周 冉,宋玉品，劉玲君，范夢(mèng)姣,劉春雨,張一凡，吳欣蕊

(1.石家莊學(xué)院化工學(xué)院,河北石家莊 050035; 2.河北三元食品有限公司，河北石家莊 050000；3.河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院,天津 300130)

仿生硅化固定化胰蛋白酶用于控制生物粘泥的研究

周 冉1,宋玉品1，劉玲君2，范夢(mèng)姣1,劉春雨1,張一凡1，吳欣蕊3

(1.石家莊學(xué)院化工學(xué)院,河北石家莊 050035; 2.河北三元食品有限公司，河北石家莊 050000；3.河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院,天津 300130)

目的:采用仿生硅化法實(shí)現(xiàn)對(duì)胰蛋白酶的固定,并將固定化酶與聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)相結(jié)合用于抗生物粘泥復(fù)合膜的制備。方法:研究了正硅酸甲酯(TMOS)與酶的濃度比、介孔氧化硅(MPS)與酶的質(zhì)量比、有機(jī)溶劑等因素的影響。并以MPS固定化酶為對(duì)照實(shí)驗(yàn),對(duì)復(fù)合膜酶的穩(wěn)定性、催化活性、重復(fù)使用性、抗蛋白質(zhì)吸附性能等進(jìn)行了分析。結(jié)果:通過仿生硅化法制備的仿生氧化硅-酶-聚甲基丙烯酸甲酯復(fù)合膜(SiO2-Enzyme-PMMA film),與介孔氧化硅-酶-聚甲基丙烯酸甲酯復(fù)合膜(MPS-Enzyme-PMMA film)相比,具有更好的穩(wěn)定性,在25 ℃和50 ℃儲(chǔ)藏30 d后,兩種膜酶活性分別為86.3%和81.2%。SiO2-Enzyme-PMMA film在重復(fù)使用6次之后,復(fù)合膜的酶活剩余89.1%。將復(fù)合膜浸泡在牛血清白蛋白(BSA)溶液中18 d后,其表面蛋白質(zhì)吸附量?jī)H為不含酶PMMA的三分之一。兩種復(fù)合膜均具有良好的抗蛋白吸附性能。結(jié)論:仿生硅化制備固定化酶,與介孔氧化硅載體相比,在提高固定化酶的包埋率和穩(wěn)定性方面有更顯著的優(yōu)勢(shì),其條件溫和,操作簡(jiǎn)便,活性高,應(yīng)用于抗生物粘泥涂層具有更好的防污效果。

胰蛋白酶,仿生硅化,介孔氧化硅,生物粘泥

生物粘泥是由微生物及其產(chǎn)生的胞外聚合物與其它有機(jī)和無機(jī)雜質(zhì)混在一起,粘著在物體表面的粘滯性物質(zhì),主要成分為蛋白質(zhì)及多糖,在循環(huán)冷卻水系統(tǒng)的管道、冷卻塔、船體及水下作業(yè)的設(shè)備壁上廣泛存在。其胞外聚合物的粘性使得它易于附著在設(shè)備表面,附著速度可以達(dá)到每月數(shù)毫米。生物粘泥的附著會(huì)導(dǎo)致設(shè)備嚴(yán)重腐蝕和結(jié)垢、縮短設(shè)備使用壽命,嚴(yán)重的還會(huì)影響生產(chǎn)裝置的正常運(yùn)行,增加生產(chǎn)成本;船舶底部和水下作業(yè)設(shè)備表面形成生物粘泥,影響船舶速度,增加油耗,設(shè)備腐蝕,還可能導(dǎo)致一些重要水下檢測(cè)設(shè)備失靈,在經(jīng)濟(jì)和安全方面造成更嚴(yán)重的危害和損失[1-2]。其產(chǎn)生的危害遠(yuǎn)比設(shè)備腐蝕或結(jié)垢嚴(yán)重[3-6]。因此,對(duì)生物粘泥控制、剝離清洗十分必要。通過合適高效的處理方法,達(dá)到控制生物粘泥生長(zhǎng)的目的,延長(zhǎng)設(shè)備的使用壽命,保障設(shè)備正常運(yùn)行,提高生產(chǎn)效率,是工業(yè)化生產(chǎn)的必然要求和迫切需要解決的問題。有效的控制生物粘泥的生成和積累同時(shí)也是保證海上運(yùn)輸和水下作業(yè)安全進(jìn)行的基本前提[7]。

