李艷玲,樊魯玉,侯衍英,劉 超,王玉婷,史仁玖,常正堯,田 園,張顯忠,郝崗平

(1.泰山醫(yī)學院生命科學學院,山東泰安 271016; 2.內(nèi)蒙古大學生命科學學院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010021)

丹參內(nèi)生真菌產(chǎn)生淀粉酶菌株的篩選鑒定及酶學性質(zhì)分析

李艷玲1,樊魯玉2,侯衍英1,劉 超1,王玉婷1,史仁玖1,常正堯1,田 園1,張顯忠1,郝崗平1

(1.泰山醫(yī)學院生命科學學院,山東泰安 271016; 2.內(nèi)蒙古大學生命科學學院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010021)

目的:從丹參內(nèi)生真菌中篩選耐熱性強的酸性生淀粉酶菌株,并對其酶學性質(zhì)進行初步研究。方法:以50株丹參內(nèi)生真菌作為篩選對象,通過淀粉固體培養(yǎng)基初篩、液體發(fā)酵復篩,篩選產(chǎn)生淀粉酶活力較高的菌株;通過形態(tài)學觀察和ITS序列分析對產(chǎn)酶菌株進行鑒定。結(jié)果:從50株丹參內(nèi)生真菌中,篩選出5株產(chǎn)生淀粉酶活力較高的菌株,其中菌株ZDH2-2-1-1為產(chǎn)淀粉酶活性最強的菌株,酶活力達到117.63 U/mL,經(jīng)鑒定為互隔鏈格孢(Alternariaalternata)。該淀粉酶最適pH為4.0,最適反應溫度為55 ℃,具有較好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性,對生淀粉具有廣譜的降解能力。通過薄層層析發(fā)現(xiàn),ZDH2-2-1-1所產(chǎn)淀粉酶的酶解產(chǎn)物為葡萄糖。結(jié)論:丹參內(nèi)生真菌能產(chǎn)生高活性的耐熱性酸性生淀粉酶,在生淀粉深加工中具有極大的開發(fā)潛力。

丹參,內(nèi)生真菌,生淀粉酶,降解能力

生淀粉酶(Raw starch-degrading enzyme,RSDE)是指對不經(jīng)過蒸煮糊化的生淀粉顆粒能夠表現(xiàn)出強水解活性的一類酶,包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、脫枝酶等[1]。生淀粉酶可以將傳統(tǒng)淀粉制糖工藝的淀粉糊化、液化、糖化合并為一步直接進行糖化,它比傳統(tǒng)高溫蒸煮糖化節(jié)約25%～30%的能量[2-3]。近年來,隨著淀粉質(zhì)原料深加工工業(yè)的發(fā)展,工藝條件的改變,生淀粉酶這種節(jié)能和工藝簡化的特點在醫(yī)藥、釀造、食品、造紙、紡織等領域應用中具有潛在的應用價值。目前已報道的真菌生淀粉酶適用溫度范圍為30～50 ℃,但為了與淀粉糖化條件相適應,需將溫度至少升至60 ℃[4]。此外,淀粉水解過程中的pH通常在5.0左右,而淀粉加水形成的乳濁液的pH一般為5.5～6.5范圍,采用酸性α-淀粉酶可減少普通α-淀粉酶使用時先將物料pH上調(diào)至6.0再下調(diào)至4.5所需的酸堿量,既節(jié)約了成本,也減少了產(chǎn)品提純時去鹽的壓力[3-4]。因此,尋找具有一定耐熱性能的酸性生淀粉酶,可提高我國淀粉原料的利用率,對淀粉資源的加工產(chǎn)業(yè)具有重要的意義。

目前報道的能產(chǎn)生淀粉酶的真菌主要是從土壤中分離篩選的黑曲霉[5-6]、根霉[2]和青霉[3,7],有關植物內(nèi)生真菌報道較少。植物內(nèi)生真菌(Plant endophytic fungi)是生長在健康植物內(nèi)部,與宿主植物互惠共生的一類真菌,能產(chǎn)生豐富的纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、木聚糖酶和蛋白酶等胞外酶[8]。因此,本研究從前期分離的丹參內(nèi)生真菌[9]中篩選耐熱性強的酸性生淀粉酶高產(chǎn)菌株,并對其酶學性質(zhì)進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

