(shí)間35.51 min、加酶量1.58%、酶解時(shí)間1.73 h、液料比43.76∶1(mL/g)?？紤]到實(shí)際操作的便利性,修正菊苣根多糖最佳提取工藝條件為超聲溫度45 ℃、超聲時(shí)間35 min、加酶量1.6%、酶解時(shí)間1.8 h、液料比44∶1 (mL/g),在此條件下,菊苣根多糖的實(shí)際得率為46.75%(3次平行實(shí)驗(yàn)),與預(yù)測得率47.71%接近,表明該模型與實(shí)際情況擬合較好,可以用來預(yù)測實(shí)驗(yàn)結(jié)果,可以作為超聲波協(xié)同酶法提取菊苣根多糖的工藝的回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。

超聲波協(xié)同酶法可以使植物組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞,使得植物組織中的多糖成分快速溶解到提取溶劑中,使得多糖提取率明顯高于傳統(tǒng)提取法,而且對多糖的結(jié)構(gòu)和活性無影響[28]。Ebringerova等[29]研究表明在一定的超聲波條件下不僅不會(huì)造成水溶性活性分子結(jié)構(gòu)的破壞和分子特性的改變,而且還通過免疫細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明超聲波有利于增強(qiáng)提取物的生物活性。本實(shí)驗(yàn)采用超聲波協(xié)同纖維素酶法提取菊苣根中的多糖,得率達(dá)46.75%,與莊紅艷等[30]提出的關(guān)于菊苣中菊苣多糖的含量不低于43.056%相一致,且顯著高于爾西丁·買買提等[15]以及周俊等[31]用傳統(tǒng)方法提取菊苣多糖的得率(分別為3.80 mg/g和7.0745 mg/g),提示菊苣根多糖具有較好的開發(fā)潛力。

3 結(jié)論

采用超聲波協(xié)同酶法提取菊苣根中多糖,根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)和中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)研究獲得菊苣根多糖提取的最佳工藝條件為超聲溫度45 ℃、超聲時(shí)間35 min、加酶量1.6%、酶解時(shí)間1.8 h、液料比44∶1 (mL/g),且在此條件下菊苣根多糖的最終得率為46.75%,證明該回歸模型可以優(yōu)化菊苣根多糖提取工藝的參數(shù),提高多糖得率,節(jié)約成本,具有一定實(shí)際參考價(jià)值。

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Optimization of extraction technology of polysaccharide from roots ofCichoriumintybusL. by ultrasound assisted with enzyme hydrolysis

XU Fang1,2,WU Yu-long2,WANG Qiao-na2,FU Ai-ye1,2,WANG Zhen-jiong2,WANG Ren-lei3,HUA Chun2,*

(1.College of Life Sciences,Nanjing Normal University,Nanjing 210046,China; 2.School of Food Science,Nanjing Xiaozhuang University,Nanjing 211171,China; 3.School of Life Science and Chemistry,Jiangsu Second Normal University,Nanjing 210013,China)

Objective:Optimization of extraction technology of polysaccharide from roots ofCichoriumintybusL. by ultrasound assisted with enzyme hydrolysis. Methods:To establish the effects of ultrasonic temperature,ultrasonic time,enzyme dosage,enzyme solution time and liquid to solid ratio onChicoryroots polysaccharide yield of quadratic regression model by using Box-Behnken design. Results:The optimum extraction conditions of polysaccharide from roots ofCichoriumintybusL. were ultrasonic temperature 45 ℃,ultrasonic time 35 min,enzyme dosage 1.6%,enzymolysis time 1.8 h,liquid-to-solid ratio of 44∶1 (mL/g). Under these conditions,the extraction ofChicoryroots polysaccharide was 46.75%,closed to the predicted yield of 47.71%. Conclusion:The regression model was significant,could be used as thechicoryroots polysaccharide extraction process of regression analysis and parameter optimization.

Chicoryroots;polysaccharide;ultrasound;cellulose;Box-Behnken Design

2016-11-14

許芳(1990-),女,碩士研究生,研究方向：植物生理生化,E-mail:wyl_8080@sina.com。

*通訊作者:華春(1963-),女,本科,教授,研究方向：植物生理生化,E-mail:hc3501988@163.com。

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(2012AA021701);國家自然科學(xué)基金(21376112);江蘇省自然科學(xué)基金(BK20141081);南京市環(huán)境科學(xué)與工程重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(20141123);江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201611460001Z)。

TS201.1

B

1002-0306(2017)09-0168-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.09.024