目前,控制生物粘泥的方法很多,可分為物理法、化學(xué)法和生物酶法[8]。物理法和化學(xué)法去除生物粘泥的效果并不理想。而且化學(xué)藥劑會(huì)造成環(huán)境水體的污染,且大多數(shù)殺菌劑、殺生劑都難以被降解,不符合現(xiàn)在倡導(dǎo)的綠色環(huán)保的要求。而將酶直接溶于水系統(tǒng)中以降解生物粘泥,這種方法使酶易失活且不利于重復(fù)使用。因此針對(duì)生物粘泥的主要成分-蛋白質(zhì),將蛋白酶進(jìn)行固定化并與有機(jī)材料相結(jié)合制備具有催化活性的生物材料,通過分解蛋白質(zhì)來達(dá)到去除生物粘泥的目的,這種生物材料在防污領(lǐng)域具有廣闊的研究前景。

氧化硅是目前常見的無機(jī)納米載體材料,其親水性和多孔結(jié)構(gòu)在為酶分子提供適宜穩(wěn)定的微環(huán)境,保證酶催化活性的同時(shí)也有利于底物的擴(kuò)散,增加其與酶活性位點(diǎn)的接觸,提高酶促反應(yīng)效率。

生物礦化是生物體選擇性地從周圍環(huán)境中吸取元素,在體內(nèi)形成無機(jī)物的過程。在該過程中細(xì)胞分泌的有機(jī)物指導(dǎo)形成具有一定尺寸、形狀、結(jié)構(gòu)和取向的無機(jī)物。仿生礦化主要研究生物體中礦物質(zhì)的形成,在對(duì)該過程了解的基礎(chǔ)上模仿合成具有相似結(jié)構(gòu)和功能的材料。通過特定的有機(jī)模板的調(diào)控指導(dǎo)無機(jī)物在有機(jī)-無機(jī)界面處成核并緩慢增長(zhǎng),最終得到具有一定結(jié)構(gòu)和形狀的復(fù)合材料。由于仿生硅化模擬了生物硅化過程,所以其可以在室溫、中性和常壓條件下進(jìn)行,并且過程容易調(diào)控,操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)條件溫和、酶活保持率高,以仿生硅化制備的固定化酶,在提高固定化酶的包埋率和穩(wěn)定性方面也有顯著的優(yōu)勢(shì)[9-17]。但未見仿生硅化固定化蛋白酶用于抗生物粘泥涂層制備的報(bào)道。

因此,本研究以仿生硅化法固定化胰蛋白酶,并用于構(gòu)建抗生物粘泥涂層,并與傳統(tǒng)介孔氧化硅載體材料(MPS)物理吸附固定酶作對(duì)比,形成抗生物粘泥復(fù)合膜,對(duì)復(fù)合膜的穩(wěn)定性、催化活性、重復(fù)使用性、抗蛋白質(zhì)吸附性能等進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

正硅酸甲酯(TMOS) 天津市化學(xué)試劑研究所;聚二甲基二烯丙基銨[PDADMA(20 wt% in H2O)] Sigma公司;聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA) 日本住友化學(xué)HT50Z;胰蛋白酶、牛血清白蛋白(BSA) 上海鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司;乙醇、異丙醇、丙酮、鹽酸、甲苯、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、三氯乙酸(TCA)、干酪素、考馬斯亮藍(lán)G250 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