50株丹參內(nèi)生真菌菌株 由泰山醫(yī)學院中藥生物技術省級重點實驗室保存并提供。

PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,蒸餾水1000 mL,自然pH;初篩培養(yǎng)基:可溶性淀粉30.0 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,KCl 0.5 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,NaNO32.0 g,K2HPO4·3H2O 1.0 g,蒸餾水1000 mL,自然pH;復篩培養(yǎng)基:可溶性淀粉10 g,酵母提取物0.4 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,KCl 0.5 g,NaNO32.0 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,KH2PO4·3H2O 0.5 g,蒸餾水1000 mL,pH5.0。馬鈴薯、葡萄糖、酵母提取物、可溶性淀粉、瓊脂等試劑均為國產(chǎn)分析純。

YX280A手提式數(shù)字高壓滅菌鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司;UV-3600紫外分光光度計、FA2004N電子天平 日本津島公司;A236414電熱鼓風干燥箱 上海艾測電子科技有限公司;QYC-211搖床 上海三申醫(yī)療器械有限公司;SW-CJ-2F型超凈工作臺術 江蘇奧華儀器廠;GNP-9050型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 湖南凱達科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 丹參內(nèi)生真菌的菌種活化 將實驗室放在冰箱保存的50株丹參內(nèi)生真菌接種到PDA固體平板上活化,28 ℃恒溫培養(yǎng)5～7 d,備用。

1.2.2 丹參內(nèi)生真菌產(chǎn)酸性α-淀粉酶菌株的初篩 將活化的50株丹參內(nèi)生真菌接種到固體初篩培養(yǎng)基中,28 ℃恒溫培養(yǎng)5～7 d,觀察是否長出透明圈。

1.2.3 產(chǎn)酸性α-淀粉酶菌株的復篩及粗酶液制備 用直徑為0.5 cm打孔器打取均勻大小的菌塊接種于100 mL液體復篩培養(yǎng)基中,28 ℃ 150 r/min搖床培養(yǎng)7 d。每株內(nèi)生真菌做3個重復。

將各菌株發(fā)酵液分裝到50 mL離心管中,5000 r/min離心10 min。將上清液收集在無菌離心管中,即為粗酶液。4 ℃保存?zhèn)溆?。將離心后獲得的菌絲用濾紙吸干水分,包在已稱重的濾紙中放入烘箱,60 ℃烘干直至重量前后變化不大于0.004 g。采用干重法測定各菌株的重量。

1.2.4 酸性α-淀粉酶活力的測定 取10 mL的底物溶液放入一個試管,50 ℃水浴保溫10 min后加入粗酶液1 mL,混勻,精確保溫10 min,吸取0.5 mL混合液,加入盛有10 mL、0.1 mol/L的HCl的試管中,然后再取該混合液0.5 mL,加入盛有10 mL的碘液試管中搖勻,用紫外分光光度計于660 nm測定吸光值。對照組用同樣的方法測定,只是將粗酶液事先于沸水中煮10 min后再加入,以蒸餾水作為比色的參比[10-11]。

酶活力定義:在上述條件下,反應10 min使1%淀粉溶液顯藍強度減低1%所需酶量為1個酶活力單位(U)。

酶活=(D0-D)×100/D0×稀釋倍數(shù)

式(1)

式(1)中，D0為空白值吸光度,D為主值吸光度,100為系數(shù)(%)。

1.2.5 丹參內(nèi)生真菌產(chǎn)酸性α-淀粉酶菌株的鑒定 根據(jù)培養(yǎng)特征和孢子形態(tài)對丹參內(nèi)生真菌產(chǎn)酸性α-淀粉酶菌株進行形態(tài)鑒定。采用改良SDS法[9]提取丹參內(nèi)生真菌基因組DNA,參照已報道的方法對擴增ITS序列[9]。核酸測序由上海鉑尚生物科技有限公司完成。測序后經(jīng)Blast在線比對分析,并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 酸性α-淀粉酶酶學性質(zhì)的研究

