余曉豐,楊 勇,占 利,梅玲玲,陳國(guó)剛,*

(1.石河子大學(xué)食品學(xué)院,新疆石河子 832000; 2.浙江省疾病預(yù)防與控制中心微生物所,浙江杭州 310051)

食源性致瀉大腸桿菌血清型及毒力基因的研究

余曉豐1,楊 勇2,占 利2,梅玲玲2,陳國(guó)剛1,*

(1.石河子大學(xué)食品學(xué)院,新疆石河子 832000; 2.浙江省疾病預(yù)防與控制中心微生物所,浙江杭州 310051)

了解浙江地區(qū)食源性致瀉大腸桿菌的血清型分布特點(diǎn)及毒力基因攜帶狀況。收集食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)點(diǎn)的致瀉大腸桿菌分離株,采用玻片凝集法對(duì)受試菌株進(jìn)行血清分型,運(yùn)用多重PCR檢測(cè)其攜帶的毒力基因。在69株受試菌株中,優(yōu)勢(shì)血清型包括O148(16株)、O159(11株)、O6(4株)、O15(4株)、O63(4株)和O78(3株),這六種血清型菌株共計(jì)42株,占菌株總數(shù)的60.9%。菌株主要攜帶的毒力基因?yàn)閍stA(42株)、estIb(25株)、pic(15株)、escV(14株)、aggR(14株);最常見的毒力基因組合為astA+estIb(25株)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),攜帶astA、estIb基因的O148和O159的菌株對(duì)食品安全存在較大威脅。浙江地區(qū)食源性致瀉大腸菌的類型以EAEC和ETEC為主,攜帶的主要毒力基因?yàn)閍stA和estIb,優(yōu)勢(shì)血清型為O148和O159。

食源性致瀉大腸桿菌,多重PCR,血清型,毒力基因

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)通常被稱為大腸桿菌,是存在于食物、溫血?jiǎng)游锬c道和環(huán)境中的常見細(xì)菌[1]。大腸菌群數(shù)能夠反映食品是否被污染以及被污染的程度,是評(píng)價(jià)食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)[2]。盡管普通大腸桿菌屬于正常腸道菌群的組成部分,但是獲得特殊毒力因子的大腸桿菌可引起食物中毒,臨床表現(xiàn)為腹瀉和敗血癥,引起腹瀉的這類菌株稱之為致瀉大腸桿菌[3-4]。根據(jù)攜帶毒力基因的不同,致瀉大腸桿菌分為:腸粘附性大腸桿菌(EAEC)腸出血性大腸桿菌(EHEC)、腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)、腸致病性大腸桿菌(EPEC)和腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC)[5]。

近年來,食源性致瀉大腸桿菌引起的食物中毒事件屢見不鮮,尤其是在發(fā)展中國(guó)家[6]。其中,飲用水、面制品和肉制品,是致瀉大腸桿菌引起人類食物中毒的主要媒介[7]。一直以來,對(duì)這類高危食品中致瀉大腸桿菌進(jìn)行監(jiān)測(cè)是預(yù)防食物中毒事件發(fā)生的有效手段[8]。之前關(guān)于食品中致瀉大腸桿菌的研究,關(guān)注點(diǎn)是食品的衛(wèi)生狀況,很少有對(duì)分離株基因型和表現(xiàn)型的研究。本研究收集浙江地區(qū)2014年以來的分離株,運(yùn)用玻片凝集法和多重PCR,首先對(duì)菌株進(jìn)行血清分型,然后并對(duì)其種屬基因(uidA)和毒力基因(pic、bfpB、invE、elt、escV、aggR、stx2、stx1、estIb、astA)進(jìn)行檢測(cè),最后對(duì)其血清型分布特點(diǎn)及毒力基因攜帶狀況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析,為食物中毒事件的防控提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