XW-80A微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器有限公司;冷凍高速離心機(jī) SIGMA公司;UV1100紫外可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司;Brukervector22傅里葉紅外光譜儀 德國(guó)Bruker公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;電子天平、pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 固定化酶的制備

1.2.1.1 SiO2-Enzyme的制備 用pH7.0的磷酸鹽(PBS)緩沖液配制一定濃度的酶液,向其中依次加入400 μL TMOS前驅(qū)體溶液和1 mL 5 mg/mL的PDADMA溶液,搖勻。25 ℃,200 r/min搖床震蕩15 min,取下后靜置5 min,5000 r/min下離心5 min,棄上清。加入pH7.0的PBS緩沖液洗去未被固定的游離酶。再離心,重復(fù)上述步驟三次。向得到的固定化酶中加入2 mL丙酮溶劑,混合振蕩1 min后離心棄上清,重復(fù)三次,使有機(jī)相完全置換出固定化酶中的水相后,將固定化酶置于通風(fēng)處2 h左右,待有機(jī)溶劑完全揮發(fā)后,即得到干燥的固定化酶[18]。

1.2.1.2 MPS-Enzyme的制備 稱取5 mg胰蛋白酶粉末,用pH7.0的PBS緩沖液溶解完全,加入5 mg MPS粉末,25 ℃,200 r/min下?lián)u床震蕩15 min,8000 r/min離心5 min,棄上清。洗滌方法同SiO2-Enzyme的制備。

1.2.1.3 TMOS與酶的濃度比的影響 保持酶濃度為0.41 mol/L不變,依次按比例加入不同濃度的TMOS,在相同的條件下進(jìn)行吸附固定,檢測(cè)酶活性。

1.2.1.4 MPS與酶的質(zhì)量比的影響 MPS的加入量為2 mg不變,依次按比例加入不同質(zhì)量胰蛋白酶,在相同的條件下進(jìn)行吸附固定,檢測(cè)酶活性,優(yōu)化酶的固定化條件。

1.2.1.5 有機(jī)溶劑種類的影響 用易溶于水的有機(jī)溶劑做洗滌劑洗固定化酶,易揮發(fā)的有機(jī)相可以置換出固定化酶中的水相,然后在自然條件下,待有機(jī)溶劑揮發(fā)完全,即可得到干燥的固定化酶粉。此法較其他干燥方法而言,具有簡(jiǎn)便,低成本的特點(diǎn)。甲苯雖然不能與水互溶,但其作為制膜的主要溶劑,本實(shí)驗(yàn)也研究了其對(duì)酶活性的影響情況。分別取2 mL甲醇、乙醇、丙酮、異丙醇和甲苯加入到用PBS緩沖液洗好的固定化酶中,振蕩1 min,使有機(jī)相和水相充分混合,5000 r/min下離心5 min,棄上清,重復(fù)上述步驟三次以完全除去固定化酶中的水相,將酶置于通風(fēng)處2 h,有機(jī)溶劑揮發(fā)后即可得到干燥的固定化酶粉。檢測(cè)對(duì)比其活性。

1.2.2 酶活測(cè)定方法 在25 ℃下,向固定化酶中加入2 mL 1%的酪蛋白溶液,反應(yīng)5 min,加入2 mL 20%的TCA溶液終止反應(yīng)。8000 r/min離心5 min,過濾上清液,在275 nm紫外光下測(cè)上清液的吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液的光吸收作對(duì)照,根據(jù)活力單位的定義,確定樣品中胰蛋白酶的活性。酶活力單位的定義:25 ℃,pH7.0條件下,單位時(shí)間內(nèi)生成1 μg酪氨酸所需要的酶量為1 U。