1.2.6.1 最適作用溫度 為了確定酶的最適反應溫度,將酶與底物在pH4.5的條件下分別在30～70 ℃不同溫度下測定α-淀粉酶活力。在相對穩(wěn)定的pH4.5的條件下再將此反應液在35,40,45,50,55,60,65,70,75 ℃反應1 h后測定酶活力。以某一溫度下的最高淀粉酶活性定為100%,后者與之相比計算相對酶活力,確定酶的穩(wěn)定性。

1.2.6.2 最適作用pH 為了確定酶的最適反應pH,用不同pH的0.1 mol/L的磷酸-檸檬酸緩沖液配制淀粉底物溶液,在50 ℃的條件下測定不同pH時淀粉酶活力。將反應液在50 ℃不同pH條件下再反應1 h后測定酶活力。以某一pH下的最高淀粉酶活性定為100%,后者與之相比計算相對酶活力,確定酶的穩(wěn)定性。

1.2.6.3 對不同生淀粉底物的降解 底物分別為1%的玉米淀粉顆粒懸浮液、馬鈴薯淀粉懸浮液、紅薯淀粉懸浮液、小麥淀粉懸浮液和糯米淀粉懸浮液。用pH4.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制。1.5 mL離心管中分別加入1 mL底物、0.1 mL酶液,在50 ℃恒溫振蕩下(150 r/min)反應1 h后,再加入2 mol/L NaOH溶液0.05 mL終止反應,反應液5000 r/min離心5 mim,取上清液。于660 nm測定還原糖的量(以葡萄糖計)。生淀粉酶活力定義:在上述條件下,每分鐘水解生淀粉產(chǎn)生1 μg葡萄糖的酶量為1個酶活力單位(U)[4]。

酶的糊化淀粉酶活力測定方法與生淀粉酶活力測定方法相同,作用底物為糊化的玉米淀粉底物。將pH4.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制的1%玉米淀粉顆粒懸浮液在沸水浴中加熱使其淀粉顆粒完全溶解,此溶液為1%糊化淀粉溶液[3,12]。比較酸性生淀粉酶對不同淀粉底物的降解能力強弱以及其糊化玉米淀粉后酶活力與降解各生淀粉的最適酶活力的比值。

1.2.6.4 淀粉酶酶解產(chǎn)物的薄層層析(TLC)分析 取一定量的粗酶液,以商品α-淀粉酶酶解產(chǎn)物為參照,用毛細吸管進行點樣。展開劑為正丁醇∶吡啶∶水=6∶4∶1,將樣品置層析缸內(nèi)在室溫下展開,待展開劑前沿走至距板上端1 cm處取出自然晾干,噴顯色劑(20%硫酸-甲醇溶液),于85 ℃烘箱中干燥10 min左右,直到薄板上顯示出清晰的斑點[12]。將薄層層析圖譜與葡萄糖展開圖對比進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酸性α-淀粉酶丹參內(nèi)生真菌的篩選

根據(jù)初篩培養(yǎng)基平板上有無透明圈及其透明圈是否明顯、透明圈直徑的大小,共從50株丹參內(nèi)生真菌中篩選出20株對淀粉具有較強水解作用的菌株,見表1。再通過搖瓶復篩,獲得α-淀粉酶酶活力較高的10株菌,見表2。其中5株菌株(圖1)淀粉酶酶活力較高(p<0.05),分別是ZDH-2-2-1-1為117.63 U/mL,JGLY1-1為102.38 U/mL,JGLJ1-2-1為94.35 U/mL,BDG2-1-1為88.64 U/mL,BDF-15為84.54 U/mL。

圖1 丹參內(nèi)生真菌在淀粉初篩培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)Fig.1 Endophytic fungi from Salvia miltiorrhiza Bge.grow in the starch medium