致瀉大腸桿菌 均由浙江省疾病預(yù)防與控制中心從食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)點(diǎn)收集的樣本中分離;營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司;組織和血液DNA提取試劑盒 德國(guó)Qiagen公司;五種致瀉性大腸埃希氏菌多重PCR檢測(cè)試劑盒 北京卓誠(chéng)惠生生物科技股份有限公司;100 bp DNA Ladder 日本TaKaRa公司;瓊脂糖 上海生工;病原大腸菌免疫血清 日本生研。

PCR擴(kuò)增儀 德國(guó)Eppendorf公司;穩(wěn)壓電泳儀,水平電泳槽,凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA模板提取 實(shí)驗(yàn)菌株接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板37 ℃培養(yǎng)18 h后,按試劑盒說明書操作步驟提取細(xì)菌基因組DNA,并存于-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 毒力基因的測(cè)定多重PCR 采用25 μL的反應(yīng)體系:2×PCR Buffer 12.5 μL、10×Multiplex Assay 2.5 μL、25×PCR Enzyme 1 μL、Nuclease-free Water 7 μL和DNA模板2 μL。擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性4 min;95 ℃變性30 s,62 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,共30個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸5 min[9]。取4 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在含1%瓊脂糖凝膠中以6 V/cm恒壓電泳40 min。用凝膠成像系統(tǒng)拍攝圖片,觀察擴(kuò)增條帶。在含有uidA條帶的基礎(chǔ)上,根據(jù)100 bp DNA Mark和陽性對(duì)照判斷擴(kuò)增條帶大小,進(jìn)而確定毒力基因種類,結(jié)合毒力基因的組合方式最終判定菌株的致瀉類型。

1.2.3 血清分型 實(shí)驗(yàn)菌株接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板37 ℃培養(yǎng)18 h,用無菌棉簽挑取單菌落均勻磨到含3 mL無菌生理鹽水的比色管中,使得菌懸液的終濁度為4;然后置于121 ℃高壓2 h,8000 r/min離心10 min后去上清;最后將米粒大小菌體重懸于含500 μL無菌生理鹽水的離心管中備用。取20 μL免疫血清于潔凈載玻片,將20 μL菌懸液滴在血清上混勻,緩慢搖動(dòng)載玻片30 s后觀察,同時(shí)以無菌生理鹽水作為對(duì)照。在1 min內(nèi),若實(shí)驗(yàn)組明顯凝集現(xiàn)象,對(duì)照組無凝集現(xiàn)象,則為實(shí)驗(yàn)陽性;若兩者均出現(xiàn)明顯凝集現(xiàn)象,則該菌株為自凝型(Orough);若兩者未現(xiàn)明顯凝集現(xiàn)象,則為實(shí)驗(yàn)陰性(ONT)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株類型及毒力基因的分布

圖1 12種代表性菌株的多重PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of 12 isolates that were selected as the representatives of the strains tested注:泳道1～7對(duì)應(yīng)的毒力基因片段分別為astA、aggR、astA+pic、pic+aggR、astA+pic+aggR、escV、elt;泳道8～12對(duì)應(yīng)的毒力基因片段分別為astA+estIb、astA+elt+estIb、escV+stx2、escV+bfpB、astA+escV;泳道13對(duì)應(yīng)參考菌株ATCC25922的種屬基因片段uidA;M為100 bp DNA Ladder Mark。

在69株致瀉大腸桿菌中,42株astA基因陽性;25株estIb基因陽性;15株pic基因陽性;14株escV基因陽性;14株aggR基因陽性;6株elt基因陽性;1株bfpB基因陽性;1株stx2基因陽性;未檢出invE和stx1基因。攜帶stx1基因的致瀉大腸桿菌通常會(huì)導(dǎo)致溫血?jiǎng)游锬c道出血,但是這類菌株在食品樣本中陽性率很低。之前李毅等也報(bào)道在食品樣本未發(fā)現(xiàn)攜帶該毒力基因的菌株,這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[10]。此外,根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出:浙江地區(qū)食源性致瀉大腸菌株主要攜帶的毒力基因是astA;常見的毒力基因組合為astA+estIb,兩者都屬于熱穩(wěn)定腸毒素基因。由于熱穩(wěn)定腸毒素分子量小,無免疫原性,這無疑增加了防控的難度。