1.2.3 抗生物粘泥復(fù)合膜的制備 稱取10 mg胰蛋白酶粉兩份,按上述方法分別制備兩種固定化酶,風(fēng)干后得到干燥的酶粉,研磨均勻。取1 g PMMA顆粒,加入到3 g甲苯中,在80 ℃ 恒溫磁力攪拌水浴鍋中溶解完全,稍冷卻至室溫后加入制備好的SiO2-Enzyme(或MPS-Enzyme),混合均勻,平鋪在玻璃板上,晾干即可。Enzyme-PMMA-film的制備方法同上,即向溶解好的PMMA中加入10 mg胰蛋白酶粉末,混合均勻后平鋪晾干。

1.2.4 抗生物粘泥復(fù)合膜的酶活性檢測(cè) 將復(fù)合膜置于20 mL 1%的酪蛋白溶液中,35 ℃下反應(yīng)30 min,取出膜片向反應(yīng)液中加入5 mL TCA終止反應(yīng),離心過濾上清液,在275 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度值。

1.2.5 抗生物粘泥復(fù)合膜的熱穩(wěn)定性研究 分別將剛制備好的SiO2-Enzyme-PMMA film、MPS-Enzyme-PMMA film和Enzyme-PMMA film置于25 ℃和50 ℃的干燥恒溫環(huán)境中儲(chǔ)藏,每隔3 d取出一次,放入已在35 ℃水浴中預(yù)熱5 min的20 mL酪蛋白溶液中,反應(yīng)30 min后取出膜片,用蒸餾水淋洗干凈晾干,再放回原恒溫環(huán)境中儲(chǔ)藏。向反應(yīng)液中加入5 mL TCA終止反應(yīng),8000 r/min離心取上清液,在275 nm處測(cè)其吸光度值。以第1 d所測(cè)復(fù)合膜的活性為初始活性,觀察加入不同固定化酶和游離酶的復(fù)合膜的活性變化情況。

1.2.6 抗生物粘泥復(fù)合膜的重復(fù)使用性研究 將制備好的SiO2-Enzyme-PMMA film、MPS-Enzyme-PMMA film和Enzyme-PMMA film分別置于35 ℃的恒溫水浴中與20 mL的酪蛋白溶液反應(yīng)30 min。取出復(fù)合膜后向反應(yīng)液中加入5 mL的TCA終止反應(yīng)。將反應(yīng)液在8000 r/min下離心5 min,留上清液待測(cè)。反應(yīng)后的復(fù)合膜輕輕用蒸餾水淋洗,去掉表面殘留反應(yīng)液,晾干后再次置于新鮮的酪蛋白溶液中反應(yīng)30 min,重復(fù)之前步驟,連續(xù)操作六次,將得到的六組待測(cè)液在275 nm的紫外光下測(cè)吸光度值。

1.2.7 抗蛋白質(zhì)吸附實(shí)驗(yàn) 配制10 mg/mL的BSA溶液,將面積為2.5×4 cm2的抗生物粘泥復(fù)合膜完全浸沒其中,4 ℃下冷藏保存。用Bradford法分別測(cè)復(fù)合膜表面的蛋白質(zhì)吸附量,即將復(fù)合膜在蒸餾水中輕蘸3次后,用PBS緩沖液反復(fù)淋洗復(fù)合膜,以洗下膜表面吸附的蛋白質(zhì)。取1 mL待測(cè)液加入到5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液中,反應(yīng)5 min,在595 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度值。

1.2.8 紅外表征 采用傅立葉變換紅外光譜儀(FTIR)分別測(cè)定SiO2-Enzyme、MPS-Enzyme和游離酶的紅外光譜,掃描范圍500～4000 cm-1。將凍干后的待測(cè)物與KBr混合,充分研磨均勻后壓制成薄片,采用透射法進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 TMOS與酶的濃度比