表1 酸性α-淀粉酶產(chǎn)生菌的初篩結(jié)果

注：其中“+”表示透明圈明顯程度,“+”越多表示越透明。

表2 酸性α-淀粉酶產(chǎn)生菌的復篩結(jié)果

2.2 產(chǎn)酸性α-淀粉酶丹參內(nèi)生真菌的鑒定

將上述產(chǎn)淀粉酶活性高的五株菌ZDH-2-2-1-1、JGLY1-1、JGLJ1-2-1、BDG2-1-1和BDF-15通過形態(tài)學和分子方法進行鑒定。ZDH2-2-1-1和JGLJ1-2-1在PDA培養(yǎng)基上的菌落表面呈黑色絨狀、背面灰色至黑色,生長迅速。光學顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)其分生孢子梗單生或成簇,分生孢子倒棒狀,有壁磚狀分隔,成鏈狀排列,初步將這兩株菌鑒定為鏈格孢屬(Alternariasp.)。JGLY1-1、BDG2-1-1和BDF-15為不產(chǎn)孢真菌,可進一步進行分子鑒定。

圖2 根據(jù)丹參內(nèi)生真菌rDNA-ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic trees of endophytic fungi from based on rDNA-ITS sequence analysis

利用通用引物ITS1和ITS4,經(jīng)PCR擴增五株丹參內(nèi)生真菌的ITS序列,提交至GenBank獲得Accession number,并在Gen Bank數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對,選擇同源性高于97%的菌株進行系統(tǒng)發(fā)育分析?；卩徑臃?Neighbor joining,NJ)構(gòu)建其系統(tǒng)進化樹(圖2),結(jié)果發(fā)現(xiàn),JGLY1-1與Trameteshirsuta聚在同一分支中,它們ITS序列的相似性達到99%;BDF-15與Psathyrellacandolleana以99%的相似性聚在一起。BDG2-1-1與Schizophyllumcommune高度聚類(自展值為99%)。JGLJ1-2-1與Alternariaalternata,ZDH2-2-1-1與Alternariasp.被分在同一個分支中。因此,將丹參內(nèi)生真菌ZDH-2-2-1-1、JGLY1-1、JGLJ1-2-1、BDG2-1-1和BDF-15鑒定為互隔鏈格孢(Alternariaalternata)、粗毛栓菌(Trameteshirsuta)、鏈格孢屬(Alternariasp.)、裂褶菌(Schizophyllumcommune)和白黃小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)。目前我國產(chǎn)酸性α-淀粉酶的真菌主要是根霉、曲霉和青霉[2-3,5-7],本研究所分離的內(nèi)生真菌可擴大淀粉酶生產(chǎn)菌種的來源。

2.3 酸性α-淀粉酶酶學性質(zhì)研究

2.3.1 酶的最適溫度及其熱穩(wěn)定性結(jié)果 分別在35～70 ℃測定α-淀粉酶活力。由圖3可知,ZDH-2-2-1-1的最適溫度為55 ℃,JGLY1-1為45 ℃,JGLJ1-2-1為40 ℃,BDG2-1-1為50 ℃,BDF-15為50 ℃,其中ZDH-2-2-1-1在60～70 ℃之間其活力可達最高活力的60%以上,而JGLY1-1、JGLJ1-2-1、BDG2-1-1和BDF-15高于50 ℃后酶活力急劇下降。由圖4可知,在反應液保溫1 h后,菌株ZDH-2-2-1-1在60 ℃以內(nèi)的范圍具有較好的穩(wěn)定性,55 ℃保溫1 h后,殘余酶活仍達到86.2%(p<0.05),而在60 ℃以上時熱穩(wěn)定性較差,70 ℃保溫1 h酶活僅剩不足50%,而其它菌株熱穩(wěn)定性較差。

圖3 溫度對5株丹參內(nèi)生真菌淀粉酶活性的影響Fig.3 Effect of temperature on amylase activity

圖4 溫度對5株丹參內(nèi)生真菌淀粉酶穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of temperature on the stability amylase activity

目前國內(nèi)外有關耐熱生淀粉酶的報道較少,從國內(nèi)外報道的耐熱生淀粉酶看,最適溫度一般在50～60 ℃[4]。本研究中ZDH-2-2-1-1最適溫度都50 ℃以上,具有潛在的工業(yè)應用價值。