根據(jù)毒力基因的組合方式的不同,實(shí)驗(yàn)菌株可分為EAEC 25株(36.2%)、EPEC 11株(15.9%)、ETEC 5株(7.2%)、EHEC 1株(1.4%)、EAEC和ETEC 25株(36.2%)、EAEC和EPEC 2株(2.9%)、未檢出EIEC。多重PCR產(chǎn)物電泳后共得到12種不同的條帶組合如圖1所示;各種毒力基因組合菌株的種類和數(shù)量見表1。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,根據(jù)各類菌株的數(shù)量,可以得出EAEC和ETEC是浙江地區(qū)食品中的致瀉大腸桿菌的主要類型。盡管EAEC的檢出率高于ETEC,但是由于ETEC易引起嬰幼兒和旅行者腹瀉,更常見于報(bào)道。Canizalez等對(duì)墨西哥城市錫那羅亞州的5162份食品樣本進(jìn)行調(diào)查后發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)谽TEC陽性率為1.7%,而張淑紅等對(duì)國(guó)內(nèi)24個(gè)城市559份食品樣本進(jìn)行研究,結(jié)果顯示ETEC的陽性率為6.4%[11-12]。遇曉杰等報(bào)道黑龍江地區(qū)食源性致瀉性大腸埃希氏菌中EAEC、ETEC、EPEC的占比分別為38.8%、37.5%、15.0%[13]。這些數(shù)據(jù)表明,EAEC、ETEC和EPEC是目前威脅我國(guó)食品安全的主要致瀉大腸桿菌類型。

表1 不同類型食源性致瀉大腸桿菌的毒力基因分布

注：“+”表示相應(yīng)的基因檢測(cè)結(jié)果為陽性。

表2 不同類型食源性致瀉大腸桿菌的血清型分布

注：“Orough”表示菌株為自凝型;“ONT”表示血清分型時(shí)菌株無凝集現(xiàn)象。

2.2 血清型分布

在69株致瀉大腸桿菌中,O148有16株、O159有11株、O6有4株、O15有4株、O63有4株、O78有3株、以上6種血清型合計(jì)42株,占總數(shù)的60.9%。11株O159中,81.8%菌株為EAEC和ETEC雜合株中;16株O148中,62.5%的菌株為EAEC,31.3%的菌株為EAEC和ETEC雜合株;血清型的分布特點(diǎn)詳見表2。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,浙江地區(qū)食品中致瀉大腸桿菌的優(yōu)勢(shì)血清型為O148和O159。作為致瀉大腸桿菌的保護(hù)性抗原,O-抗原能激發(fā)宿主產(chǎn)生抗體從而發(fā)揮免疫作用,是疫苗的靶點(diǎn)[14]。由此可以推測(cè),浙江地區(qū)市面上針對(duì)O148和O159菌株的疫苗效果并不明顯,需要作進(jìn)一步評(píng)估。臨床上關(guān)于這兩種血清型陽性分離菌株也有報(bào)道,并證實(shí)這類菌株會(huì)導(dǎo)致感染者腹瀉[15-16]。在日本,這兩種血清型菌株也曾多次引起食物中毒事件的發(fā)生,經(jīng)證實(shí)水龍頭和井水是病原體污染食品的主要途徑[17-18]。眾所周知,郊區(qū)和偏遠(yuǎn)農(nóng)村的生活用水很少經(jīng)過殺菌處理,很多農(nóng)副產(chǎn)品經(jīng)過簡(jiǎn)單清洗處理后直接銷售到城市,一旦被污染,很容易引起集體食物中毒事件,因此,加強(qiáng)這類食品的監(jiān)測(cè)很有必要。此外,在食源性致瀉大腸桿菌的監(jiān)測(cè)中,對(duì)這兩種血清型進(jìn)行針對(duì)性鑒定,可以節(jié)約時(shí)間成本。