當(dāng)酶液濃度和TMOS濃度比值從0.4∶1變化到1∶1過程中,隨著TMOS濃度的增加,二氧化硅沉淀的生成量和酶的固定量顯著增多,酶活性也逐漸增大。當(dāng)酶液濃度和TMOS濃度比值達(dá)到1∶1時(shí),酶活性也達(dá)到最高值。之后繼續(xù)增加酶液濃度和TMOS濃度比值至1.4∶1,酶活性不再增加且有一定程度的下降。如圖1所示。

圖1 正硅酸甲酯與酶濃度比的影響Fig.1 Effect of the concentration ratio of TMOS and enzyme

固定酶活性達(dá)到最高值之后,繼續(xù)增加TMOS濃度,過量的二氧化硅沉淀會(huì)阻礙酶和底物之間的傳質(zhì)速率,也有可能增厚酶分子的包裹層,阻礙酶和底物的接觸,從而導(dǎo)致酶活性的降低。所以實(shí)驗(yàn)選擇TMOS濃度和酶濃度比值為1∶1,濃度為0.41 mol/L。

2.2 MPS與酶的質(zhì)量比

MPS與酶的質(zhì)量比對(duì)固定化酶活性的影響如圖2所示。結(jié)果表明,當(dāng)MPS與酶的質(zhì)量比從0.25∶1變化到1∶1過程中,隨著酶濃度的增加,MPS對(duì)酶的負(fù)載量也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在MPS與酶的質(zhì)量比達(dá)到1∶1時(shí),固定酶活性最高,繼續(xù)增大酶濃度至2.5∶1,固定化酶活性不再有明顯的變化,說明此時(shí)MPS達(dá)到吸附飽和。所以實(shí)驗(yàn)選擇載體與酶質(zhì)量比為1∶1。

圖2 MPS與酶質(zhì)量比的影響Fig.2 Effect of the mass ratio of MPS and enzyme

2.3 有機(jī)溶劑對(duì)固定化酶活性的影響

有機(jī)溶劑對(duì)固定化酶活性的影響如表1所示。結(jié)果表明,異丙醇、甲醇、甲苯、乙醇都在不同程度上降低了固定酶的活性,只有丙酮有助于酶活性的提高。這是因?yàn)楸趭Z取酶分子中水分的同時(shí),可以通過改變酶分子的空間構(gòu)象,使其處于活化狀態(tài),為酶催化提供更多的活性位點(diǎn),從而很大程度提高固定化酶的活性。

表1 不同有機(jī)溶劑對(duì)固定化酶活性的影響

2.4 固定化酶的紅外表征

本實(shí)驗(yàn)采用傅里葉紅外光譜儀分別測(cè)定SiO2-Enzyme、MPS-Enzyme和載體的紅外光譜。圖3(a)為仿生硅化法制備固定化酶和不含酶的二氧化硅載體的紅外光譜圖,可以看出二氧化硅載體在970 cm-1和1100 cm-1處表現(xiàn)出Si-O-H伸縮振動(dòng)吸收峰和Si-O-Si反對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰。對(duì)于SiO2-Enzyme,除了具有上述兩處特征峰之外,在1587 cm-1處有胺基彎曲振動(dòng)吸收峰,說明胰蛋白酶已經(jīng)被包埋在二氧化硅內(nèi)。圖3(b)為MPS和MPS-Enzyme的紅外光譜圖,對(duì)于MPS,960 cm-1和1100 cm-1為Si-O-H伸縮振動(dòng)吸收峰和Si-O-Si反對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰,而對(duì)于MPS-Enzyme,1590 cm-1處表現(xiàn)出胺基彎曲振動(dòng)吸收峰,同樣說明胰蛋白酶已經(jīng)固定在MPS載體上。

圖3 仿生二氧化硅-酶(a)和介孔二氧化硅-酶(b)的紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectra of SiO2-Enzyme(a) and MPS-Enzyme(b)