2.3.2 酶的最適pH及其pH穩(wěn)定性結(jié)果 用不同pH的0.1 mol/L的磷酸-檸檬酸緩沖液配制淀粉底物溶液,pH范圍為3.5～7.0,測定不同pH時α-淀粉酶活力,結(jié)果如圖5?？梢钥闯?ZDH-2-2-1-1為4.0,JGLY1-1和BDF-15的最適pH為4.5,JGLJ1-2-1和BDG2-1-1為5.0。這5株菌株的最適pH都在酸性范圍內(nèi),為酸性α-淀粉酶。在反應液保溫1 h后,菌株ZDH-2-2-1-1在pH3.0～5.0的范圍具有較好的穩(wěn)定性,pH4.0保溫1 h后,殘余酶活仍達到87.9%,其它4株菌的pH穩(wěn)定性較差(p<0.05)(圖6)。

圖5 pH對5株丹參內(nèi)生真菌淀粉酶活性的影響Fig.5 Effect of pH on amylase activity

圖6 pH對5株丹參內(nèi)生真菌淀粉酶穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of pH on the stability amylase activity

2.3.3 酶對不同生淀粉底物降解及其穩(wěn)定性結(jié)果 在1.5 mL離心管中分別加入5株丹參內(nèi)生真菌的粗酶液0.1 mL和已配制的1%玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、紅薯淀粉、小麥淀粉和糯米淀粉顆粒懸浮液以及糊化后的玉米淀粉懸浮液。測定淀粉酶對不同生淀粉及其糊化玉米淀粉的降解能力。由表3可知,ZDH-2-2-1-1對各種生淀粉降解的強弱順序為:糯米淀粉>馬鈴薯淀粉>紅薯粉>小麥淀粉>玉米淀粉;JGLY1-1為糯米淀粉>小麥淀粉>玉米淀粉>紅薯淀粉>馬鈴薯淀粉;JGLJ1-2-1為紅薯淀粉>糯米淀粉>小麥淀粉>馬鈴薯淀粉>玉米淀粉;BDG2-1-1為糯米淀粉>馬鈴薯淀粉>玉米淀粉>紅薯淀粉>小麥淀粉;BDF-15為玉米淀粉>馬鈴薯淀粉>糯米淀粉>小麥淀粉>紅薯淀粉。這5株菌株降解糊化玉米淀粉與降解最適底物溶液的酶活力比值分別為:ZDH-2-2-1-1為1.11,JGLY1-1為1.21,JGLJ1-2-1為1.19,BDG2-1-1為1.18,BDF-15為1.14。上述結(jié)果表明,ZDH-2-2-1-1、JGLY1-1及BDG2-1-1菌株的最適降解底物為糯米淀粉,JGLJ1-2-1為紅薯淀粉,BDF-15為玉米淀粉,其中ZDH-2-2-1-1底物最為豐富且其酶學特性最為符合現(xiàn)代工業(yè)要求,在工業(yè)淀粉深加工有極大的開發(fā)潛力。

表3 酶對不同底物的水解情況

注：(Ratio指的是糊化玉米淀粉為底物淀粉酶活力與降解最適生淀粉的酶活力的比值。

2.3.4 淀粉酶酶解產(chǎn)物的薄層層析分析 取一定量ZDH-2-2-1-1淀粉酶粗酶液,按照酶活力測定的方法進行酶解反應,以薄層層析法鑒定酶解產(chǎn)物。由圖7可知,ZDH-2-2-1-1的淀粉酶和商品α-淀粉酶一樣,其酶解產(chǎn)物中有葡萄糖,說明此菌產(chǎn)生的淀粉酶能將可溶性淀粉降解成葡萄糖,即粗酶液中含有淀粉糖化酶組分。

圖7 丹參內(nèi)生真菌ZDH-2-2-1-1的淀粉酶酶解液TLC分析結(jié)果Fig.7 TLC of hydrolysis products by endophytic fungus ZDH-2-2-1-1 strains注:1:ZDH-2-2-1-1淀粉酶酶解產(chǎn)物,2:商品α-淀粉酶酶解產(chǎn)物,3:1%的葡萄糖標準品。