2.3 毒力基因與血清型的關(guān)系

結(jié)合多重PCR和血清分型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,16株優(yōu)勢(shì)血清型O148陽性菌株的毒力基因分布如下:astA(6株)、astA+estIb(5株)、astA+pic(2株)、astA+pic+aggR(1株)、pic+aggR(1株)、elt(1株);11株O159陽性菌株的毒力基因分別為:astA+estIb(9株),elt(2株)。

O-抗原多糖由細(xì)菌染色體上的抗原合成基因簇編碼合成,該基因簇易獲取噬菌體或質(zhì)粒上抗原修飾基因;在基因的水平轉(zhuǎn)移過程中,菌株可能同時(shí)獲得某種毒力基因[19]。因此,菌株攜帶的毒力基因和血清表型之間存在一定的關(guān)聯(lián)。本研究發(fā)現(xiàn)某些毒力基因集中出現(xiàn)在幾種血清型中;例如,陽性率較高的astA、estIb基因主要出現(xiàn)在O148和O159菌株中。之前也有研究表明大腸桿菌的攜帶的毒力基因和血清表型之間存在密切的聯(lián)系[20-21]。盡管如此,并不能根據(jù)菌株攜帶的毒力基因直接推測(cè)出該菌株的血清型;例如本研究中,攜帶estIb基因的兩株菌,血清表型可能一致(同為O148或同為O159),也可能不一致(一株為O159,另一株為O148)。由此可知,毒力基因會(huì)集中出現(xiàn)在幾種血清型中,但是不存在嚴(yán)格對(duì)應(yīng)關(guān)系?？赡苁怯捎诳乖嗵怯啥鄠€(gè)基因協(xié)同編碼合成,存在其他未知基因的調(diào)控[22]。

3 結(jié)論

浙江地區(qū)食源性致瀉大腸菌的類型以EAEC和ETEC為主;攜帶的主要毒力基因?yàn)閍stA(60.9%)和estIb(36.2%);優(yōu)勢(shì)血清型為O148(23.2%)和O159(15.9%);未發(fā)現(xiàn)攜帶invE、stx1基因的菌株。盡管毒力基因astA在血清型O148、O159菌株中檢出率高達(dá)87.5%、81.8%,但是兩者不存在嚴(yán)格對(duì)應(yīng)關(guān)系。

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Study on serotypes and virulence genes of foodborne diarrheogenicEscherichiacoli

YU Xiao-feng1,YANG Yong2,ZHAN Li2,Mei Ling-ling2,CHEN Guo-gang1,*

(1.College of Food,Shihezi University,Shihezi 832000,China; 2.Department of Microbiology,Zhejiang Provincial Center for Disease Control and Prevention,Hangzhou 310051,China)

The main purpose of the research is to define serotypes and virulence factors of foodborne diarrheogenicEscherichiacoliin Zhejiang Province. The distribution characteristics of serotypes and virulence factors of strains collected from food surveillance were detected by serotyping and multiple polymerase chain reaction(PCR).Of all 69 strains,the most frequent identified serotypes were O148(16),O159(11),O6(4),O15(4),O63(4)and O78(3),the total number of these serotypes was 42,which accounted for 60.9% of the strains. And 42,25,15,14,14 strains were positive forastA,estIb,pic,escV,aggRgene,respectively. Among these,25 strains harbored bothastAandestIbgenes,representing the common type. Furthermore,O148 and O159 strains harboringastAandestIbgenes posed a potential threat to food safety. Results showed that EAEC and ETEC harboringastAandestIbgenes were the dominant bacteria types,mainly belonging to serotype O148 and O159,among foodborne diarrheogenicEscherichiacoliin Zhejiang Province.

foodborne diarrheogenicEscherichiacoli;multiplex polymerase chain reaction;serotypes;virulence genes

2016-11-14

余曉豐(1990-)，男，碩士，研究方向：食源性致病微生物，E-mail：yuxiaofeng@foxmail.com。

*通訊作者:陳國(guó)剛(1977-)，男，博士，教授，研究方向：食品微生物及果蔬貯藏，E-mail：cgg611@163.com。

國(guó)家自然基金(31560468)；中國(guó)博士后科學(xué)基金(2015M570525)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)09-0124-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.09.015