2.5 抗生物粘泥復(fù)合膜的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性

本實(shí)驗(yàn)對(duì)復(fù)合膜的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性進(jìn)行了考察。以加入游離酶的PMMA復(fù)合膜作對(duì)照實(shí)驗(yàn),將MPS-Enzyme-PMMA film、SiO2-Enzyme-PMMA film和Enzyme-PMMA film分別放入25 ℃和50 ℃的干燥恒溫環(huán)境中儲(chǔ)藏,每3 d取出一次,測(cè)復(fù)合膜的酶活性。如圖4所示。

圖4 復(fù)合膜的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性Fig.4 The storage stability of films注：a為SiO2-Enzyme-PMMA膜，b為MPS-Enzyme-PMMA膜。

實(shí)驗(yàn)表明,對(duì)胰蛋白酶固定化后制備成抗生物粘泥復(fù)合膜,可以有效的提高復(fù)合膜的催化穩(wěn)定性。例如,加入游離酶的復(fù)合膜在第9 d時(shí),基本已經(jīng)喪失全部活性。SiO2-Enzyme-PMMA film表現(xiàn)出較優(yōu)秀的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性,其在25 ℃和50 ℃下儲(chǔ)藏30 d后的相對(duì)酶活分別為86.3%和81.2%。而MPS-Enzyme-PMMA film在25 ℃下儲(chǔ)藏30 d后,復(fù)合膜活性為初始酶活性的83%左右,50 ℃下儲(chǔ)藏的為76%。相比較而言,SiO2-Enzyme-PMMA film穩(wěn)定性更好,這是因?yàn)榉律杌ò衩缚梢栽诿阜肿颖砻嫘纬梢粚佣趸琛案魺釋印?再加上包埋產(chǎn)生的籠效應(yīng),均能降低了溫度對(duì)酶活性的影響[19]。

2.6 抗生物粘泥復(fù)合膜的重復(fù)使用性

將MPS-Enzyme-PMMA film、SiO2-Enzyme-PMMA film和Enzyme-PMMA film分別連續(xù)六次放入新鮮的酪蛋白底物中,測(cè)其酶活。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(如圖5),經(jīng)過六次的重復(fù)使用后,SiO2-Enzyme-PMMA film的酶活為初始活性的89.1%,而MPS-Enzyme-PMMA film的剩余酶活為86.7%。加入游離酶粉的復(fù)合膜酶活損失嚴(yán)重,在第6次對(duì)其進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí),酶活僅剩30%左右。

圖5 復(fù)合膜的重復(fù)使用性Fig.5 The number of reuses of the films

可見,仿生硅化包埋固定化酶制備的復(fù)合膜穩(wěn)定性略優(yōu)于MPS吸附法制備固定化酶,是由于MPS將酶吸附固定在介孔中,可以在一定程度上對(duì)酶分子結(jié)構(gòu)和催化活性起到保護(hù)作用,但是吸附法固定酶不夠穩(wěn)定。而仿生硅化法將酶分子包埋在氧化硅內(nèi)部,酶分子所處的微環(huán)境具有明顯的籠效應(yīng),更有利于保持分子構(gòu)象使其不易被外界環(huán)境改變[20-21]。

2.7 抗生物粘泥復(fù)合膜的抗蛋白質(zhì)吸附性能

對(duì)復(fù)合膜的抗蛋白質(zhì)吸附性能進(jìn)行研究。由于牛血清白蛋白BSA具有較強(qiáng)的附著性,極易黏著在材料表面,實(shí)驗(yàn)考察了MPS-Enzyme-PMMA film、SiO2-Enzyme-PMMA film和不含酶的PMMA膜在抗BSA吸附方面的性能。將若干面積相等的復(fù)合膜分別浸泡在高濃度的BSA溶液中每3 d取出一片,測(cè)其表面的蛋白質(zhì)吸附量。以三種復(fù)合膜單位面積上蛋白質(zhì)的吸附量為縱坐標(biāo),時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖,得到圖6。

圖6 復(fù)合膜表面牛血清白蛋白吸附量Fig.6 Adsorption capacity of bovine serum albumin on the surface of composite films