3 結(jié)論

本研究從丹參內(nèi)生真菌篩選出5株耐熱性強的酸性生淀粉酶菌株ZDH-2-2-1-1、JGLY1-1、JGLJ1-2-1、BDG2-1-1和BDF-15,經(jīng)形態(tài)學觀察和ITS序列分析,將其鑒定為互隔鏈格孢、粗毛栓菌、鏈格孢屬、裂褶菌和白黃小脆柄菇。在對其耐熱性及耐酸性測定時發(fā)現(xiàn),ZDH-2-2-1-1的最適溫度為55 ℃,JGLY1-1為45 ℃,JGLJ1-2-1為40 ℃,BDG2-1-1為50 ℃,BDF-15為50 ℃,其中,ZDH-2-2-1-1在60～70 ℃之間仍有酶活力,且最適pH為4.0,為耐熱性酸性淀粉酶。通過對不同生淀粉底物的降解發(fā)現(xiàn)ZDH-2-2-1-1、JGLY1-1及BDG2-1-1菌株的最適降解底物為糯米淀粉,JGLJ1-2-1為紅薯淀粉,BDF-15為玉米淀粉,其中ZDH-2-2-1-1具有廣譜的生淀粉降解能力且其酶學特性最為符合現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)要求,在工業(yè)淀粉深加工領域具有很大的應用前景,經(jīng)淀粉酶酶解產(chǎn)物的薄層層析分析確定為α-淀粉酶。

由于本研究中的野生菌株產(chǎn)酶量和時間等因素的限制,未涉及到淀粉酶的分離純化、分子量的測定及基因序列分析等工作,在今后的研究中應對其分子量及其基因序列進行分析,進而可通過誘變育種和基因工程育種等方法提高產(chǎn)酶量,來滿足現(xiàn)代淀粉深加工工業(yè)生產(chǎn)的需求。

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Screening,identification of endophytic fungus produing raw starch-degrading enzyme fromSalviamiltiorrhizaBge. and its enzymatic properties

LI Yan-ling1,FAN Lu-yu2,HOU Yan-ying1,LIU Chao1,WANG Yu-ting1, SHI Ren-jiu1,CHANG Zheng-yao1,TIAN Yuan1,ZHANG Xian-zhong1,HAO Gang-ping1

(1.College of Life Sciences,Taishan Medical University,Tai’an 271016,China; 2.School of Life Sciences,Inner Mongolia University,Huhhot 010021,China)

Objective:Acid amylase producing endophytic fungus was screened fromSalviamiltiorrhizaBge. And its enzymatic properties were studied. Method:Amylase producing strains with high activity were screened by starch solid medium and fermentation medium,and identified by morphological observation and ITS sequence analysis. Results:5 strains with higher amylase activity were screened from 50 endophytic fungi. Among them,the strain ZDH2-2-1-1 produced the highest activity of amylase,and the enzyme activity reached 117.63 U/mL,which was identified asAlternariaalternata. The enzyme properties showed that the optimal reaction pH of amylase from the strain ZDH2-2-1-1 was 4.0,the optimal reaction temperature was 55 ℃,and the strain ZDH2-2-1-1 had good thermal stability,pH stability and a wide spectrum degradation ability of raw starch. By thin layer chromatography,the results showed that the enzymatic hydrolysis product of amylase produced by ZDH-2-2-1-1 was glucose. Conclusion:Endophytic fungi fromSalviamiltiorrhizaBge. can produce heat-resistant acid amylase,which has great development potential in the deep processing of raw starch.

SalviamiltiorrhizaBge.;endophytic fungi;raw starch-degrading enzyme;degradation ability

2016-10-19

李艷玲(1977-)，女，博士，副教授，主要從事藥用植物內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物研究，E-mail:lingl816@163.com。

國家自然科學基金(81403036)；山東省自然科學基金(ZR2014HM048)；山東省重點研發(fā)計劃(2016GSF202002)；山東省教育廳課題(J15LM56)；泰山醫(yī)學院高層次課題培育計劃(2015GCC15)；泰安市科技發(fā)展計劃(2015NS1121,2016NS1218)；山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計劃項目(2015-246)；國家大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃(201510439063,201610439258，201610439259,201610439263)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)09-0108-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.09.012