由圖6可知,不含酶的PMMA膜在第18 d時(shí),表面蛋白質(zhì)吸附量為3.14 μg/cm2,而同等條件下MPS-Enzyme-PMMA film和SiO2-Enzyme-PMMA film的蛋白吸附量?jī)H為1.11 μg/cm2和1.00 μg/cm2,是不含酶PMMA膜的三分之一?？梢姽潭ɑ傅募尤?有效的降低了膜表面蛋白質(zhì)的附著。而且,SiO2-Enzyme-PMMA film的性能要優(yōu)于MPS-Enzyme-PMMA film。

3 結(jié)論

仿生硅化法制備固定化酶,并制備SiO2-Enzyme-PMMA film,復(fù)合膜有良好的穩(wěn)定性。在25 ℃和50 ℃儲(chǔ)藏30 d后其酶活性分別為86.3%和81.2%。在重復(fù)使用6次之后,復(fù)合膜的酶活剩余89.1%,酶活泄漏不明顯。MPS-Enzyme-PMMA film在25 ℃和50 ℃儲(chǔ)藏30 d后其酶活性分別為82.8%和75.9%,重復(fù)使用6次后酶活剩余86.7%。與SiO2-Enzyme-PMMA相比,穩(wěn)定性欠佳。將復(fù)合膜浸泡在BSA溶液中18 d后其表面蛋白質(zhì)吸附量?jī)H為不含酶PMMA的三分之一。仿生硅化制備固定化酶,與介孔氧化硅載體相比,在提高固定化酶的包埋率和穩(wěn)定性方面有更顯著的優(yōu)勢(shì),其條件溫和,操作簡(jiǎn)便,活性高,應(yīng)用于抗生物粘泥涂層具有更好的防污效果。

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Study on the immobilization of trypsin in biomimetic silica particles for controlling biological slim

ZHOU RAN1,SONG Yu-pin1,LIU Ling-jun2,FAN Meng-jiao1,LIU Chun-yu1,ZHANG Yi-fan1,WU Xin-rui3

(1.School of Chemical Engineering,Shijiazhuang University,Shijiazhuang 050035,China; 2.Hebei San Yuan Food Co.,Ltd.,Shijiazhuang 050000,China; 3.School of Chemical Engineering,Hebei University of Technology,Tianjin 300130,China)

Objective:Trypsin was immobilized on the SiO2by biomimetic silicification process. The catalytic films were prepared by suspending the immobilized trypsin directly into a poly(methyl methacrylate)solution in toluene. Methods:The concentration ratio of TMOS and enzyme,mass ratio of MPS and enzyme and the type of organic solvents were studied. Compared with mesoporous silica(MPS)immobilized enzyme,the storage stability of the composite films,catalytic activity,reusability,and resistant to protein adsorption properties was studied. Results:The results indicated that the SiO2-Enzyme-PMMA film showed the better stability. After 30 days,the residual activity of SiO2-Enzyme-PMMA film and MPS-Enzyme-PMMA film were 86.3% and 81.2% of the initial activity,respectively. The SiO2-Enzyme-PMMA film also showed good operational stabilities in six times of continuous operations. The enzyme residual activity was 89.1%. The surface protein adsorption capacity of SiO2-Enzyme-PMMA film immersed in BSA solution for 18 days was only 1/3 of the PMMA film without enzyme. The two films both had good adsorption properties resistant to protein. Conclusion:Compared with the mesoporous silica carrier,SiO2prepared by biomimetic silicification process had higher stability and embedding rate. The method had the advantages of mild condition,simple operation and high activity,and can be used in the anti fouling coating.

trypsin;biomimetic silicification;MPS;biological slim

2016-10-21

周冉(1981-)，女，博士，講師，主要從事化工材料制備研究工作，E-mail:helly30072004@163.com。

TS201.3

A

1002-0306(2017)09-0150-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.09.020